巨噬細胞分泌轉化生長因子 β對百草枯中毒致肺纖維化的影響

孫陽陽，王 倩，孫明堯，王小寧，劉鳳英，王 帥，楊維杰，王道輝，張敏敏，駱 媛，王永安

（1.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒物學國家重點實驗室，北京 100850；2.中國人民解放軍96604部隊醫院藥劑科，甘肅 蘭州 730030）

百草枯（paraquat，PQ）是一種廣泛應用的速殺型除草劑，對人畜具有高毒性。肺是PQ中毒的主要靶器官，中毒早期可引起肺泡炎、肺水腫、肺出血等癥狀，度過急性期后往往發展為肺纖維化。組織受損時，巨噬細胞一方面產生活性氧及其他毒性介質影響正常代謝，誘導細胞凋亡，加重組織損傷；另一方面又會產生胰島素樣生長因子1、血管內皮生長因子α和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，參與調節上皮細胞和內皮細胞增殖及成纖維細胞活化［1-3］。TGF-β通過誘導細胞分化、遷移、侵襲或增生性改變，在特發性肺纖維化發病中起主導作用［4］。研究表明，TGF-β通過激活Smad2/3、絲裂原活化蛋白激酶等信號通路誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，并使α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達增加，分泌大量Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白及纖連蛋白等細胞外基質，肺泡正常結構被破壞，影響氣體交換，最終導致呼吸衰竭而死亡［5-6］。PQ中毒患者和動物肺組織中出現大量巨噬細胞聚集［7］，提示其可能在PQ所致肺纖維化過程中發揮重要作用。本研究利用Tran?swell技術建立人胚肺成纖維細胞與巨噬細胞共培養體系，并使用PQ染毒構建肺纖維化細胞模型，以探討巨噬細胞參與PQ所致肺纖維化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人胚肺成纖維細胞MRC-5和人急性單核細胞白血病細胞THP-1，中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心。MEM培養基、RPMI 1640培養基和胎牛血清，美國賽默飛公司；佛波酯（phor?bol 12-myristate-13-acetate，PMA），美國Sigma公司；Trizol，美國Invitrogen公司；Prime ScriptR RT試劑盒、gDNA及 SYBR Premix Ex TaqTM，日本TaKaRa公司；兔抗人TGF-β、α-SMA、Smad2、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phos?phate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（一抗），英國Abcam公司；兔抗人纖連蛋白單克隆抗體（一抗），美國Immunoway公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（二抗），北京中杉金橋生物技術有限公司；Alexa FluorTM 488標記鬼筆環肽和Hoechst33342，美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒，日本同仁公司；TGF-β抑制劑GW788388，美國Selleck公司。CFX-96實時熒光定量PCR儀、MyCycler梯度PCR儀、垂直板電泳槽、PowerPac?HC穩壓穩流電泳儀及Trans-Blot SD半干電轉儀，美國 Bio-Rad 公司；24 mm Transwell，美國康寧公司；引物購自中國北京擎科生物科技有限公司；TGF-β引物序列為：正向，GCTGCTGTGGC?TACTGGTG；反向，CATAGATTTCGTTGTGGGTTTC；GAPDH：正向，AACGGATTTGGTCGTATTG，反向，GCTCCTGGAAGATGGTGAT。

1.2 巨噬細胞的誘導分化

將對數生長期的THP-1細胞離心，棄上清，用含有PMA 320 nmol·L-1的RPMI 1640培養基重懸，按1.0×109L-1細胞接種至T25培養瓶中培養24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。若細胞由懸浮生長轉變為貼壁成簇生長，并伸出偽足，則表示THP-1細胞分化為巨噬細胞［8］。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率

取1.2誘導分化的對數生長期的巨噬細胞消化、離心、重懸，計數后以1×109L-1接種于96孔板，每孔 100 μL。37℃，5%CO2條件下培養 24 h。待細胞貼壁生長密度為80%時吸棄培養基，染毒組分別加入含PQ 20，40，60，80，100，120，140，160和180 μmol·L-1（終濃度）的完全培養基〔RPMI 1640和MEM培養基（V∶V=1∶1），含10%FBS〕100 μL，細胞對照組加入100 μL不含PQ的完全培養基，同時設空白組（不含細胞），每組設6復孔。培養48 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，繼續培養3 h，用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度（A450nm）值。實驗重復3次。細胞存活率（%）=（實驗組A450nm-空白組A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白對照組A450nm）×100%。

