全身暴露動態吸入一氧化二氮對清醒大鼠電生理指標的影響

張彥瑾，劉宇軒，單煜恒，聶志勇，王永安

（1.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2.解放軍總醫院第一醫學中心神經內科，北京 100853）

一氧化二氮（nitrous oxide，N2O）俗稱“笑氣”，是使用最廣泛的麻醉劑［1］，因麻醉效力低，早期在牙科手術中常作為麻醉輔助劑與其他麻醉藥聯用［2］。由于吸入N2O可引起成癮、致幻和欣快感［3］，N2O已成為一種濫用的吸入藥物［4］。根據2016年全球藥物調查結果［5］，N2O已經成為第七大最常濫用的藥物。濫用N2O可中毒，最終出現不可逆的神經損傷，但其致傷機制仍不明確。近年來，N2O濫用在我國也越來越嚴重，臨床病例逐漸增加。因此，開展N2O吸入致傷效應、機制及防治措施研究具有重要意義。建立N2O全身暴露動態吸入裝置，是實現模擬N2O吸入評價的支撐和基礎。

N2O的致幻和致欣快作用與腦電和心電等電生理指標密切相關。電生理遙測技術可從有意識自由活動的機體中獲取生物信號，經接收器將模擬頻率信號轉換成可分析的電生理信號［6］。無線遙測技術可最大程度地減少實驗環境的干擾，還原機體真實的生理體征變化，現已被應用于多種實驗動物進行血壓［7］、心率、心電圖（electrocardiogram，ECG）、腦電圖（electroencephalogram，EEG）［8］和體溫等數據的采集。因而，建立模擬N2O動態吸入暴露的裝置，并實現與損傷效應實時評價（如電生理遙測）技術的聯用，是探討吸入N2O對大鼠產生影響的一種有效手段。

目前，對于吸入N2O如何致大鼠電生理指標變化仍不清楚，大多是基于N2O與其他鎮靜和麻醉藥物同時使用情況下的研究［9］，可能改變或混淆N2O特有的生理學特征。本研究通過建立全身暴露動態吸入N2O裝置并與電生理遙測技術聯用，對清醒自由活動大鼠血壓、體溫、心電以及腦電進行數據采集和分析，考察吸入N2O對大鼠電生理指標的影響，探討N2O致傷機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

SD大鼠，雄性，體重200～220 g，購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK（京）2016-0006，飼養在恒溫動物房中（約25℃），12/12 h光黑交替，自由進食標準顆粒飼料及飲水。手術前12 h禁食，麻醉后進行遙測植入子的植入手術，手術后單籠飼養，待其恢復后進行N2O吸入實驗。本研究涉及與動物相關的內容和程序都遵循軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物倫理委員會的規定（編號：IACUC-2020-108）。N2O（純度：99.999%），北京北氧聯合氣體有限公司；O2（純度：99.999%），北京環宇京輝京城氣體科技有限公司；注射用青霉素鈉（批號：0171909304），中諾藥業（石家莊）有限公司；戊巴比妥鈉（批號：140828），國藥集團化學試劑有限公司；0.9%氯化鈉注射液（批號：2006103205），石家莊四藥集團有限公司；碘伏（批號：200621），山東利爾康醫療科技股份有限公司。單臂數顯腦立體定位儀（ZS-FD），北京眾實迪創科技發展有限責任公司；DSI植入式生理信號無線遙測系統〔包括TL11M2-C50-PXT型植入子、TL10M3-F50-EEE型植入子、RPC信號接收器（RPC-1）、環境壓力參考裝置（APR-1）、數據交換矩陣（DEM 6607）、Ponemah Physiology Platform電生理數據采集分析系統以及Neuroscore腦電信號分析系統〕，美國DSI公司；流量控制器（Red-y smart）和GET RED-y 5氣體流速控制系統，瑞士福特林公司；DACO控制軟件和空氣壓縮機（GX4 FF），德國TSE公司。

