生殖毒性替代試驗(yàn)在中藥安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

楊 威，郭健敏，陳文培，雷夏凌，柳 璐，韓 玲

（1.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評(píng)價(jià)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評(píng)價(jià)分中心，廣東省創(chuàng)新藥物評(píng)價(jià)與研究工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510990；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，北京 100022；3.香港科技大學(xué)，香港 999077）

生殖毒性研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，是創(chuàng)新藥物研發(fā)中的必經(jīng)環(huán)節(jié)。國(guó)內(nèi)外對(duì)傳統(tǒng)小分子化藥和中藥等進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)時(shí)，多采用經(jīng)典的三段式動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)法。經(jīng)典方法使用動(dòng)物數(shù)量多，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，試驗(yàn)費(fèi)用高，增大了藥物研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。為彌補(bǔ)經(jīng)典方法的不足，生殖毒性替代試驗(yàn)方法應(yīng)運(yùn)而生。歐洲替代方法驗(yàn)證中心（Euro?pean Centre for the Validation of Alternative Method，ECVAM）于1996-2000年驗(yàn)證并推薦3個(gè)替代試驗(yàn)，分別為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）試驗(yàn)（ESC test，EST）、胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)（embryonic cell micromass culture，MM）試驗(yàn)和全胚胎培養(yǎng)（whole embryo culture，WEC）試驗(yàn)，以評(píng)估其區(qū)分無(wú)胚胎毒性、弱胚胎毒性和強(qiáng)胚胎毒性藥物的準(zhǔn)確性［1］。驗(yàn)證結(jié)果表明，3種體外胚胎毒性試驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)⒕哂信咛ザ拘缘幕衔镞M(jìn)行分類（無(wú)、弱或強(qiáng)胚胎毒性），準(zhǔn)確性分別達(dá)78%，70%和80%，而且三者對(duì)強(qiáng)胚胎毒性化合物的靈敏度高達(dá)100%。3種體外胚胎毒性試驗(yàn)的可重復(fù)性是可接受的。

2009-2016年，多項(xiàng)研究［2-4］對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性模型的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。22種已知胚胎毒性的化合物的驗(yàn)證結(jié)果表明，所有化合物的斑馬魚(yú)試驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)及臨床表現(xiàn)一致［2］，靈敏度為100%，特異性為100%，提示斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性模型可用于區(qū)分致畸性和非致畸性化合物，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)可作為發(fā)育毒性評(píng)價(jià)的又一替代試驗(yàn)。

中藥應(yīng)用歷史悠久，隨著中藥國(guó)際化浪潮的掀起，現(xiàn)代中藥研發(fā)和毒性評(píng)價(jià)循證于“臨床-非臨床-臨床-上市后研究”模式而實(shí)現(xiàn)全程式中藥安全評(píng)價(jià)和監(jiān)管。全程式中藥安全評(píng)價(jià)和監(jiān)管提出，對(duì)研究薄弱的特殊毒性如生殖毒性、遺傳毒性和致癌試驗(yàn)等，更應(yīng)該貫徹執(zhí)行“動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)潛在毒性-臨床試驗(yàn)繼續(xù)完成毒理學(xué)研究-上市后再評(píng)價(jià)”的評(píng)價(jià)監(jiān)管策略［5］。受歷史和科技條件的限制，多數(shù)中藥在應(yīng)用于人體之前并未按要求進(jìn)行嚴(yán)格的生殖毒性評(píng)價(jià)。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心于2008-2016年受理審評(píng)的792個(gè)中藥新藥品種，僅5.3%提供了生殖毒性研究資料［6］。即使是《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）收錄的83味毒性中藥，亦只是部分進(jìn)行了生殖毒性評(píng)價(jià)［7］。人體生殖毒性宏觀水平檢查的不足以及倫理上的限制，均意味著特定生殖毒性臨床試驗(yàn)的難實(shí)現(xiàn)性以及非臨床研究的迫切需求［8］。隨著國(guó)家對(duì)中藥新藥研發(fā)重視程度的提高（如即將到來(lái)的經(jīng)典名方研究），必將推動(dòng)中藥安全性評(píng)價(jià)要求和水平的提高，也必將研發(fā)出更多安全有效的中藥新藥。