1.4 巨噬細胞與MRC-5細胞共培養體系及肺纖維化細胞模型的建立

用孔徑0.4 μm的6孔Transwell小室構建巨噬細胞與MRC-5細胞交互作用的共培養體系。MRC-5和1.2誘導分化的巨噬細胞用胰酶消化、離心、棄上清，用完全培養基重懸后，MRC-5細胞以1×108L-1接種于Transwell下室，每孔 2.6 mL；巨噬細胞以1×109L-1接種于Transwell上室，每孔1.5 mL；培養24 h后為共培養體系。PQ染毒組更換為含PQ（終濃度為75，100和125 μmol·L-1）的完全培養基，細胞對照組更換為完全培養基，GW788388干預組更換為含PQ（終濃度100μmol·L-1）和GW788388（終濃度10 μmol·L-1）的完全培養基，置37℃培養箱繼續培養48 h。

1.5 Western印跡法檢測巨噬細胞TGF- β和MRC-5細胞 α-SMA、Smad2 、MMP-9和纖連蛋白表達

收集1.4分組處理的上、下室細胞，分別加入100 μL細胞裂解液。充分裂解后，4℃，12 000×g離心5 min取上清，用BCA法測定總蛋白濃度，并用上樣緩沖液和裂解液對各組蛋白定量并煮沸變性；用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉膜，5%脫脂牛奶室溫振蕩2～3 h進行封閉。取出PVDF膜，分別加入抗 α-SMA、Smad2、MMP-9、TGF-β、纖連蛋白和GAPDH單克隆抗體（1∶1000）溶液，4℃孵育過夜，TBST常溫振蕩漂洗5 min，漂洗5次；加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（1∶2000）溶液，室溫孵育1 h，用TBST常溫振蕩5 min，漂洗5次。ECL化學發光成像后，用Quanti?tyOne圖像分析軟件對蛋白條帶積分吸光度（inte?grated abosorbance，IA）值進行半定量分析，目的蛋白相對表達水平以目的蛋白條帶與內參蛋白條帶IA比值表示。

1.6 實時熒光定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）檢測MRC-5細胞和巨噬細胞TGF- β mRNA表達

取1.4分組處理的上、下室細胞，棄上、下室培養上清，并用預冷的PBS清洗1次。各小室加入0.5 mL Trizon反復吹打后移至1.5 mL EP管中，室溫靜置5 min后加入0.25 mL三氯甲烷，振蕩15 s；靜置3 min后12 000×g，4℃離心15 min；取上清加入0.25 mL異丙醇，混勻后靜置10 min，12 000×g，4℃離心10 min；棄上清后加入75%乙醇12 000×g，4℃離心6 min；棄上清后室溫干燥5 min；加入20 μL無RNA酶H2O溶解并檢測mRNA濃度。按說明書將mRNA逆轉錄成cDNA，于96孔板中進行PCR擴增。TGF-β mRNA表達檢測采用SYBRgreen熒光標記法，擴增過程采取兩步法：95℃5 min預變性；（95℃10 s→60℃ 30 s）共 40個循環反應；95℃，15 s；59.5℃，60 s；95℃ 15 s進行溶解曲線分析。目的基因相對表達水平用2-ΔCt表示。

1.7 免疫熒光染色法檢測MRC-5細胞纖維狀肌動蛋白（F-actin）的表達

取1.4處理的下室MRC-5細胞，棄上清，用預冷的PBS迅速漂洗下室3次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次；加0.1% Triton X-100透化細胞膜20 min；PBS漂洗3次；再用5%牛血清白蛋白封閉1 h，吸棄液體；滴加稀釋的鬼筆環肽染液（0.25 mg·L-1），室溫孵育45 min，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加Hoechst33342避光孵育5 min，進行核染；用PBS漂洗4次（每次5 min）洗去剩余的Hoechst33342，熒光顯微鏡下觀察MRC-5細胞綠色熒光的變化，拍照并記錄。采用imagepro-Plus 6.0圖像分析軟件對各組圖像進行分析，計算各組細胞熒光強度。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 PMA誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞的鑒定

經PMA誘導24 h后，倒置顯微鏡下觀察發現，THP-1細胞由懸浮生長（圖1A）轉變為貼壁成簇生長，并伸出偽足（圖1B），表示細胞分化為巨噬細胞，可用于以下實驗。

Fig.1 Macrophages differentiated from THP-1 cells induced by phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）for 24 h.THP-1 cells were treated with PMA 320 nmol·L-1for 24 h before cell morphology was identified by microscope.A：spherical THP-1 cells growing in suspension；B：macro?phages growing adherently and extending pseudopods after PMA induction.The white arrows indicate pseudopodia.

