分化抑制因子1和3通過Wnt/ β聯蛋白和Shh通路共同調節結直腸癌細胞的干性

黃傳鐘＊，孫艷霞＊，于 悅，陳 韡，陳淑萍，林萬松，葉韻斌1，，3

（1.福建醫科大學附屬腫瘤醫院，福建省腫瘤醫院，腫瘤免疫學研究室，福建 福州 350014；2.福建醫科大學基礎醫學院，福建 福州 350100；3.福建省腫瘤轉化醫學重點實驗室，福建 福州 350014）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范 圍內常見的消化系統惡性腫瘤，在我國的發病率和死亡率呈上升趨勢［1］。越來越多的證據表明，CRC干細胞可能在CRC的進展和轉移過程中發揮了至關重要的作用。高度的自我更新能力和上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的腫瘤干細胞可產生化療抵抗和癌癥轉移，從而導致預后不良［2］。從臨床角度講，確定維持細胞干性的分子調控機制從而建立有效的CRC靶向治療策略是非常必要的。分化抑制因子（inhibitors of differ?entiation，Id）屬于螺旋-環-螺旋轉錄因子（helixloop-helix，HLH）家族中的一員，其中 Id1（又名DNA結合抑制因子1）在多種腫瘤組織呈高表達，如前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、卵巢癌［5］、胃癌［6］、食管癌［7］和結直腸癌［8］等，并與癌癥的侵襲轉移和不良預后具有相關性［9-13］。而Id1已被證實在胚胎干細胞、內皮細胞以及神經干細胞樣細胞中具有維持其自我更新的功能［14-15］，同時Id3和Id1具有高度的序列相似性，故在許多組織中具有廣泛重疊的生物學功能，它們的功能常被認為是相互促進的［16］。我們前期研究發現，Id3在CRC干細胞特性的維持過程中也同樣具有重要作用［17］。最近，O′Brien 等［18］發現，Id1和Id3可通過限制P21驅動的細胞周期來共同調節CRC干細胞的自我更新，但相關信號轉導機制尚未完全闡明。本研究通過單敲減和雙敲減HCT116的Id1和Id3基因的表達，探索Id3是否協同Id1調控CRC干性及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

CRC細胞HCT116（上海細胞庫）。RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；d1短發夾RNA質粒（short hairpin RNAId1，shRNA-Id1）、shRNA-Id3和陰性對照質粒慢病毒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；嘌呤霉素（Merck公司，美國）；Trizol裂解液（Invitrogen公司，美國）；RNA逆轉錄試劑盒（Promega公司，美國）；Id1、Id3和β肌動蛋白引物（北京梓熙生物科技有限公司）；熒光定量檢測試劑盒和化學發光試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；AnnexinⅤ/PI檢測試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白標準品和基質膠（Bio-Rad公司，美國）；NC膜（Amersham公司，美國）；Wnt通路抑制劑FH535、Sonic Hedgehog（Shh）通路抑制劑HPI-1（Abcam公司，美國）；兔抗人β聯蛋白單抗、兔抗人八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcrip?tion factor 4，Oct4）單抗、兔抗人zeste同源物增強子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）多抗、兔抗人鈣黏蛋白轉錄抑制因子（snail）多抗、兔抗人Shh單抗、兔抗人融合抑制劑（suppressor of fused，SUFU）多抗、兔抗人周期蛋白D1單抗、兔抗人凋亡抑制因子單抗、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH）單抗、兔抗人CD24單抗、兔抗人CD133單抗和兔抗人CD44單抗（均Cell Signaling Technology公司，美國）；小鼠抗人Id1多抗和小鼠抗人Id3多抗（Santa Cruz公司，美國）；小鼠抗人富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5（leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）多抗、兔抗人CD166、兔抗人細胞性骨髓細胞瘤病癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-myc）多抗、兔抗人膠質瘤相關癌基因同源蛋白2（glioma-associated oncogene homologue 2，GLI2）多抗和兔抗人Hedgehog受體（PTCH2）單抗（Abcam公司，美國）；兔抗人CD133單克隆熒光抗體、兔抗人CD24單克隆流式抗體及其同型抗體對照（Miltenyi公司，德國）。生物安全柜（哈爾濱市東聯電子有限公司），純水系統（Millipore公司，美國），二氧化碳培養箱（Heraeus公司，德國），熒光定量PCR儀（Roche公司，美國），活細胞工作站（Leica公司，美國），垂直電泳槽、CLD-RAD550型酶標儀（Bio-RAD公司，美國），普通離心機（白洋離心機廠），流式細胞儀（BD公司，美國），凝膠成像分析儀（Panasonic公司，日本），實時無標記細胞分析儀RTCA（ACEA Biosciences公司，美國）。RTCA是基于電阻抗傳感器原理的細胞檢測，能夠實時檢測細胞的生長、增殖、毒性、粘附及形態變化等動態生物學反應過程；儀器底部整合有微金電子傳感器芯片，當細胞貼壁生長時，可引起電極界面阻抗的改變，該阻抗值的變化直接反映細胞的生物學狀態，因此RTCA可在細胞生理狀態下，實時、連續、定量跟蹤細胞形態和增殖分化的改變。

