人輪狀病毒疫苗研究進展

王 俊，聞曉波，冉旭華

輪狀病毒(rotavirus, RV)屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬成員，是引起嬰幼兒及幼齡動物輪狀病毒性腹瀉的主要病原體[1]，臨床癥狀為嘔吐、腹瀉、脫水，嚴重的可造成死亡。輪狀病毒在全球感染廣泛，據統計，全球每年超過20萬嬰幼兒、兒童死于輪狀病毒感染相關性疾病，其中在發展中國家5歲以下兒童死亡人數占總死亡數的85%，造成了巨大的經濟和社會負擔[2]。目前尚無特效藥物對輪狀病毒性腹瀉進行治療，只能通過疫苗進行預防。因此，研發安全、高效的疫苗對預防和控制輪狀病毒性疾病的發生以及降低經濟損失具有重要意義。本文根據目前各國學者的研究結果對國內外輪狀病毒疫苗的研究現狀做一綜述，為輪狀病毒疫苗研發相關工作提供一定的參考。

1 輪狀病毒概況

輪狀病毒為二十面體對稱的雙鏈RNA病毒，直徑約70 nm，無囊膜，完整的具有感染性的病毒粒子為三層衣殼結構，其中最內層衣殼由VP1、VP2、VP3蛋白構成，中間層由VP6構成，最外層由VP4、VP7構成。輪狀病毒基因組約為18 555 bp，由11個節段組成，編碼6種結構蛋白和5種或6種非結構蛋白(VP1～VP4，VP6，VP7，NSP1～NSP5或NSP6)[3-4]。其中結構蛋白VP4為纖突蛋白，具有黏附細胞的功能，在富含胰蛋白酶的腸道環境中可裂解為VP5*和VP8*；VP7糖蛋白為主要的中和抗原，具有CTL識別的抗原決定簇，同時能夠調節細胞膜Ca2+濃度，改變細胞膜通透性。VP6可刺激機體產生IgA，IgA與多聚免疫球蛋白受體結合并轉運至腸腔，轉運中與雙層病毒顆粒結合抑制輪狀病毒的轉錄和復制，也為輪狀病毒候選疫苗的研究提供了方向。

輪狀病毒根據血清學分類方法，可將已鑒定出的輪狀病毒毒株可分為A～J 10個群，引起嬰幼兒和幼齡動物腹瀉主要為A群[5-7]。外衣殼蛋白VP4、VP7與中和抗體的反應性決定了輪狀病毒的血清型，根據外衣殼蛋白VP4、VP7的抗原性，又可將A群輪狀病毒分為P血清型(protease sensitive)和G血清型(glycoprotein)[8-9]。最新研究表明，目前已鑒定出可感染人和動物的血清型中，有32種G血清型和47種P血清型[10]。

2 輪狀病毒現有疫苗概況

鑒于輪狀病毒的高發病率和高死亡率，世界衛生組織(WHO)建議接種輪狀病毒疫苗來預防輪狀病毒性腹瀉。目前使用的輪狀病毒疫苗主要有：Rotarix、RotaTeq、Rotavac、ROTASIIL、Rotavin-M1、LLR。其中前4種已通過WHO的使用資格預審。截至2018年底，全球已有92個國家將Rotarix或RotaTeq輪狀病毒疫苗納入其國家免疫計劃，另有6個國家分階段或在個別地區實施了疫苗免疫計劃。另外，在國家免疫計劃中，74個國家選擇Rotarix單價疫苗，14個國家使用RotaTeq五價疫苗；9個國家同時使用Rotarix和RotaTeq[11-12]。隨著研究的不斷深入，輪狀病毒疫苗種類也開始逐漸增加，出現了如非復制型的新型疫苗，但此類疫苗正處于臨床試驗階段，未真正投入市場。

2.1Rotashield 四價基因重配苗Rotashield是最早用于預防人輪狀病毒性腹瀉的疫苗，該疫苗由恒河猴輪狀病毒(RRV, G3血清型)與恒河猴-人輪狀病毒重配株(G1、G2、G4血清型)組成[13]，1998年在美國上市。相關試驗表明，該疫苗對重癥輪狀病毒性腹瀉保護率為69%～90%，對所有輪狀病毒性腹瀉保護率為49%～68%，但該疫苗在使用中發現與腸套疊等安全性問題存在相關性，于1999年被召回[14]。至此，人輪狀病毒疫苗出現了多年空窗期。