2.2 PQ降低巨噬細胞存活率

CCK-8結果（圖2）顯示，與細胞對照組相比，PQ 20 ～180 μmol·L-1作用于巨噬細胞48 h后，細胞存活率顯著降低（P＜0.01），半數抑制濃度（IC50）為 57.13 μmol·L-1。

Fig.2 Effect of parquat（PQ）on cell viability of macro?phages by CCK-8 assay.Macrophages were treated with PQ 20，40，60，80，100，120，140，160 and 180 μmol·L-1for 48 h before the cell vibility was detected by CCK-8 assay.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

2.3 PQ和TGF- β受體抑制劑GW788388對共培養體系MRC-5細胞纖維化相關蛋白表達的影響

圖3結果顯示，與細胞對照組相比，PQ染毒后MRC-5細胞α-SMA和纖連蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；與PQ染毒組相比，TGF-β受體抑制劑GW788388處理后，α-SMA和纖連蛋白表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。

Fig.3 Effect of PQ and GW788388 on protein expres?sion of α -smooth muscle actin( α -SMA)and fibronectin in MRC-5 cells detected by Western blotting.The co-cul?ture systerm was treated with PQ 100 μmol·L-1or PQ 100 μmol·L-1 withGW788388 10 μmol·L-1for 48 h.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PQ group.

2.4 PQ對共培養體系中MRC-5細胞纖維狀肌動蛋白表達的影響

圖4結果顯示，PQ染毒巨噬細胞和MRC-5細胞共培養體系48 h后，用熒光標記的鬼筆環肽染色MRC-5細胞。與細胞對照組相比，PQ染毒組MRC-5細胞中熒光強度增強（P＜0.01）；與PQ染毒組相比，GW788388處理后MRC-5細胞熒光強度降低（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of PQ and GW788388 on expression of F-actin in MRC-5 cells detected by immunofluores?cence assay.See Fig.3 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PQ group.

2.5 PQ對巨噬細胞TGF- β mRNA和蛋白表達的影響

圖5結果顯示，巨噬細胞暴露于PQ 75，100和 125 μmol·L-148 h，與細胞對照組相比，PQ 100 μmol·L-1組TGF-β mRNA表達顯著增加（P＜0.01）。Western印跡結果（圖6）亦表明，與細胞對照組相比，PQ 100和125 μmol·L-1組 TGF-β 蛋白表達顯著增加（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of PQ on transforming growth factor- β（TGF- β）mRNA expression in macrophages detected by qRT-PCR.The co-culture systerm was treated with PQ for 48 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01 ，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

Fig.6 Effect of PQ on TGF- β protein expression in macrophages detected by Western bloting.See Fig.5 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

圖7結果顯示，細胞對照組巨噬細胞TGF-β mRNA表達顯著高于MRC-5細胞；PQ染毒48 h后2種細胞TGF-β mRNA表達均顯著升高（P＜0.01）。

Fig.7 Effect of PQ on TGF- β mRNA expression in macrophages and MRC-5 cells detected by qRT-PCR.The co-culture systerm was treated with PQ 100 μmol· L-1for 48 h.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with MRC-5 cell control group；##P＜0.01，compared with macrophages control group.

2.6 PQ和GW788388對MRC-5細胞TGF- β/Smads通路相關蛋白表達影響

圖8結果顯示，與細胞對照組相比，PQ染毒后MRC-5細胞Smad2和MMP-9蛋白表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與PQ染毒組相比，GW788388處理后，Smad2和MMP-9蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

Fig.8 Effect of PQ and GW788388 on protein expres?sion of matrixmetalloprotein-9(MMP-9)and Smad2 in MRC-5 cells detected by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding cell control group；#P＜0.05，compared with corresponding PQ group.