1.2 細胞培養和敲減細胞株構建

HCT116細胞采用含10% FBS的1640培養液培養，傳代后分別加陰性對照質粒（質粒對照組，簡稱對照組）、Id1敲減質粒（sh-Id1組）、Id3敲減質粒（sh-Id3組）及Id1和Id3雙敲減質粒（sh-Id1Id3組），作用12 h后，更換培養液，繼續培養48 h后更換為含嘌呤霉素1.5 mg·L-1培養液篩選細胞，每3 d更換1次新鮮的嘌呤霉素抗性培養基。篩選3周后，通過熒光顯微鏡下觀察綠熒光強度確定感染效率。

1.3 實時熒光定量PCR檢測腸癌細胞中Id1和Id3 mRNA表達

取1.2構建和分組處理的細胞接種于細胞培養皿，長至融合度約80%時用Trizol液裂解細胞，提取總RNA。用逆轉錄試劑盒HiScript Q-RT Super?Mix，以1 μg RNA為模板合成cDNA。Id1引物：上游為5′-CGTGCTGCTCTACGACATGA-3′，下游為 5′-GCTCCAACTGAAGGTCCCTG-3′；Id3 引物：上游為5′-AGCCAGGTGGAAATCCTAC-3′，下游為5′-AAGCTCCTTTTGTCGTTGG-3′；內參β肌動蛋白引物：上游為5′-TGGCACCA?CACCTTCTACA-3′，下游為5′-AGCACAGCCT?GGATAGCA-3′。設定反應條件進行實時熒光定量PCR反應，按儀器的實驗操作要求設置40個循環，用2-△Ct法計算目標mRNA相對表達水平。

1.4 Western印跡法檢測基因敲減的HCT116細胞中Id1和Id3蛋白表達水平

收集1.2構建和分組處理的細胞，用裂解液裂解，冰上孵育15 min，提取細胞總蛋白。用BCA法進行蛋白定量，每組取25 μg裂解蛋白進行凝膠電泳，電轉至NC膜。用5% FBS封閉液室溫封閉1 h，加Id1和Id3抗體（1∶500），4℃過夜，以GPADH作為內參（1∶2000），用TBST洗3次后加二抗（1∶1000），室溫孵育二抗2 h后加TBST洗3次，使用化學發光試劑盒顯影。以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值比值表示目標蛋白表達水平。

1.5 實時無標記細胞檢測技術檢測細胞生長增殖

取1.2構建和分組的細胞，密度為2×108L-1，加到已檢測過基線的E-Plate 16檢測板中，每孔加100 μL培養液，室溫靜置30 min后將檢測板置培養箱中的RTCA S16儀器上，取0，24，48和72 h共4個時間點，對細胞增殖進行監測并繪制生長曲線圖。

1.6 克隆形成實驗檢測基因敲減的HCT116細胞克隆數

將1.2構建和分組處理的對數生長期細胞，經胰酶消化后，各取800個接種到6孔板中，12～14 d后，吸棄培養液，PBS輕輕洗3次，甲醇固定30 min，每孔加0.1%結晶紫染液600 μL，染色10 min，PBS輕洗3次，計算克隆數和克隆直徑。

1.7 流式細胞術檢測基因敲減的HCT116細胞凋亡

收集1.2構建和分組處理的細胞，按AnnexinⅤ/PI凋亡檢測試劑盒說明書，用100 μL結合液重懸，后加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫孵育15 min后上流式細胞儀采集細胞凋亡數據。