無(wú)論是目前臨床上正在使用的中藥或是創(chuàng)新中藥新藥，若是均按經(jīng)典方法進(jìn)行全面的生殖毒性評(píng)價(jià)，無(wú)疑將會(huì)耗費(fèi)大量的資源。但若采用替代試驗(yàn)對(duì)中藥進(jìn)行生殖毒性研究，并優(yōu)先對(duì)替代試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有毒性的中藥進(jìn)行全面的生殖毒性評(píng)價(jià)；對(duì)替代試驗(yàn)中未見(jiàn)明顯生殖毒性的中藥延后進(jìn)行生殖毒性研究，這樣則非常有利于推動(dòng)中藥生殖評(píng)價(jià)和中藥生殖毒性背景數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。本文就常見(jiàn)的4種生殖毒性替代方法及其在中藥評(píng)價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)

1.1 原理和方法

ESC是早期胚胎中分離出來(lái)的一類細(xì)胞，具有可體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性。無(wú)論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ESC在特定條件下均能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有類型的細(xì)胞。驗(yàn)證的EST是通過(guò)檢測(cè)受試物對(duì)ESC D3細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過(guò)程的影響，結(jié)合受試物對(duì)ESC與纖維母細(xì)胞3T3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，判斷受試物對(duì)胚胎發(fā)育的毒性［9］。

ESC試驗(yàn)包括細(xì)胞毒性試驗(yàn)和分化試驗(yàn)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)使用小鼠纖維母細(xì)胞系3T3細(xì)胞和未分化的小鼠ESC D3細(xì)胞，以源自濃度-反應(yīng)曲線的3T3半數(shù)抑制濃度（3T3 50% inhibitory concentra?tion，IC503T3）和IC50D3為終點(diǎn)反映細(xì)胞毒性。分化試驗(yàn)使用小鼠D3細(xì)胞，以源自濃度-反應(yīng)曲線的D3半數(shù)抑制分化濃度（D3 50% inhibited differenti?ation，ID50D3）為終點(diǎn)來(lái)反映細(xì)胞毒性。將上述終點(diǎn)參數(shù)代入判別函數(shù)進(jìn)行計(jì)算，對(duì)受試物進(jìn)行無(wú)胚胎毒性、弱胚胎毒性和強(qiáng)胚胎毒性分類。

1.2 優(yōu)缺點(diǎn)和改進(jìn)方法

ESC獨(dú)有的特點(diǎn)是能夠在體外分化成胚胎的所有成分，包括形成每一個(gè)胚胎層（如外胚層、中胚層和內(nèi)胚層）以及這些胚體細(xì)胞后續(xù)的分化。因此，這個(gè)模型能評(píng)估多種與胚胎發(fā)育相關(guān)的事件。優(yōu)點(diǎn)是它可直接評(píng)估受試物對(duì)胚胎干細(xì)胞分化程度和對(duì)體細(xì)胞的毒性和（或）促增殖作用［10］。缺點(diǎn)是試驗(yàn)系統(tǒng)使用的是小鼠細(xì)胞系，外推到人有不確定性；另外，其終點(diǎn)為形態(tài)學(xué)終點(diǎn)，要求操作人員有非常好的辨別心肌細(xì)胞搏動(dòng)的經(jīng)驗(yàn)，檢測(cè)通量相對(duì)較低。

