天麻活性成分20C對6-羥基多巴胺誘導的PC12細胞損傷及帕金森病模型小鼠的保護作用

杜雨生，張 釗，何 新，3，陳乃宏

（1.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是以黑質-紋狀體系統多巴胺（dopamine，DA）能神經元進行性退變為主要病理特征的神經退行性疾病，臨床表現為震顫和肌強直等運動癥狀以及嗅覺減退和睡眠障礙等非運動癥狀，尚無理想的治療方法，給患者及家庭帶來沉重的負擔［1］。年齡因素是PD患病的重要的危險因素，65歲以上人群PD患病率隨年齡的增加而上升［2］。隨著我國人口老齡化的到來，PD患者會持續增加，必將對社會造成嚴重的經濟負擔。

天麻（Gastrodiae Rhizoma）為我國傳統中藥，可用于治療頭痛眩暈、驚厥抽搐、手足不遂等病癥。在治療PD的常用中藥復方中，天麻常作為復方的核心藥物［3］。現代藥理實驗結果表明，天麻能夠改善PD模型動物黑質和紋狀體病理損傷及行為學障礙［4］。天麻活性成分20C（簡稱20C）是天麻中的一種聯芐類化合物。本實驗室前期研究發現，20C能夠改善魚藤酮誘導的PC12細胞氧化應激損傷，抑制細胞凋亡［5-6］，改善衣霉素誘導的PC12細胞內質網應激損傷［7］，并可對脂多糖誘導的BV2細胞炎癥模型產生抗炎作用［8］，顯示出很好的神經保護作用。20C能夠改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）小鼠模型黑質和紋狀體的病理損傷及行為異常，減少異常α突觸核蛋白的聚集及炎癥反應［9］。但20C對PD軸突逆行性損傷是否具有改善作用尚未見報道。6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）可通過DA轉運體進入DA能神經元，在胞質中引起細胞氧化應激損傷［10］。本研究應用6-OHDA誘導PC12細胞氧化損傷，并采用小鼠單側紋狀體腦立體定位注射6-OHDA的方法制備小鼠PD模型，分別檢測20C對PC12細胞氧化損傷和PD模型小鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

20C（化學結構見圖1）由中國醫學科學院藥物研究所植化室合成，純度98%，溶于二甲亞砜，母液濃度為 10 μmol·L-1；左旋多巴（levodopa，L-dopa）片（每片0.25 g，批號161201），北京曙光藥業有限責任公司；RPMI Medium 1640培養基，美國Gibco公司；6-OHDA（162957-50 MG）、抗壞血酸（A4544-25G）、二甲亞砜、MTT和小鼠抗合成β肌動蛋白N端肽單克隆抗體（F3022）均購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白，瑞士Roche公司；小鼠抗人源酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）單克隆抗體（sc-25269），美國Santa Cruz公司；小鼠抗8-羥基鳥苷-牛血清白蛋白-酪蛋白偶聯物單克隆抗體（ab62623），美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗），美國KPL公司；DAB顯色劑，北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑和ECL發光液，北京普利萊基因技術有限公司；Hoechst 33342，日本DojinDo Labo?ratories公司；綠色熒光標記驢抗小鼠IgG抗體（二抗），美國Life Technologies公司。

Fig.1 Chemical structure of 20C

超純水儀（型號Direct Q-8），美國Millipore公司；超低溫保存箱（型號DW-86L388A），中國Haier公司；電子天平（型號ME104），瑞士Mettmer Toledo公司；冷凍離心機（型號2-16PK），美國Sigma公司；酶標儀（型號1510），美國Thermo Fisher Sci?entific公司；顯微鏡（型號BX51），日本Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡（型號LSM 710），德國Zeiss公司；倒置相差顯微鏡（型號Eclipse Ti-U），日本Nikon公司；腦立體定位儀（型號SA301），中國瑞沃德生命科技有限公司；冰凍切片機（型號CM3050S），德國Leica公司；化學發光成像分析儀（型號LAS 4000），美國GE公司；透射電子顯微鏡（型號H-7650），日本Hitachi公司。

