雙氫青蒿素通過(guò)抑制蛋白激酶B和NF- κB P65磷酸化減輕缺血再灌注導(dǎo)致的小鼠心肌損傷

崔勤濤，王學(xué)惠，劉永強(qiáng)，劉曉晨，段長(zhǎng)恩

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1.心血管外科，2.心血管內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453100）

心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）是指長(zhǎng)時(shí)間的心肌缺血導(dǎo)致心功能、心肌代謝、心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，而心肌恢復(fù)正常灌注后，心肌損傷沒(méi)有減輕反加重的過(guò)程，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致心律失常而發(fā)生猝死［1-3］。I/R損傷多發(fā)于心、腦、肝、肺和腎等器官，心肌I/R損傷時(shí)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可導(dǎo)致心肌組織損傷嚴(yán)重。因此，降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可緩解I/R后引起的心肌損傷［4］。目前，針對(duì)I/R損傷的治療方法主要有中醫(yī)治療、中西醫(yī)結(jié)合治療和基因治療［5-6］。雙氫青蒿素（dihydroartemis?inin，DHA）是青蒿素的衍生物，具有活性高、水溶性強(qiáng)等特點(diǎn)，常被用于治療瘧疾、腫瘤和炎癥等疾病［7］。研究表明，DHA可通過(guò)抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等在腫瘤和免疫性疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用［8-10］。本研究通過(guò)制備小鼠心肌I/R模型，觀察DHA對(duì)I/R小鼠心肌氧化應(yīng)激和損傷的影響，并探索其作用機(jī)制，為DHA在心肌I/R損傷中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

DHA（純度≥98%），成都格利普生物科技有限公司；肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蘇木精-伊紅（HE）和末端標(biāo)記法（TUNEL）染色試劑盒，美國(guó)Sigma公司；兔抗小鼠Bax、Bcl-2、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、NF-κB P65單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶（horse?radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，美國(guó)Pierce公司。研磨儀和載玻片（KZ-Ⅱ，G6004），武漢賽維爾生物科技有限公司；病理切片機(jī)（RM2016），上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(jī)（KD-P），浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀（RT-6100）、脫色搖床（TSY-B）和電泳儀（Mini-PROTEAN3），美國(guó)伯樂(lè)公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（D3024R），大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600R），上海天能科技有限公司；光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E100），日本尼康公司。

1.2 動(dòng)物、模型制備和分組

50只6～8周齡雄性BALB/c小鼠，體重25～30 g〔北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0011，使用許可證號(hào)SYXK（滬）2017-0014〕。飼養(yǎng)環(huán)境，室溫20～25℃，室內(nèi)濕度50%～60%，白天和黑夜交替進(jìn)行，獨(dú)自攝食、飲水。50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為假手術(shù)組、I/R模型組、I/R+DHA 12.5，25.0和50.0 mg·kg-1組。采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法制備心肌I/R小鼠模型，ip給予1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。氣管插管后，在小鼠胸骨第3和4肋間做手術(shù)切口，暴露心臟，在顯微鏡下確定冠狀動(dòng)脈左前降支部位后，采用帶線縫合針于左心耳下緣1 cm處穿線結(jié)扎。假手術(shù)組不結(jié)扎加壓，I/R+DHA組參照文獻(xiàn)［11］在結(jié)扎前20 min分別ig給予DHA 12.5，25.0和50.0 mg·kg-1。假手術(shù)組和模型組同時(shí)ig給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥7 d，每天1次。7 d后檢測(cè)心率（heart rate，HR）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）和左室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV）水平。檢測(cè)完畢后，處死小鼠，收集心肌和外周血用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。部分心肌組織用液氮保存防止RNA降解，剩余組織用4%多聚甲醛固定。頸動(dòng)脈血經(jīng)4℃，1408×g離心15 min后收集上層血清，并于4℃冰箱中保存。

1.3 用試劑盒檢測(cè)心肌組織SOD活性和MDA含量

取1.2分組處理的各組小鼠心肌組織，組織勻漿后，4℃，1408×g離心10 min取上清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)SOD活性和MDA含量。

1.4 ELISA檢測(cè)血清中Mb，cTnI和CK-MB含量

取1.2分組收集的血清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)Mb，cTnI和CK-MB含量。

1.5 HE染色檢測(cè)心肌組織病理變化

取1.2分組處理的小鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟、水化后，進(jìn)行HE染色；光鏡下拍照并觀察記錄組織病理變化。