針對(duì)以上局限性有學(xué)者提出改進(jìn)。例如，試驗(yàn)系統(tǒng)可使用人ESC源多能干細(xì)胞，減少外推的不確定性，也可把胚胎發(fā)育不同階段進(jìn)行細(xì)分類，在ESC定向分化過(guò)程中給予毒性物質(zhì)干預(yù)建立特異性EST，也可使用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其具有與人ESC相同的分化能力且不涉及生物學(xué)倫理問(wèn)題［11］。檢測(cè)終點(diǎn)方面可使用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)分化基因標(biāo)志物（如心肌細(xì)胞特異肌球蛋白重鏈蛋白）的表達(dá)［9］，也可同時(shí)檢測(cè)藥物對(duì)非心肌細(xì)胞分化（成骨分化、軟骨分化和神經(jīng)分化等）的抑制作用［12］。另外，胚胎毒性物質(zhì)作用引起小鼠D3胚胎干細(xì)胞分化細(xì)胞的場(chǎng)電位、心肌跳動(dòng)結(jié)果具有一致性［13］，因此可通過(guò)檢測(cè)場(chǎng)電位而實(shí)現(xiàn)高通量篩查。

1.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

Li等［14］運(yùn)用EST評(píng)估了白術(shù)、板藍(lán)根、黃連和芫花的胚胎毒性。測(cè)得白術(shù)的終點(diǎn)IC503T3，IC50ESC和ID50ESC分別為4.82，42.42和37.67 g·L-1，板藍(lán)根的終點(diǎn)結(jié)果分別為1.76，27.68和15.00 g·L-1，黃連的終點(diǎn)結(jié)果分別為0.40，2.73和1.06 g·L-1，芫花的終點(diǎn)結(jié)果分別為0.51，0.75和1.15 g·L-1。分類結(jié)果表明，白術(shù)和板藍(lán)根無(wú)胚胎毒性，黃連為弱胚胎毒性，芫花表現(xiàn)出強(qiáng)烈的胚胎毒性。張崴等［15］采用EST，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定分化心肌細(xì)胞β肌凝蛋白重鏈mRNA評(píng)估黃芩苷的胚胎毒性。結(jié)果表明，黃芩苷具有弱胚胎毒性。夏荃等［16］基于EST評(píng)價(jià)川芎水煎液的胚胎毒性，發(fā)現(xiàn)川芎水煎液具有弱胚胎毒性；而該課題組前期進(jìn)行的在體生殖毒性試驗(yàn)結(jié)果也顯示，小鼠在攝入川芎32 g·kg-1劑量（相當(dāng)于臨床劑量的16倍）時(shí)存在死胎和吸收胎增加及胸骨和四肢骨骼發(fā)育畸形的情況；以上結(jié)果表明，川芎具有胚胎發(fā)育毒性。張志偉［17］用生半夏對(duì)Wistar大鼠連續(xù)ig給予3 d，獲取含藥血清以制備不同配伍的含藥血清，繼而對(duì)小鼠ESC進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生半夏粉劑組ESC增殖活性被顯著抑制，生半夏湯劑和粉劑可促進(jìn)ESC晚期凋亡。以上結(jié)果表明，生半夏粉在劑量為每天3.45 g·kg-1時(shí)具有顯著的胚胎毒性，而干姜人參半夏湯或粉劑無(wú)明顯的胚胎毒性，作者推測(cè)這可能是通過(guò)“生姜解半夏毒”的作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

2 胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)

2.1 原理和方法

MM試驗(yàn)通過(guò)觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)、集落形成數(shù)量、基質(zhì)變化和超微結(jié)構(gòu)變化評(píng)價(jià)外源性化學(xué)物質(zhì)對(duì)胚胎是否存在毒性作用，是介于單細(xì)胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)之間的一種體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)［18］。

ECVAM驗(yàn)證的MM試驗(yàn)使用的是大鼠肢芽細(xì)胞微團(tuán)。在大鼠孕14 d時(shí)取出胚胎，顯微鏡下分離四肢肢芽，制備單細(xì)胞懸液，與受試藥物共培養(yǎng)，以阿利新藍(lán)染色法和中性紅染料攝入法測(cè)定活細(xì)胞總數(shù)、分化細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞團(tuán)數(shù)，評(píng)估肢芽細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。MM試驗(yàn)以抑制阿利新藍(lán)染色I(xiàn)D50和降低中性紅攝取IC50為終點(diǎn)［18］，計(jì)算所得判別值，預(yù)測(cè)受試物的胚胎毒性并分類。