1.8 無血清懸浮細胞球培養實驗觀察基因敲減的HCT116細胞懸浮球的大小和數量

采用極限稀釋法，將1.2構建和分組處理的細胞接種于96孔板中，每組5復孔，每孔加200 μL無血清DMEM/F12培養液培養7 d后，顯微鏡下觀察懸浮球的直徑和數量。

1.9 流式細胞術檢測基因敲減的HCT116細胞CD24和CD133表達

采用直接免疫熒光標記法分析1.2構建和分組處理的細胞中CD24和CD133（CD133/2亞型）的表達，取1×l06對數生長期細胞，加抗CD24和CD133熒光抗體以及相應同型抗體；室溫避光反應30 min，每管加1 mL洗液，800×g離心5 min，去上清，沉淀加200 μL洗液混勻后上流式細胞儀采集細胞CD24和CD133表達數據。

1.10 Western印跡法檢測基因敲減的HCT116細胞中CD24，CD133，EpCAM，Oct4，EZH2，Lgr5和 β聯蛋白表達水平

參照1.4方法，收集1.2構建和分組處理的細胞，進行Western印跡實驗，CD24，CD133，EpCAM，Oct4，EZH2，Lgr5和β聯蛋白抗體稀釋倍數為1∶500，二抗稀釋倍數為1∶1 000，使用化學發光試劑盒顯影。以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值比值表示目標蛋白表達水平。

1.11 Western印跡法檢測基因敲減的HCT116細胞中c-myc， β聯蛋白，SuFu，PTCH2，Shh和GLI2蛋白表達水平

收集1.2構建和分組處理的細胞，用裂解液裂解，冰上孵育15 min，提取細胞總蛋白。加入500 μL細胞裂解液，用吸頭上下抽吸數次，冰上孵育15 min，振蕩10 s，10 000×g離心5 min，收集上清，此為漿蛋白；再加入500 μL細胞裂解液振蕩5 s，離心5 min，棄除上清，加入50 μL萃取緩沖液抽吸數次；4℃孵育30 min，12 000×g離心10 min，收集上清，此為核蛋白。用BCA法進行蛋白質定量，每組取25 μg裂解蛋白進行凝膠電泳，電轉至NC膜。用5%FBS封閉液室溫封閉1 h，加一抗（1∶500）4℃過夜，用TBST洗3次后加二抗（1∶1000），室溫孵育二抗2 h后加入TBST洗3次，使用化學發光試劑盒顯影。以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值比值表示目標蛋白表達水平。

1.12 Western印跡法檢測基因敲減HCT116細胞過表達c-myc后CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5蛋白的表達

參照1.2在Id1和Id3敲減的HCT116細胞中構建c-myc過表達細胞株，參照1.4進行Western印跡實驗，抗CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5抗體稀釋比1∶500，二抗稀釋比1∶1000，使用化學發光試劑盒顯影。以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值比值表示目標蛋白表達水平。

1.13 統計學分析

2 結果

2.1 Id1和Id3基因敲減HCT116細胞的構建

通過構建慢病毒載體系統，獲得敲減Id1/Id3的HCT116細胞株，經嘌呤霉素篩選3周后，熒光顯微鏡下觀察熒光強度。如圖1顯示，HCT116對照組、sh-Id1組、sh-Id3組和sh-Id1Id3組細胞綠熒光率均達＞90%，提示慢病毒成功感染細胞。

Fig.1 Construction of HCT116 cells with inhibitor of differentiation 1（Id1）and Id3 gene double-knockdown（×100）.Short hairpin RNA plasmid was used to construct Id1 sin?gle gene knockout（sh-Id1），sh-Id3 and double gene knockout（sh-Id1Id3）HCT116 cells by lentiviral transfection system.