2.2Rotarix Rotarix是比利時葛蘭素-史克(GlaxoSmithKline, GSK)公司研制的口服減毒活疫苗，Rotarix的毒株為RIX444(G1P[8])，經89-12親代株傳代而來，用于預防6～24周齡嬰兒輪狀病毒引起的腹瀉[15-16]。免疫接種劑量為2劑，每劑間隔4周。該疫苗2005年在墨西哥上市并于2009年通過WHO的資格預審。

Malakalinga等[17]相關研究表明，坦桑尼亞5歲以下兒童接種Rotarix輪狀病毒疫苗后，輪狀病毒性腹瀉死亡率從2008年的72%下降到2013年的36%。相關研究表明，受營養水平、腸道菌群、微量元素、母源抗體水平、遺傳因素等因素影響[18]，該疫苗在發展中國家和發達國家的免疫效果也大有不同，在發達國家免疫效果較高，但在一些中等收入和低收入國家，疫苗的免疫效果較差。

Rotarix在使用中，也出現了問題。2010年Victoria等[19]在接種疫苗后嬰兒的糞便中檢測到了豬圓環病毒(porcine circovirus, PCV)1型DNA片段，盡管后續的研究中證實，Rotarix中污染的PCV-1，只是疫苗生產中的質量控制偶然事件，對免疫接種兒童不會造成嚴重的安全風險[20]，但是還是有必要進一步研究確認該疫苗潛在的安全性問題。

2.3RotaTeq RotaTeq是美國默克(Merck)公司開發于2006年上市，于2008年通過WHO資格預審的口服五價人-牛重配輪狀病毒減毒活疫苗[21]。用于預防6～32周齡嬰兒輪狀病毒引起的腹瀉，免疫接種劑量為3劑。

RotaTeq以牛輪狀病毒WC3株為基礎，通過基因重配，將人輪狀病毒毒株中編碼VP4和VP7的基因替代原毒株相應基因得到[22-23]。Sanneh等[24]對岡比亞人群使用RotaTeq疫苗前后輪狀病毒發病率進行比較，發現輪狀病毒發病率從2013年的22%下降到2015年的11%；對于臨床癥狀嚴重的患者，輪狀病毒發病率從2013年的33%下降到2015年的8%。2019年Mo等[25]對4 040名6～12周中國嬰兒進行了III期臨床研究，發現疫苗組的抗輪狀病毒IgA的幾何平均滴度和血清反應率高于對照組，并且RotaTeq和三價口服脊髓灰質炎病毒疫苗(tOPV)[26]和無細胞百日咳疫苗(DTaP)[27]同時使用時，RotaTeq對其他疫苗的免疫應答無影響。與Rotarix相似，RotaTeq的疫苗保護率存在著地區差異，對不同血清型和不同病情程度的輪狀病毒性腹瀉保護率也有所差異。大量的臨床試驗證實，RotaTeq疫苗的免疫效力似乎與國家經濟水平呈現一定的相關性，例如，該疫苗在發達國家具有較高的免疫效力[28-30]；然而在低收入國家，如非洲、東南亞等國家，該疫苗的免疫效力甚至低于50%[31-32]。

2010—2012年對該疫苗的監測中，Roy等[33]、Bucardo等[34]在嬰兒糞便中提取的RV A毒株中發現了RotaTeq衍生的NSP2基因，這表明RotaTeq疫苗株與流行野毒株之間進行了重組。2009年Laserson等[35]對RotaTeq在免疫缺陷人群中的安全性進行了評估，37名HIV感染的嬰兒中，5/21名(23.8%)疫苗接種者和2/16名(12.5%)安慰劑接種者出現了嚴重不良反應。疫苗組死亡8例，其中2例與輪狀病毒性胃腸炎有關；對照組死亡4例中3例與輪狀病毒性胃腸炎有關，但疫苗組不良反應發生率與對照組無統計學差異。然而此次評估中，免疫缺陷人群數量較少，不能全面評估疫苗對免疫缺陷人群的安全性。