2.2 優(yōu)缺點(diǎn)和改進(jìn)方法

MM試驗(yàn)周期短，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，作為體外試驗(yàn)也具有干預(yù)條件可控等優(yōu)點(diǎn)，但在ECVAM驗(yàn)證的3種方法中其準(zhǔn)確性相對(duì)較低，原因可能為驗(yàn)證的MM試驗(yàn)使用的是肢芽微團(tuán)，側(cè)重于枝芽細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，更適用于區(qū)分強(qiáng)致畸毒性、弱致畸毒性和無(wú)致畸毒性物質(zhì)［19］。選擇對(duì)生命影響程度不同的組織細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行研究，能對(duì)受試物的胚胎毒性（心肌等）、致畸毒性（骨和上顎等）進(jìn)行預(yù)判和致畸部位辯別［10］。

2.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

MM試驗(yàn)在中藥胚胎毒性研究方面具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)，因其不僅能觀察受試物的直接影響，還可研究代謝產(chǎn)物的毒性。將受試物和（或）代謝活化系統(tǒng)加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，可觀察受試物體外代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性和致畸性［20］；也可將妊娠大鼠暴露受試物一段時(shí)間后，取出微團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察受試物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和致畸性［21］。

劉星等［22］ig給予雄性SD大鼠菟絲子10，20和40 g·kg-1，制備菟絲子含藥血清。體外培養(yǎng)大鼠胚胎前肢芽器官和后肢芽細(xì)胞微團(tuán)，培養(yǎng)過(guò)程中加入含藥血清干預(yù)。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，菟絲子40 g·kg-1組指突不明顯，掌指骨發(fā)育分化較差，形成集落數(shù)少，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)水平低，表明菟絲子40 g·kg-1含藥血清可抑制大鼠肢芽軟骨的發(fā)育和肢芽細(xì)胞的分化，菟絲子存在潛在的胚胎發(fā)育毒性。李麗娟等［23］取孕13 d小鼠胚胎后肢芽制備單細(xì)胞混懸液，加入相當(dāng)于406.25，1625.00和3250.00 mg生藥·L-1的續(xù)斷水煎液，結(jié)果在所采用的劑量范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)續(xù)斷對(duì)胚胎肢芽細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的毒性，反而發(fā)現(xiàn)各劑量均不同程度地促進(jìn)肢芽細(xì)胞的增殖和分化，并抑制肢芽細(xì)胞壞死和凋亡。韋興邦等［24］用不同比例的布依族經(jīng)方神闕散含藥血清干預(yù)正常大鼠中腦微團(tuán)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)含神闕散代謝產(chǎn)物的大鼠血清對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞的分化和增殖均未產(chǎn)生影響，從而初步判斷在其試驗(yàn)劑量下神闕散無(wú)致畸毒性。

3 全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)

3.1 原理和方法

WEC試驗(yàn)以正處于器官形成期的胚胎為研究對(duì)象，此期的胚體組織對(duì)外在的物理和化學(xué)等因素極為敏感。ECVAM驗(yàn)證的WEC試驗(yàn)是在大鼠妊娠第10天，取體節(jié)數(shù)為1～5的胚胎在大鼠血清中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48 h，以胚胎心跳和血液循環(huán)為胚胎存活指標(biāo)，卵黃囊直徑、顱臀長(zhǎng)和體長(zhǎng)、體節(jié)數(shù)及胚胎質(zhì)量作為配套胚胎生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，按Brown&Fabro定義的改良評(píng)分系統(tǒng)對(duì)包括17項(xiàng)器官分化形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。每濃度和對(duì)照孔分別收集7個(gè)胚胎的數(shù)據(jù)，以對(duì)照組的平均總形態(tài)學(xué)得分（total morpho?logical score，TMS，為評(píng)分系統(tǒng)中所有器官分?jǐn)?shù)的總和）為100%，計(jì)算各濃度的TMS。同時(shí)記錄每組胚胎畸形的數(shù)量和特征，計(jì)算各濃度組畸形或死亡胚胎的比例。WEC試驗(yàn)有2個(gè)預(yù)測(cè)模型（prediction model，PM），PM1以畸形或死亡胚胎的無(wú)效應(yīng)濃度（ICNOEC）、IC50和ICmax為終點(diǎn)；在此基礎(chǔ)上，PM2補(bǔ)充3T3細(xì)胞毒性指標(biāo)IC503T3［25］。