3 討論

PQ是一種高毒速殺型除草劑，每年因誤服或自服PQ導致的中毒事件屢有發生。PQ中毒易致肺纖維，但其機制尚未明確。既往關于PQ中毒致肺纖維化的研究多局限于肺上皮細胞的損傷及損傷后細胞因子對成纖維細胞的調控［10-11］，對巨噬細胞在此過程的作用尚未闡明。本研究基于Tran?swell技術建立PQ誘導肺纖維化細胞模型，探討巨噬細胞參與PQ中毒致肺纖維化的作用機制。

PQ中毒所致肺纖維化是一種涉及多種細胞類型和細胞通路的復雜病理過程，在此過程中巨噬細胞可以通過多種細胞因子調控肺成纖維細胞激活并分泌細胞外基質。有鑒于此，基于單一類型細胞構建的體外模型不能很好地反映整個疾病的發生發展過程，基于此類模型研究疾病的發生機制也具有一定的局限性。因此，構建巨噬細胞與肺成纖維細胞共培養體系，研究細胞間通訊在肺成纖維化機制中的作用，對于闡明PQ中毒所致肺纖維化機制非常重要。本研究利用Transwell小室將巨噬細胞和肺成纖維細胞分開培養，2種細胞通過分泌于培養基中的細胞因子和代謝產物等完成細胞間的交流。這種無需接觸既可實現細胞間交互作用的系統，既避免了細胞接觸所介導的生長抑制效應，又可實現細胞分泌的細胞因子和細胞外基質對2種細胞的通訊作用。

在多種特發性肺纖維化體外、體內模型中均發現，TGF-β是誘導成纖維細胞分泌細胞外基質的主要細胞因子之一。以往多項研究表明，巨噬細胞是肺纖維化發展過程中TGF-β的主要來源［12-13］。此外，在正常肺實質組織中，TGF-β只分布于肺內的巨噬細胞。本研究RT-PCR結果也表明，TGF-β在共培養體系中呈現出表達的空間特異性，即在巨噬細胞中的表達量約為MRC-5細胞的21倍。在PQ染毒共培養體系48 h后，TGF-β在2種細胞中的表達均顯著增加，但仍以巨噬細胞表達為主，其表達量約為MRC-5細胞的7倍。為此認為，在本研究所建立的模型中，巨噬細胞通過旁分泌TGF-β刺激肺成纖維細胞活化而發揮促進肺纖維化的作用。

本研究所構建的共培養體系中，暴露PQ 48 h，巨噬細胞TGF-β表達顯著增加，并通過上調TGF-β/Smads通路相關蛋白Smad2誘導MRC-5細胞分化為肌成纖維細胞。此外，MRC-5細胞纖維化標志物纖連蛋白、α-SMA和纖維狀肌動蛋白表達顯著增高，表明巨噬細胞和MRC-5細胞共培養體系暴露于PQ，肺纖維化細胞模型構建成功。同時用TGF-β受體抑制劑GW788388處理，可顯著降低TGF-β/Smads通路相關蛋白及纖維化相關蛋白表達，進一步提示PQ可能直接刺激巨噬細胞高表達TGF-β，TGF-β通過激動TGF-β/Smads通路而活化成纖維細胞，活化后的成纖維細胞分泌大量細胞外基質導致肺纖維化。以往報道，PQ通過氧化應激反應損傷肺泡上皮細胞，損傷后的肺上皮細胞表達TGF-β及其他細胞因子，繼而活化成纖維細胞引起肺纖維化［14］。本研究結果發現，PQ可促進巨噬細胞分泌TGF-β而參與PQ中毒致肺纖維化的發生。

綜上所述，本研究表明，PQ可誘導巨噬細胞分泌TGF-β，刺激肺成纖維細胞活化，活化后的成纖維細胞分泌大量細胞外基質；TGF-β受體抑制劑GW788388可拮抗肺成纖維細胞的活化，并減少TGF-β下游蛋白和纖維化相關蛋白的表達。由此推測，巨噬細胞可通過旁分泌TGF-β激活肺成纖維細胞TGF-β/Smads通路而促進肺纖維化。本研究可為PQ中毒致肺纖維化機制及PQ中毒治療新靶點的發現提供科學依據。