2.4Rotavac Rotavac是由印度Bharat公司研制的一種單價液體冷凍減毒活疫苗。Rotavac應在嬰兒6周齡時開始口服免疫，共3劑，每劑間隔4周。Rotavac是一種獨特的輪狀病毒疫苗配方，無需緩沖即可使用。它可以在2 ℃～8 ℃下保存24個月。該疫苗在2014年上市，并于2018年通過WHO的資格預審，這也是繼Rotarix、RotaTeq通過資格預審后的10年內新一代通過資格預審的疫苗，目前只在印度和巴基斯坦使用，隨著研究不斷深入，相信不久能夠全球推廣。

Bhandari等[36]一項臨床試驗對該疫苗的有效性進行了評估，在免疫接種第1年里，疫苗的有效率為56.4%，第2年疫苗的有效率為49%。2020年，Bhandari等[37]對印度嬰兒接種Rotavac后出現腸套疊的風險評估發現，腸套疊在第1次免疫和第2次免疫后21天內的相對發病率(風險期發病率與對照之比)為1.56，在第3次免疫后的相對發病率為1.88，接種疫苗并沒有增加腸套疊風險。一系列的試驗和監測表明，該疫苗在嬰兒中安全有效，并且和其他輪狀病毒活疫苗無明顯差異，能夠安全有效地與其他嬰兒疫苗同時使用，不會干擾其他疫苗的免疫應答，有望成為下一個全球使用的疫苗。然而，對于該疫苗潛在的安全性問題，目前只有少數腸套疊的報道，沒有足夠證據來評估其與腸套疊的相關性，不能準確判斷其風險，仍然需要大量試驗來進一步的評估和監測。疫苗目前采用的是冷鏈運輸和儲存，這一過程涉及儲存、運輸、配送等各種物流問題，而由于疫苗儲存和運輸設施的不足，會造成疫苗的大量浪費，使疫苗的成本大幅上升。因此國家在推廣疫苗時，不僅要考慮疫苗成本，還需考慮冷藏設施的運輸成本和相關人員服務費用，尤其是在農村地區受電力供應影響情況下的成本。

2.5ROTASIIL ROTASIIL是印度血清研究所研制的牛-人輪狀病毒五價減毒活疫苗，其血清型包含G1，G2，G3，G4和G9。ROTASIIL為凍干粉劑，可在37 ℃穩定保存18個月，并且能夠短期暴露于55 ℃的環境中，使用方便，只需在口服之前添加檸檬酸-碳酸氫鹽緩沖液[38]。該疫苗免疫方法與Rotavac相同，6周齡時開始首免，共3劑，每劑間隔4周。ROTASIIL在2018年通過WHO的資格預審，目前只在印度使用。

兩項III期臨床試驗對ROTASIIL的有效性進行了評估。在印度，該疫苗對重癥輪狀病毒性腹瀉保護率為54.7%～60.5%，對所有輪狀病毒性腹瀉保護率為36%～39.5%。在尼日爾，針對重癥輪狀病毒性腹瀉，疫苗的保護率為67%，與對照組相比，疫苗組的不良事件發生率無統計學差異[39-40]。因此，ROTASIIL是一種安全有效的疫苗。由于ROTASIIL使用的局限性，目前不能準確判斷其潛在風險，不同地區存在不同的檢測結果，仍需大量試驗表明其真正安全有效，才能商品化銷售。由于該疫苗是一種減毒活疫苗，所以維持抗原的生物學結構是疫苗免疫的關鍵。冷凍干燥能夠保持抗原的結構和性狀，防止疫苗成分之間不必要的化學反應，并根據儲存溫度延長保存期，但是凍干會破壞疫苗的穩定性，使約40%的病毒失去活性[41]。檸檬酸-碳酸氫鹽緩沖液的加入能維持pH，提高抗原蛋白的緩沖密度，從而形成分子間氫鍵，在凍干的過程中維持抗原的結構和性質。但是這一進展并未改善冷鏈儲存和運輸方面的問題。