3.2 優(yōu)缺點(diǎn)和改進(jìn)方法

WEC試驗(yàn)是一個(gè)完整的生物體模型系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是比體內(nèi)試驗(yàn)的相似度高，試驗(yàn)周期短，評(píng)價(jià)效率高。Zhu等［26］使用沙利度胺初步驗(yàn)證兔胚胎的WEC試驗(yàn)，仍需要多類別的確證生殖毒性藥物進(jìn)行驗(yàn)證。WEC試驗(yàn)不足之處為其隔離了母體影響（代謝和毒性），無(wú)法呈現(xiàn)母體-胎兒相互作用。可選擇性地加入母體因素到培養(yǎng)系統(tǒng)以彌補(bǔ)母體影響的缺失［10］，還可增加功能性終點(diǎn)、細(xì)胞死亡標(biāo)志物和形態(tài)學(xué)改變標(biāo)志物等。

3.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

肖凱［27］將10.5日齡大鼠胚胎與含不同濃度生草烏的大鼠血清培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)生草烏濃度≥1.25 g生藥·L-1具有抑制組織器官分化的毒性作用，濃度≥2.5 g生藥·L-1具有影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的毒性作用，且毒性效應(yīng)均具有劑量相關(guān)性。柳鵬等［28］將8.5日齡小鼠胚胎于含不同濃度人參皂苷Rb1的大鼠血清中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1濃度≥30 mg·L-1對(duì)胚胎多個(gè)組織器官的分化有明顯抑制作用，其中40 mg·L-1即使胚胎體節(jié)數(shù)量減少，50 mg·L-1時(shí)卵黃囊直徑和頭長(zhǎng)也明顯縮短。該研究結(jié)果表明，人參皂苷Rb1在暴露劑量≥30 mg·L-1時(shí)具有一定的發(fā)育毒性，且認(rèn)為其發(fā)育毒性的作用機(jī)制可能是對(duì)卵黃囊胎盤(pán)結(jié)構(gòu)和功能的影響。

吡咯里西啶生物堿廣泛存在于世界上6000余種植物中。止咳化痰中藥款冬花含有13種吡咯里西啶生物堿，其中克氏千里光堿含量最高［29］。韓佳寅等［30-31］運(yùn)用WEC試驗(yàn)評(píng)價(jià)克氏千里光堿、千里光菲靈堿和倒千里光堿的胚胎毒性。結(jié)果表明，克氏千里光堿和千里光菲靈堿濃度≥25 mg·L-1時(shí)對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)分化均具有毒性；倒千里光堿濃度≥12.5 mg·L-1時(shí)抑制器官組織分化，濃度≥25 mg·L-1時(shí)影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育。上述結(jié)果與該課題組前期研究千里光水提物、總生物堿提取物以及含千里光的中藥復(fù)方千柏鼻炎片對(duì)大鼠均有一定的致畸作用的結(jié)果一致，揭示總生物堿可能是含吡咯里西啶生物堿類植物的主要致畸成分群。

4 斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性模型

4.1 原理和方法

斑馬魚(yú)是除人和小鼠外的第3種模式動(dòng)物。斑馬魚(yú)基因與人類基因的相似度高達(dá)87%，且其胚胎在母體外發(fā)育，胚胎小，發(fā)育時(shí)間很短〔受精后24 h（postfertilization 24 h，24 hpf）原代神經(jīng)元細(xì)胞開(kāi)始分化，48 hpf后形成腦室，72 hpf整個(gè)器官形成期完成，6 d后形成所有的神經(jīng)系統(tǒng)〕，因此斑馬魚(yú)可作為評(píng)價(jià)藥物潛在胚胎發(fā)育毒性的理想模型［3］。