2.2 Id1和Id3基因敲減HCT116細胞中Id1和Id3 mRNA水平

如圖2所示，與對照組相比，sh-Id1組Id1mRNA水平顯著降低（P＜0.01），sh-Id3組Id3mRNA水平顯著降低（P＜0.01），sh-Id1Id3組Id1和Id3mRNA水平均顯著降低（P＜0.01）。

Fig.2 Id1（A）and Id3（B）mRNA expressions in HCT116 cells with Id1 and Id3 gene knockdown by qRT-PCR.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3 Id1和Id3基因敲減HCT116細胞中Id1和Id3蛋白的表達

如圖3所示，與對照組相比，sh-Id1組Id1蛋白表達降低，sh-Id3組Id3蛋白表達降低，sh-Id1Id3組Id1和Id3蛋白表達均顯著降低（P＜0.01）。

Fig.3 Protein expressions of Id1（A1，A2） and Id3（B1，B2）in HCT116 cells with Id1 and Id3 gene knock?down by Western blotting.IA：intensity analysis.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 Id1/Id3敲減對HCT116細胞增殖的影響

實時無標記細胞檢測結果（圖4）顯示，48 h后，與對照組相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細胞的增殖信號顯著減弱（P＜0.05）；與sh-Id1和sh-Id3相比，sh-Id1Id3組的增殖信號亦顯著減弱（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of Id1/Id3 knockdown on proliferation of HCT116 cells by real-time cells analysis.See Fig.1 for the cell treatment.Cell proliferation was detected 48 h post-transfection.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group；#P＜0.05，com?pared with sh-Id1group；△P＜0.05，compared with sh-Id3 group.

2.5 Id1/Id3敲減對HCT116細胞克隆數量和大小的影響

克隆形成實驗結果（圖5）顯示，與對照組細胞克隆數（411±18）（n=3）相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細胞克隆數分別下降到185±24，201±20和112±21（n=3）；細胞克隆的平均直徑分別由對照組（321±48）μm（n=3）下降到144±14，163±13和（87±9）μm（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對照組相比顯著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3組與sh-Id1、sh-Id3組相比顯著降低（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of Id1/Id3 knockdown on colony-formation of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.6 Id1/Id3敲減對HCT116細胞凋亡的影響

圖6結果顯示，與對照組凋亡率為（42±4）%相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），分別為（69±6）%，（59±5）%和（80±7）%（n=3）；sh-Id1Id3組細胞凋亡率顯著高于sh-Id1和sh-Id3組（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of Id1/Id3 knockdown on apoptosis of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.7 敲減Id1/Id3對HCT116細胞成球能力的影響

無血清懸浮細胞球培養結果（圖7）顯示，與對照組細胞球性形成率（37±2）%相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細胞球性形成率分別下降到（15±2）%，（18±3）%和（9±2）%（n=3）；干細胞球的平均直徑分別由對照組（103±6）μm下降到49±2，55±3和（43±1）μm（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對照組相比均顯著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3組與sh-Id1和sh-Id3組相比顯著降低（P＜0.05）。

Fig.7 Effect of Id1/Id3 knockdown on sphere-formation of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.8 Id1/Id3敲減對HCT116細胞CD133和CD24表達的影響

如圖8所示，CD133+細胞比例在對照組、sh-Id1、sh-Id3和sh-Id1Id3組分別為（2.80±0.17）%，（0.50±0.12）%，（0.70±0.12）%和（0.27±0.09）%（n=3）；CD24+細胞比例在對照組、sh-Id1、sh-Id3和sh-Id1Id3組分別為（24.60±2.25）%，（10.90±3.60）%，（12.70±1.13）%和（0.36±0.06）%（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組中CD133+和CD24+細胞比例與對照組相比均顯著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3組與sh-Id1和sh-Id3組相比顯著降低（均P＜0.05）。

Fig.8 Effect of Id1/Id3 knockdown on stemness of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.9 Id1/Id3敲減對HCT116細胞干性相關蛋白CD24、CD133、EPCAM、Oct4、EZH2、 β 聯蛋白、Lgr5表達的影響

Western 印跡結果顯示（圖9），sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對照組相比，CD24、CD133、EPCAM、Oct4、EZH2、β聯蛋白和Lgr5蛋白表達均顯著性下調（P＜0.05），但 CD166和 CD44未見明顯變化。

Fig.9 Protein expressions of CD24，CD133，EPCAM，Oct4，EZH2， β-catinin，CD166，CD44 and Lgr5 in HCT116 cells with Id1/Id3 gene knockdown by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