1.2 大鼠全身暴露動態吸入裝置的構建

首先建立全身暴露動態吸入N2O裝置（圖1），包括氣體供給單元、動物暴露單元、氣體過濾處理單元和控制單元等。氣體供給單元包括空氣壓縮機、N2O氣體鋼瓶和O2氣體鋼瓶等。動物暴露單元是指用于動物吸入及氣體濃度監測的暴露艙，其采用符合空氣動力學原理的圓錐體結構設計，能夠使氣體得到均勻的釋放，且整個暴露艙體積約為15 L，可使氣體快速達到平衡；暴露艙上端設有進氣口、采樣口、傳感檢測器接口等，下端設有出氣口，并預留電生理遙測接收器所需空間，暴露艙采用電生理遙測信號能夠穿透的有機玻璃（聚甲基丙烯酸甲酯）構建，保證了與電生理遙測儀的聯用。氣體過濾處理單元包括真空泵及廢氣吸附與凈化器等，其中真空泵用于將暴露艙內氣體抽出，以形成動態的氣體吸入（給藥）環境，廢氣吸附與凈化器用于氣體凈化。控制單元包括流量控制器及多通轉接頭等，用于氣體流速和流量精準控制。

Fig.1 Schematic diagram of nitrous oxide（N2O）whole-body dynamic inhalation exposure device for rats.

1.3 遙測模型的制備

1.3.1 心電和血壓遙測模型

使用TL11M2-C50-PXT型植入子，在潔凈保溫無菌環境下，大鼠ip給予2%戊巴比妥鈉60 mg·kg-1麻醉，切開腹部皮膚和肌肉，分離腹主動脈，將血壓導管插入腹主動脈內，將2根心電電極的正極置于大鼠劍狀軟骨左側1.5～2.0 cm處的肌肉表面，負極置于大鼠右側胸肌部位肌肉表面，調整心電電極線長度，用結扎線固定于相應位置。縫合皮膚，碘伏消毒。

1.3.2 腦電遙測模型

使用TL10M3-F50-EEE型植入子，大鼠采用1.3.1方法麻醉大鼠后固定于腦立體定位儀上，切開背部皮膚，將腦電植入子固定于皮下；切開頭部皮膚，在矢狀縫左側約2 mm，分別距前鹵下方、后鹵上方各約2 mm處將1導聯的1對電極彎曲放置在左鉆孔內；在矢狀縫右側約2 mm，分別距前鹵上方約2 mm和距冠狀縫和人字縫中點位置，將2導聯1對電極彎曲放置在右側鉆孔內；調整3導聯的1對電極線長度，用結扎線固定于頭夾肌相應位置。縫合皮膚，碘伏消毒。

1.3.3 術后恢復

手術后，置大鼠于保溫狀態下直至完全蘇醒。所有大鼠均單獨飼養，并ip給予青霉素鈉（用氯化鈉注射液配成母液2×108U·L-1）4×105U·kg-1，每天1次，連續3 d，待存活大鼠恢復正常狀態（一般在術后1周）、初步測試可獲取相應信號后，分組進行后續實驗。

1.4 全身暴露動態吸入N2O

將心電、血壓模型大鼠和腦電模型大鼠各分為4組，分別為空氣對照組及30%，50%和70% N2O組，每組5只，染毒流速設置見表1。將模型大鼠置于染毒暴露艙中，通入空氣使其適應環境，監測數據變化，待大鼠各生理指標處于正常穩定狀態后，以每分種采集1次的頻率，連續采集6 h（吸入前2 h、吸入2 h、吸入后2 h）的行為狀態及血壓、體溫、心電和腦電參數等生理數據。