試驗(yàn)時(shí)將雌雄斑馬魚(yú)按1∶2的比例交配，顯微鏡下剔除未受精的胚胎備用。將受試藥物先放入培養(yǎng)箱中預(yù)溫，然后在1～2 hpf內(nèi)選取發(fā)育正常且一致的胚胎，每孔放入15～20只，置28～29℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 hpf選出發(fā)育正常的胚胎并置裝有待測(cè)藥物的24孔板中，每孔1只，每板設(shè)2個(gè)濃度。繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至144 hpf。在24，48，72和144 hpf用顯微鏡對(duì)眼、尾部延伸、心臟搏動(dòng)、血液循環(huán)和自主游動(dòng)等進(jìn)行觀察，記錄死亡數(shù)和畸形數(shù)。正常胚胎用0表示，畸形胚胎用1表示，計(jì)算致死率和致畸率［3］。

4.2 優(yōu)缺點(diǎn)和改進(jìn)方法

斑馬魚(yú)最明顯的優(yōu)勢(shì)為其強(qiáng)大的繁殖能力，短期內(nèi)可提供大量樣本，試驗(yàn)成本相對(duì)較低。斑馬魚(yú)胚胎生長(zhǎng)速度快，發(fā)育時(shí)間短，可在短的試驗(yàn)周期內(nèi)覆蓋胚胎發(fā)育的全過(guò)程；并且胚胎透明，易于觀察，可進(jìn)行靶器官的篩選。此外，斑馬魚(yú)具有一個(gè)非常獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，即48 hpf內(nèi)即可完成受試物心臟毒性測(cè)試，靈敏度達(dá)到ECVAM對(duì)替代毒性試驗(yàn)推薦原則中“極好”的范疇［32］。吸收、分布、代謝和排泄是影響藥物毒性的關(guān)鍵因素。盡管斑馬魚(yú)肝表達(dá)與人體代謝相似的細(xì)胞色素P450酶如CYP3A4，但酶功能及其代謝藥物的過(guò)程與人體的差異還有待研究。最近研究報(bào)道，改良的斑馬魚(yú)試驗(yàn)?zāi)軐?duì)化合物的致畸能力進(jìn)行定量預(yù)測(cè)及分級(jí)，預(yù)測(cè)能力達(dá)88%［33-35］。但驗(yàn)證化合物數(shù)量有限，有待更多的驗(yàn)證。

4.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒物的監(jiān)測(cè)，近年來(lái)也被用于藥物毒理包括中藥胚胎發(fā)育毒性的研究。馬錢(qián)子堿是消腫止痛中藥馬錢(qián)子的有效成分，也是其毒性成分。張啟春等［36］運(yùn)用斑馬魚(yú)模型評(píng)估馬錢(qián)子堿的致畸性和毒性作用。結(jié)果表明，馬錢(qián)子堿在濃度≥100 μmol·L-1時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎孵化率明顯降低，其中 200 μmol·L-1可導(dǎo)致魚(yú)卵脊柱側(cè)彎、心包水腫和黑色素少等畸形現(xiàn)象。陳錫強(qiáng)等［37］觀察蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚(yú)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)蒼耳子水提取物孵育濃度達(dá)到7.5 mg·L-1時(shí)開(kāi)始呈現(xiàn)致胚胎死亡的毒性作用；≥11.25 mg·L-1時(shí)抑制斑馬魚(yú)的孵化，特別是15 mg·L-1時(shí)斑馬魚(yú)出現(xiàn)心臟積液和翹尾等畸形現(xiàn)象。該研究還發(fā)現(xiàn)，蒼耳子提取物0.93 mg·L-1明顯提高心率，而當(dāng)＞7.5 mg·L-1時(shí)顯著降低心率。董永新等［38］將斑馬魚(yú)胚胎浸入含不同濃度桔梗總皂苷提取物溶液中養(yǎng)殖，顯微鏡下觀察死亡和畸形。結(jié)果表明，高劑量（8 mg·L-1）組致死率和致畸率分別達(dá)80%和28%。畸形主要表現(xiàn)為心包水腫、心前區(qū)血液淤積、軀干發(fā)育停滯和橫紋肌結(jié)構(gòu)改變等。