1.2 細胞實驗

1.2.1 細胞培養

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤（PC12細胞），購自美國Type Culture Collection公司。PC12細胞使用含5%胎牛血清和10%馬血清的1640培養基，在37℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養，每3 d傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測PC12細胞存活率

PC12細胞以1.5×108L-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL，24 h后單獨加入6-OHDA 100 μmol·L-1（模型組）或同時加入 6-OHDA 100 μmol·L-1和20C（0.01，0.10 或1.00 μmol·L-1，模型+20C 組），孵育6 h后小心吸去培養基，每孔加入新鮮培養基100 μL，同時每孔加入5 g·L-1的MTT 10 μL，置細胞培養箱，4 h后，每孔加三聯液（十二烷基磺酸鈉0.1 kg·L-1，HCl 0.01 mol·L-1，5% 異丙醇）100 μL，置細胞培養箱，次日，在酶標儀570 nm波長下檢測吸光度值（A570nm）。重復實驗3次，每組每次設置3個復孔。存活率（%）=各組平均吸光度值/細胞對照組平均吸光度。

1.2.3 免疫熒光染色檢測細胞DNA和RNA氧化損傷

將圓形玻璃蓋玻片放入24孔板中，每孔加入PC12細胞懸液500 μL，細胞密度1.5×108L-1；培養24 h后加6-OHDA 100 μmol·L-1（模型組），或同時給予 6-OHDA 100 μmol·L-1和 20C 1.00 μmol·L-1（模型+20C組）每組3復孔，孵育6 h后棄去培養基，PBS清洗；4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗；0.5%曲拉通X-100透化7 min，PBS清洗；5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min；小鼠抗8-羥基鳥苷-牛血清白蛋白-酪蛋白偶聯物單克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜，PBS清洗；用熒光素標記綠色熒光標記驢抗小鼠 IgG抗體（二抗）孵育2 h，Hoechst 33342染細胞核，PBS清洗后封片。使用激光共聚焦顯微鏡獲得熒光圖片，Image-Pro Plus 6.0軟件計算平均熒光強度，反映細胞DNA和RNA氧化損傷程度。

1.3 動物實驗

1.3.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，體重24～26 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0002。動物飼養于12 h：12 h晝夜交替空調房內，室溫23～25℃，濕度50%～60%，自由進食飲水，動物適應1周后開始實驗。所有實驗遵循中國醫學科學院藥物研究所實驗動物管理與動物福利倫理委員會規定（編號：00005246）。

1.3.2 小鼠單側紋狀體雙位點腦立體定位注射

腦定位注射參考Cheng等［11］的方法，注射位點的確定參考小鼠腦立體定位圖譜［12］。小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，6-OHDA溶液濃度為3 g·L-1（使用0.02%抗壞血酸生理鹽水溶解），左側紋狀體注射位點1：前囟前1.0 mm，中線左旁開2.1 mm，硬膜下2.9 mm；注射位點2：前囟后0.3 mm，中線左，旁開2.3 mm，硬膜下2.9 mm。每位點注射2 μL，注射速度為0.5 μL·min-1，留針4 min。

1.3.3 實驗分組和給藥

小鼠腦定位注射后休息3周，第4周開始分組給藥。小鼠分為正常對照組（按照1.3.2方法注射等體積生理鹽水）、模型組（按照1.3.2方法注射6-OHDA造模）、模型+L-dopa組（造模后第4周開始ig給予L-dopa 40 mg·kg-1）和模型+20C組（造模后第4周開始ig給予20C 100 mg·kg-1［9］），每組8只。L-dopa和20C均以0.5%羧甲纖維素鈉配制成均一混懸液，給藥容積為0.01 mL·g-1；正常對照組和模型組ig給予同體積溶劑。每天相同時間給藥1次，連續給藥4周。