核電站址資源豐富，開發潛力大，是廣東省未來能源需求的重要來源。考慮目前已明確核電項目廠址按照每個廠址6臺機組規模，后續新增核電暫按單機1 250 MW，以上廠址可裝機36 GW。另外，廣東省還儲備了一批核電廠址，按照每個廠址4臺機組規模，后續新增核電暫按單機1 250 MW，以上廠址可裝機20 GW。

Tab.1 Flow rate of nitrous oxide inhalation exposure

1.5 數據提取和指標分析

基于采集到的電生理數據，利用Ponemah Physiology Platform軟件重點對心電、血壓遙測模型大鼠的心率（heart rate,HR）、R波、P波、T波、QT間期、QRS間期、PR間期、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）以及體溫（temperature，T）等數據進行提取和分析。利用Neuroscore軟件，重點對腦電遙測模型大鼠進行功率譜分析，首先提取δ波（0.5～4 Hz）、θ波（4～8 Hz）、α波（8～12 Hz）、β波（12～30 Hz）和γ波（30～48 Hz）波段的絕對功率，而后進行相對功率的分析。相對功率（%）=各功率帶（δ，θ，α，β和γ）的絕對功率/功率總和（δ+θ+α+β+γ）×100%。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 吸入N2O對大鼠行為的影響

吸入N2O后，大鼠變得警覺、急躁，出現站立攀爬現象，隨后出現后肢無力，無法站立、頻繁甩動前肢情況；停止通入N2O后約5 min恢復正常狀態。

2.2 吸入N2O對大鼠血壓和體溫的影響

與空氣對照組相比，30% N2O組大鼠血壓在吸入N2O過程未出現明顯變化；50%組和70% N2O組吸入開始后大鼠SBP（圖2A）、DBP（圖2B）和MAP（圖2C）均上升（P＜0.05），且隨N2O濃度的增加而增加（r分別為0.897，0.932和0.916）。由實時監測血壓圖（圖2D）也可看出，與空氣對照組相比，吸入N2O大鼠血壓隨N2O吸入濃度的增加而增加。

Fig.2 Blood pressure in response to nitrous oxide in rats.Rats were exposed to air,30%,50% and 70% N2O separately，and data were collected once per minute for continuous 6 h.-120-0 min，2 h before inhalation of N2O；0-120 min，inhaled N2O for 2 h；120-240 min，2 h after inalation of N2O.A：systolic blood pressure（SBP）recorded for 6 h.B：diastolic blood pressure（DBP）recorded for 6 h.C：mean arterial pressure（MAP）recorded for 6 h.D：typical graph of blood pressure（BP）changes in 2 sec.1 mmHg=0.133 kPa.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding air control group.

圖3中可以看出，與空氣對照組相比，30% N2O組大鼠T未出現顯著性差異；50%和70% N2O組T顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），且T隨N2O吸入濃度的增加而降低（r=-0.970）；吸入結束后，T均逐漸恢復至正常狀態。

Fig.3 Effect of nitrous oxide inhalation on body temperature of rats.See Fig.2 for the rat treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding air control group.

2.3 吸入N2O對大鼠心電指標的影響

與空氣對照組相比，30% N2O組大鼠各心電指標在吸入N2O過程中均無明顯變化；50%和70% N2O組心率、R波、P波和T波均顯著上升（P＜0.05）（圖4A～D），且隨N2O濃度的增加而增加（r分別為0.955，0.950，0.932和0.908）；QT間期顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）（圖4E），且隨N2O濃度增加而降低（r=-0.949）；QRS間期和PR間期均未出現顯著變化（圖4F和G）。從圖4A可以看出，50%和70% N2O組大鼠心率在吸入開始后出現上升；吸入N2O約40 min達最高值，隨后保持穩定；吸入結束后約10min恢復正常水平。由大鼠心電圖（圖4H）可見，與空氣對照組相比，隨N2O濃度的增加，大鼠心率間期縮短、心率加快，同時R波、P波和T波振幅增加（圖4B～4D）。

Fig.4 Electrocardiogram activity in response to nitrous oxide in rats.See Fig.2 for the rat treatment.A：HR（heart rate）；B：R wave；C：P wave；D：T wave；E：QT interval；F：QRS interval；G：PR interval；H：voltage.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，com?pared with corresponding air control group.