5 結(jié)語(yǔ)

中藥的開(kāi)發(fā)和利用是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一，但中藥生殖毒性的研究目前處于嚴(yán)重滯后狀態(tài)，目前絕大多數(shù)中藥尚未按要求進(jìn)行全面的生殖毒性研究。然而若將所有中藥均按經(jīng)典的三段式生殖毒性試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，這將會(huì)是一個(gè)比較漫長(zhǎng)且耗費(fèi)非常大的工作。若能采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的體外替代試驗(yàn)預(yù)先進(jìn)行評(píng)價(jià)，將會(huì)給中藥生殖毒性的評(píng)價(jià)帶來(lái)事半功倍的效果。因此，按GLP要求建立經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的生殖毒性替代試驗(yàn)體系是國(guó)內(nèi)的發(fā)展趨勢(shì)，也是快速解決中藥生殖毒性評(píng)價(jià)的新途徑。

由于中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，體內(nèi)吸收代謝過(guò)程受眾多因素干擾，采取體外給藥的方式又存在無(wú)吸收代謝過(guò)程等問(wèn)題，極大地增加了研究難度。鑒于這種情況，如果在體外替代試驗(yàn)中使用含藥血清代替中藥粗提物，則能比較接近地反映藥物在體內(nèi)的狀態(tài)，發(fā)揮藥效的活性成分基本與體內(nèi)保持一致［22］。但為確保含藥血清的質(zhì)量，在制備含藥血清時(shí)應(yīng)使用合適的方法對(duì)血清相關(guān)成分進(jìn)行測(cè)定，在可能的情況下將其與其他毒性試驗(yàn)中毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和（或）藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，以確保用于替代試驗(yàn)的含藥血清的質(zhì)量符合要求。

浙江中醫(yī)藥大學(xué)團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用已知胚胎毒性的10種中藥評(píng)價(jià)EST、MM試驗(yàn)和WEC試驗(yàn)在中藥胚胎毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度時(shí)提出，應(yīng)用多個(gè)替代模型而非單個(gè)替代測(cè)試能更準(zhǔn)確預(yù)測(cè)受試中藥的毒性［39］，這也提示選擇體外替代試驗(yàn)時(shí)需考慮并區(qū)分胚胎毒性和致畸性，正確選擇組合策略［40］。而在不能獲取同類或者相似成分藥物的安全性資料的情況下，可考慮根據(jù)需要逐步增加模型復(fù)雜性的測(cè)試策略［41］。例如，第一階段使用短周期細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)早期分化階段的影響；第二階段用長(zhǎng)周期細(xì)胞胚胎毒性試驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)晚期分化階段的影響；第三階段使用胚胎試驗(yàn)，根據(jù)胚胎的分子和形態(tài)變化檢測(cè)藥物胚胎毒性。

生殖毒性評(píng)價(jià)是涉及親代兩性、多階段的復(fù)雜問(wèn)題，體外替代試驗(yàn)因預(yù)測(cè)模型相對(duì)簡(jiǎn)單，也存在體內(nèi)外代謝差異等一定的局限性，但體外替代試驗(yàn)具有便捷高效的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)隨著各種新技術(shù)的出現(xiàn)以及人們對(duì)試驗(yàn)節(jié)點(diǎn)拆分組合的思考，體外替代試驗(yàn)在實(shí)踐中也有了新的改進(jìn)和發(fā)展，也將會(huì)越來(lái)越多地用于藥物篩選、補(bǔ)充試驗(yàn)和機(jī)制研究。