1.3.4 免疫組化染色法觀察紋狀體和黑質區TH表達

小鼠分組給藥（同1.3.3）后麻醉，灌流，取腦，在冰凍切片機上將紋狀體和黑質部位切取厚度為20 μm的組織切片。使用枸櫞酸鹽緩沖液對紋狀體和黑質組織冰凍切片進行高溫抗原修復10 min，冷卻至室溫，PBS清洗3次；0.5%曲拉通X-100透化15 min，PBS清洗3次；3% H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min，PBS清洗3次；5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min，加抗TH抗體（1∶500）4℃孵育過夜；含0.1%吐溫20的PBS（PBS-T）溶液清洗3次；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（二抗）（稀釋比例1∶400）室溫孵育2 h，PBS-T溶液清洗3次；DAB顯色，自來水終止顯色，梯度脫水、中性樹脂封片。使用Olympus BX51顯微照相系統拍照。

1.3.5 Western印跡法檢測黑質TH蛋白表達水平

取分組給藥（同1.3.3）后的小鼠注射側的黑質組織，稱重，組織勻漿機勻漿，組織裂解液冰浴裂解30 min，冷凍離心機4℃，12 000×g離心30 min，吸取上清液，用BCA法進行蛋白質定量。剩余上清液中加入上樣緩沖液，100℃水浴變性10 min，-20℃保存。10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，之后蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜，用3%牛血清白蛋白溶液室溫封閉2 h，加入一抗〔TH（1∶500）、β-肌動蛋白（1∶5000）〕，4℃孵育過夜。用TBS-T溶液洗滌3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（二抗）（1∶5000）室溫孵育2 h，TBS-T溶液洗滌3次，每次10 min；化學發光成像分析儀顯示蛋白條帶；Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。

1.3.6 透射電鏡檢測黑質區神經元超微結構損傷

小鼠分組給藥（同1.3.3）后麻醉，灌流，取腦，在黑質部位切取1 mm3立方體，用2.5%戊二醛固定2 h；用PBS溶液洗滌，1%四氧化鋨浸泡2 h；多次水洗后，在乙醇梯度下脫水，嵌入Epon樹脂中；切成半薄切片，美藍-天青染色，在光學顯微鏡下選取電鏡所要觀察的位置，并將其切成50～60 nm的超薄切片；超薄切片經乙酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察黑質區神經元超微結構損傷。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 20C對6-OHDA處理的PC12細胞存活率的影響

MTT法檢測結果（表1）顯示，與細胞對照組比較，模型組細胞存活率顯著下降（P＜0.01）；模型+20C 0.10 和 1.00 μmol·L-1組細胞存活率顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of 20C，an active ingredient of Gastrodiae Rhizoma，on cell viability of PC12 cells treated with 6-hydroxydopamine（6-OHDA）by MTT assay

2.2 20C對6-OHDA處理的PC12細胞DNA和RNA氧化損傷的影響

細胞免疫熒光結果（圖2）顯示，PC12細胞6-OHDA造模6 h后，模型組細胞平均熒光強度顯著高于細胞對照組（P＜0.01），提示細胞DNA和RNA氧化損傷明顯；與模型組比較，模型+20C 1.00 μmol·L-1組細胞平均熒光強度顯著降低（P＜0.05），提示細胞DNA和RNA氧化損傷明顯緩解。

Fig.2 Effect of 20C on DNA and RNA oxidative damage of PC12 cells treated with 6-OHDA by immunofluorescence assay.PC12 cells were exposed to 6-OHDA 100 μmol·L-1and simultaneously given 20C 1.00 μmol·L-1for 6 h.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3 20C對6-OHDA誘導的PD模型小鼠黑質和紋狀體TH表達的影響

免疫組化染色結果（圖3）顯示，TH陽性表達區域呈棕色。模型組小鼠注射側黑質和紋狀體TH陽性區域減少；而模型+20C組和模型+L-dopa組TH陽性區域增加，提示20C能夠緩解6-OHDA引起的小鼠黑質和紋狀體病理損傷。

Fig.3 Effect of 20C on tyrosine hydroxylase（TH）positive expresion of substantia nigra(A)and striatum(B)in 6-OHDA-induced Parkinson disease(PD)model mice by immunohistochemical staining.Mice were divided into normal control，model，model+levodopa（L-dopa，40 mg·kg-1）and model+20C（100 mg·kg-1）groups.Mice were double site injected with 6-OHDA into the unilateral striatum to establish the PD model，except for those in normal control group.Three weeks later，L-dopa and 20C groups were ig given once per day for 4 weeks.