1.6 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡

取1.2分組處理的小鼠心肌組織，按TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TUNEL染色；凋亡細(xì)胞即陽(yáng)性細(xì)胞在光鏡下呈棕黃色或棕褐色，非凋亡細(xì)胞即陰性細(xì)胞呈藍(lán)色。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞核/總細(xì)胞核×100%）。

1.7 Western印跡法檢測(cè)心肌組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)及Akt和NF- κB P65磷酸化水平

取1.2分組處理的各組小鼠心肌組織研磨均勻，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取組織總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定心肌組織蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)模、脫脂奶粉封閉，加兔抗小鼠Bax（1∶200），Bcl-2（1∶200），Akt（1∶500）和NF-κB P65（1∶500）單克隆抗體（一抗），4℃孵育搖床過(guò)夜。回收一抗，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔（IgG）抗體（二抗）（1∶10000），室溫孵育120 min。采用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法于暗室下曝光顯影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件分析吸光度值。以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶積分吸光度比值表示Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平，p-Akt/Akt和 p-NF-κB P65/NF-κB P65 比值表示磷酸化水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雙氫青蒿素對(duì)心肌I/R損傷小鼠心功能的影響

如表1所示，與假手術(shù)組比較，I/R模型組小鼠HR和LVEF顯著降低（P＜0.01），LVESV顯著升高（P＜0.01）。與I/R模型組比較，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1組小鼠HR，LVEF和LVESV均無(wú)明顯差異；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1組小鼠HR和LVEF均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），LVESV顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of dihydroartemisinin（DHA） on heart rate（HR），left ventricular ejection fractions（LVEF）and left ventricular end-systolic volume（LVESV）of mice with myocardial ischemia/reperfusion（I/R）injury

2.2 雙氫青蒿素對(duì)心肌I/R損傷小鼠心肌細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的影響

如表2所示，與假手術(shù)組比較，I/R模型組小鼠心肌細(xì)胞中SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與I/R模型組比較，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1組小鼠心肌細(xì)胞中SOD和MDA含量無(wú)明顯差異；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1組小鼠心肌細(xì)胞中SOD含量顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

Tab.2 Effect of DHA on superoxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content of mice with myocardial I/R injury

2.3 雙氫青蒿素對(duì)心肌I/R小鼠血清Mb，cTnI和CK-MB含量的影響

如表3所示，與假手術(shù)組比較，I/R模型組小鼠血清cTnI，Mb和CK-MB含量均顯著增高（P＜0.01）。與I/R模型組比較，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1組小鼠血清cTnI，Mb和CK-MB含量均無(wú)明顯差異，I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1組其含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.3 Effect of DHA on cardiac troponin I（cTnI），myo ?globin（Mb）and creatine kinase isoenzymes（CK-MB）content of mice with myocardial I/R injury

2.4 雙氫青蒿素對(duì)心肌I/R小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，假手術(shù)組小鼠心肌組織形態(tài)正常，無(wú)炎性浸潤(rùn)。與假手術(shù)組比較，I/R模型組小鼠心肌組織形態(tài)紊亂，炎性浸潤(rùn)嚴(yán)重。與I/R模型組比較，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1組小鼠心肌組織形態(tài)紊亂，炎性浸潤(rùn)嚴(yán)重，可見大量斷裂的心肌纖維；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1組小鼠心肌組織形態(tài)趨于正常，未見炎性浸潤(rùn)，少見斷裂的心肌纖維。

2.5 雙氫青蒿素對(duì)心肌I/R小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

如圖2A所示，假手術(shù)組小鼠心肌組織形態(tài)正常，未見凋亡細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，I/R模型組小鼠心肌組織形態(tài)紊亂，可見大量凋亡細(xì)胞（深棕色或褐色）。與I/R模型組比較，I/R+DHA12.5 mg·kg-1組小鼠心肌組織形態(tài)紊亂，可見大量凋亡細(xì)胞；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1組心肌組織形態(tài)趨于正常，僅見極少凋亡細(xì)胞。I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1組細(xì)胞凋亡率為（34±6）%和（21±4）%，較I/R模型組（78±9）%顯著降低（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of DHA on cardiomyocyte apoptosis of mice with myocardial I/R injury.See Tab.1 for the mouse treat?ment.Arrows show apoptotic cells.