2.10 Id1/Id3敲減對HCT116細胞Wnt/ β聯蛋白和shh通路相關蛋白表達的影響

Western印跡結果顯示，與對照組相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組中Wnt/β聯蛋白通路關鍵分子c-myc、細胞質β聯蛋白、細胞核內β聯蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.05）（圖10A）；sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對照組相比，Shh通路的關鍵分子SuFu和PTCH2顯著上升，Shh和GLI2顯著下降（均P＜0.05）（圖10B）。

Fig.10 Id3 and Id1 co-regulate stemness characteristics of colon cancer cells through Wnt/ β-catenin and Shh signaling pathways by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

2.11 Id1/Id3基因敲減HCT116細胞過表達c-myc對CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5蛋白表達的影響

Western印跡結果顯示（圖11），過表達c-myc后，Id1和Id3被敲減后降低的干性標志物CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5的表達重新上調（均P＜0.05），CRC細胞的干性重新增強，進一步明確了Id3和Id1通過Wnt/β聯蛋白、Shh通路共同調控CRC的干性相關蛋白的表達。

Fig.11 Expressions of CD133，Oct4，EZH2，EpCAM and Lgr5 after c-myc overexpression in HCT116 cells with Id1/Id3 gene knockdown by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

3 討論

本研究發現，在腸癌細胞中敲減Id1和Id3均可通過增加凋亡，從而抑制腸癌細胞的增殖以及克隆形成，且同時敲減Id1與Id3后，腸癌細胞的增殖抑制不僅與對照組相比顯著降低，而且與單獨敲減組比較顯著降低，說明Id1與Id3對HCT116細胞增殖的影響具有疊加作用。

高增殖能力是許多癌癥細胞的重要特征之一，與癌癥的進展密切相關［19-20］，同時也是腫瘤干細胞的特征之一。腫瘤干細胞具有自我更新能力及增強侵襲、轉移、腫瘤形成和增殖的能力等特點，同時具有抗常規放療和化療的能力，這些干細胞特性是腫瘤治療失敗的主要原因。本研究采用無血清懸浮培養細胞球的方法，發現HCT116細胞敲減Id1/Id3后細胞成球能力下降，流式細胞術和Western印跡檢測均發現CD133和CD24等干性標志物表達更低，并且同時敲減Id1和Id3能顯著抑制HCT116細胞的干性特征，表明Id3能協同Id1更好地抑制腸癌進展。

此外，干細胞的調控涉及多種信號通路，如Wnt，Sonic，Hedgehog（Shh）和 Notch 等，它們在多種人類惡性腫瘤中失控，直接導致腫瘤的發生發展。有研究表明，Wnt/β聯蛋白信號通路在保持上皮干細胞及CRC干細胞生長和自我更新功能上起至關重要的作用，且Wnt/β聯蛋白信號通路的活化可導致EMT和腫瘤轉移［21］。同樣，Shh在調控胚胎干細胞和成體干細胞中有重要作用［22］。在本研究中敲減Id1/Id3后Wnt/β聯蛋白通路和Shh通路上的關鍵蛋白的表達水平明顯下降，這說明Id1/Id3通過Wnt/β聯蛋白、Shh通路調控CRC細胞干性相關蛋白的表達。c-myc作為Wnt通路和SHH通路共同的靶基因，參與維持胚胎干細胞的自我更新功能，可誘導Bmi1和EZH2的表達。本研究通過在敲減Id1/Id3的HCT116細胞上過表達c-myc增強了CRC細胞的干性，從而進一步明確了Id3和Id1通過Wnt/β聯蛋白、Shh通路共同調控CRC的干性相關蛋白的表達。

腫瘤細胞耐藥性的產生是腫瘤治療的主要障礙之一，而腫瘤干細胞是其耐藥的主要機制。抗腫瘤藥物一般作用于增殖的腫瘤細胞，而腫瘤干細胞多處于靜止期而耐受化療藥物，常常是CRC等惡性腫瘤復發的原因之一。從腫瘤干細胞的角度尋找治療藥物，或降低腫瘤的干性，將腫瘤干細胞標志物作為治療靶點是解決腫瘤細胞耐藥的策略之一［23］。Id1和Id3可以共同調控CRC的干性相關蛋白的表達，可能是CRC耐藥的原因之一，將Id1和Id3作為治療靶點可能是將來腫瘤治療的有效手段之一。