2.4 20C對6-OHDA引起的PD模型小鼠黑質多巴胺能神經元逆行損傷的影響

Western印跡結果（圖4）顯示，模型組小鼠黑質區TH蛋白表達水平較正常對照組顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，模型+20C組TH蛋白表達顯著增加（P＜0.05），而模型+L-dopa組無明顯變化；與模型+L-dopa組相比，模型+20C組小鼠黑質區TH蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。提示20C能夠緩解6-OHDA引起的小鼠黑質區TH陽性神經元的逆行損傷。

Fig.4Effect of 20C on TH expresion of substantia nigra in 6-OHDA-induced PD model mice by Western blotting.See Fig.2 for the mouse treatment.B was the semiquantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group；ΔP＜0.05，compared with model+L-dopa group.

2.5 20C對6-OHDA引起的PD模型小鼠黑質區神經元超微結構損傷的影響

透射電鏡結果（圖5）顯示，模型組小鼠黑質區神經元核膜皺縮，電子密度較高，細胞周圍腫脹；而模型+L-dopa組和模型+20C組小鼠黑質區神經元核膜較完整，電子密度變化和細胞周圍腫脹均不明顯，提示20C能夠改善6-OHDA模型小鼠黑質區神經元超微結構的損傷。

Fig.5 Effect of 20C on neuron ultrastructural damage of substantia nigra in 6-OHDA-induced PD model mice by transmission electron microscopy.See Fig.3 for the mouse treatment.The nuclear membrane（black arrows）of neurons of model mice appeared shrunken and incomplete，and the surround?ing cells were swollen（red arrows）.

3 討論

氧化應激被認為與PD發生發展有密切關系［13］。研究發現，DA在胞內蓄積后會進一步氧化產生毒性產物，對神經元造成損害是PD患者DA能神經元產生氧化應激損傷的最主要原因［14］，并且DA氧化后的毒性產物中存在6-OHDA。本研究通過6-OHDA誘導的PC12細胞模型發現，與模型對照組比較，20C能夠提高PC12細胞的存活率，緩解PC12細胞氧化應激損傷，初步驗證了20C對6-OHDA誘導的PC12細胞具有保護作用。

本研究通過單側紋狀體注射6-OHDA建立PD小鼠模型，模擬臨床PD患者病理進程中由紋狀體DA能神經末梢向黑質DA能神經元胞體的逆行性損傷過程，反映PD患者臨床病理改變進程［10］。TH為DA合成的限速酶，是檢測DA能神經元損傷的標志物。小鼠紋狀體損傷檢測結果表明，PD模型小鼠紋狀體明顯損傷，TH陽性面積縮小；20C能阻止紋狀體TH陽性面積的減少，改善紋狀體損傷。小鼠黑質損傷檢測結果表明，PD模型小鼠黑質表現出明顯的逆行性損傷，TH陽性神經元丟失；20C能減少黑質區TH陽性神經元的丟失，提高TH蛋白表達水平。以上結果表明，20C對黑質-紋狀體系統DA能神經元逆行性損傷具有改善作用。此外，通過觀察黑質區神經元超微結構發現，PD模型小鼠部分黑質神經元結構嚴重受損，而20C可使黑質區結構受損的神經元數量減少，改善6-OHDA導致的黑質神經元超微結構損傷。

綜上所述，20C能夠降低6-OHDA誘導的PC12細胞死亡率及氧化損傷，并改善6-OHDA誘導的PD模型小鼠黑質和紋狀體的病理損傷，其深入機制有待進一步研究。