2.6 雙氫青蒿素對(duì)心肌I/R小鼠心肌組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)及Akt和NF- κB P65磷酸化水平的影響

如圖3所示，與假手術(shù)組比較，I/R模型組小鼠心肌組織中Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Akt和NF-κB P65磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）。與I/R模型組比較，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1組小鼠心肌組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)及Akt和NF-κB P65磷酸化水平均無(wú)明顯差異，I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1組Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Akt和NF-κB P65磷酸化水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of DHA on protein expressions of Bax and Bcl-2，phosphorylation level of Akt and NF- κB P65 in myocardial tissue of mice with myocardial I/R injury by Western blotting.B was the semi-quantitative result of A；D and E was the semi-quantitative result of C，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，P＜0.01，compared with I/R model group.

3 討論

HR和LVEF是評(píng)測(cè)心肌功能的重要指標(biāo)。在一定范圍內(nèi)，HR越小說(shuō)明心肌功能越差，反之越好。而LVEF則反映心肌衰竭程度及心肌收縮能力，LVEF與LVESV呈負(fù)相關(guān)性，LVEF水平越高說(shuō)明心肌收縮能力越強(qiáng)［12-13］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DHA處理后，心肌I/R模型小鼠心功能明顯好轉(zhuǎn)，且HR和LVEF水平明顯升高，LVESV水平明顯降低。同時(shí)，DHA治療后，I/R模型小鼠心肌組織病理?yè)p傷明顯改善。提示DHA可改善心肌I/R小鼠心肌功能。

本研究結(jié)果顯示，DHA可降低心肌I/R模型小鼠心肌組織中SOD活性，升高M(jìn)DA含量。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌功能損傷的主要原因，心肌I/R發(fā)生時(shí)，心肌缺血得到暫時(shí)的緩解，心肌I/R前由于缺血促使有氧代謝旺盛并產(chǎn)生大量氧自由基，誘發(fā)機(jī)體生成氧化應(yīng)激中間產(chǎn)物MDA和ROS等，加重心肌損傷。SOD是抗氧化金屬酶，在氧化應(yīng)激與抗氧化平衡中扮演至關(guān)重要的角色。研究報(bào)道，DHA通過(guò)抑制SOD活性、提高M(jìn)DA含量調(diào)節(jié)心肌I/R大鼠氧化應(yīng)激水平［14］。結(jié)合本研究結(jié)果提示，DHA通過(guò)抑制心肌I/R小鼠氧化應(yīng)激緩解心肌功能損傷。

本研究結(jié)果顯示，DHA可減少心肌I/R小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低Bax/Bcl-2蛋白比值。Zhao等［15］發(fā)現(xiàn)，心肌長(zhǎng)時(shí)間缺血或I/R均可誘發(fā)心肌組織細(xì)胞凋亡和壞死，而Bcl-2家族在這一過(guò)程中起主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果與該報(bào)道相符，提示DHA通過(guò)抑制凋亡蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)緩解心肌I/R誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡和壞死，減輕心肌I/R損傷。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DHA可顯著降低心肌I/R模型小鼠心肌組織p-Akt和p-NF-κB P65蛋白表達(dá)。研究報(bào)道，DHA通過(guò)調(diào)節(jié)Akt和NF-κB表達(dá)在多種疾病中發(fā)揮作用，如DHA通過(guò)抑制PI3K/Akt和NF-κB表達(dá)預(yù)防小鼠結(jié)腸炎［16］，通過(guò)降低Akt磷酸化及Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬抑制食管癌的遷移［17］，通過(guò)減輕PI3K/Akt通路蛋白水平調(diào)節(jié)纖維細(xì)胞增殖和分化緩解腎纖維化［18］。同時(shí)，戴文琴等［19］研究發(fā)現(xiàn)，心肌I/R后NF-κB被激活，導(dǎo)致下游炎癥因子大量釋放，增加心肌損傷程度。也有文獻(xiàn)報(bào)道，Akt和NF-κB磷酸化是加重心肌I/R損傷的重要原因［20-21］。結(jié)合上述研究報(bào)道提示，DHA通過(guò)下調(diào)Akt/NF-κB通路蛋白表達(dá)改善心肌I/R模型小鼠心肌損傷，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，DHA改善心肌I/R小鼠心功能和心肌病理?yè)p傷，緩解心肌組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Akt和NF-κB P65磷酸化有關(guān)。