2.4 吸入N2O對大鼠腦電指標的影響

Fig.5 Electroencephalogram activity in response to nitrous oxide in rats.See Fig.2 for the rat treatment.A1-E1：repre?sentative waveforms of δ，θ，α，β and γ wave，respectively.A2-E2:absolute power values of waves in A1-E1.Relative power（%）=P（δ，θ，α，β，γ）/P（δ+θ+α+β+γ）×100%.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding air control group.

3 討論

本研究基于空氣動力學原理、采用可被電生理遙測信號穿透的有機玻璃，成功建立了大鼠全身暴露動態吸入N2O模型與電生理遙測的聯用系統，為吸入N2O致傷機制提供了技術平臺和支撐。另外，本研究考慮到雌性大鼠有發情周期，激素的周期性變化可能會對電生理指標產生影響，為保證單一變量并排除無關因素的影響，本研究選擇雄性大鼠作為實驗對象。

N2O致心率和血壓升高現象可能是因為N2O作為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑，可以抑制γ-氨基丁酸（γ-amino?butyric acid，GABA）能神經元上的NMDA受體，使GABA能抑制作用下調［10］，激活多巴胺（dopamine，DA）能神經元興奮性信號傳導途徑，從而激活腦內獎賞系統，使中腦邊緣系統DA濃度增加而產生欣快感［11］。腦內DA激動交感神經，使交感神經興奮，易引起心率加快、血壓升高［12］，這與本研究結果相符。另外，QT間期代表心室開始興奮去極化至完全復極化所經歷的時間，QT間期的長短與心率呈負相關，即心率越快，QT間期越短，也進一步驗證了大鼠吸入N2O使心率加快。而腦內DA濃度增加可能也是吸入N2O致成癮的重要生物學基礎［13］。

吸入N2O后大鼠體溫降低。NMDA受體是谷氨酸受體的一個亞型，是配體門控受體復合物，參與學習記憶、體溫調節［14］、神經退行性疾病等許多過程。NMDA受體與下丘腦中的溫度敏感神經元密切相關，并通過內源性谷氨酸敏感系統來調節體溫［15］。N2O作為NMDA受體拮抗劑則通過阻斷NMDA谷氨酸能受體，從而導致體溫的下降。

大腦節律性神經活動被認為在認知中起著基礎性的作用，腦電圖活動以特定的頻段與認知功能進行聯系［16］。在腦電圖的不同腦電頻段中，θ波段的腦電活動與記憶能力的關系最為密切［17］。本研究結果表明，大鼠吸入N2O后，θ波出現升高，并隨著N2O濃度的增加而增加，表明大鼠吸入N2O可能對記憶能力造成影響。α波活動與記憶和注意力相關［18］，并隨著意識的喪失而出現α波消失現象。本研究結果表明，大鼠吸入N2O后，α波隨著N2O濃度的增加而下降，這與Yamamura等［19］報道的受試者吸入N2O致α波的振幅和頻率降低一致。β波被認為在感覺運動功能和注意力的維持中發揮作用［20］，γ波與感覺和非感覺區域的注意力和記憶有關［21］，且β波和γ波振幅均與學習記憶功能呈正相關。本研究結果表明，大鼠吸入N2O后β波和γ波均降低，并隨著N2O濃度的增加而下降，表明吸入N2O可能會降低大鼠的學習和記憶能力。因此，大鼠吸入N2O后引起不同腦電頻段的變化可能與吸入N2O致認知障礙有關。

綜上，N2O吸入可致大鼠心率和血壓升高、體溫下降，對腦電波的節律性振蕩產生改變，均可能與N2O致成癮性和認知障礙密切相關。