2.6Rotavin-M1 Rotavin-M1是越南研究人員從一名兒童身上分離的G1P[8]株制成的冷凍減毒活疫苗，Rotavin-M1在6周齡開始口服免疫，共2劑，每劑間隔30 d。該疫苗在2012年上市，目前只允許在越南使用。

2012年Dang等[42]對該疫苗安全性和免疫原性進行了評估。在嬰兒中，輪狀病毒IgA血清轉化率高達73%，并且Rotavin-M1不會導致發熱、腹瀉、嘔吐或過敏的幾率增加，表明該疫苗對越南嬰兒安全性和免疫原性較好。然而，該疫苗是否存在腸套疊等風險，目前沒有相關試驗的報道，沒有足夠的證據來評估其與腸套疊的相關性。

2.7LLR 蘭州羔羊輪狀病毒疫苗(LLR)是蘭州生物制品所研制的單價減毒活疫苗，其采用1985年首次分離的羔羊輪狀病毒株G10P[12]接種新生牛腎細胞，經培養、收取病毒液、加穩定劑后制成，為粉紅色液體。LLR疫苗在嬰幼兒2個月至3歲時服用，每年1次。該疫苗2001年在中國上市，目前只批準在中國使用。

由于缺乏III期臨床試驗，不同時間段和不同地區的病例對照研究估計了疫苗的有效性。研究表明不同時間段和地區產生的疫苗有效性從35%到77%不等[43]。2020年Xia等[44]對該疫苗的安全性和免疫原性進行了評估。對于6至13周的中國嬰兒，疫苗對任何程度的輪狀病毒性腹瀉、重癥輪狀病毒性腹瀉和任何血清型所致的住院患兒的有效率分別為56.6%、70.3%和74.0%。并且疫苗組的抗輪狀病毒IgA的幾何平均滴度和血清反應率明顯高于對照組。由于LLR疫苗的免疫效力、安全性只適用于中國，并且各項保護效力評價標準不同，導致各數據間無法比較，進而限制了該疫苗的推廣使用。

3 輪狀病毒候選疫苗概況

使用減毒活疫苗在預防病毒性疾病時存在一定的風險因素，迫切需要一種安全、有效、質量可控、易于免疫識別的新型疫苗。隨著科學技術的不斷進步以及人們對輪狀病毒的重視，極大促進了輪狀病毒疫苗的研發進度，開始出現不同類型的新型疫苗。其中認為最具有發展前景的是非復制型疫苗。

3.1RV3-BB單價活疫苗 RV3-BB是以自然減毒的新生兒G3P[6]輪狀病毒株為基礎研發的口服疫苗。Bines等[45]在印度尼西亞的一項臨床試驗中評估了RV3-BB的有效性。免疫接種后，新生兒組疫苗的有效率為94%，嬰兒組疫苗的有效率為77%，兩組均檢測到免疫應答反應，且兩組疫苗耐受性良好，說明RV3-BB具有預防輪狀病毒性腹瀉的疫苗應用前景。同時進一步試驗表明RV3-BB與OPV聯合使用時不會降低任何一種疫苗的免疫原性。該疫苗是目前發展最快的候選疫苗。

3.2多價人-牛重配疫苗 多價人-牛重配疫苗是在四價基礎上將人輪狀病毒6種血清型的VP7基因替換牛輪狀病毒UK毒株相應基因研制出的一種六價重配疫苗[46-47]。四價重配苗(BRV-TV)具有反應性低、效率高的特點，兩劑BRV-TV疫苗足以誘導對重癥輪狀病毒性腹瀉的保護，且接種后無明顯發熱反應，相信六價疫苗的保護效力更好，安全性更高，是一種很有前途的輪狀病毒候選疫苗，目前已完成Ⅲ期臨床試驗人員的招募。

3.3病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)是一種基因工程亞單位疫苗，由一種或多種病毒的衣殼蛋白組成，與天然病毒有相似的空間構象，但不包含遺傳物質，目前廣泛應用于疫苗、基因治療、藥物載體和材料科學等方面[48]。

1987年Estes等[49]利用桿狀病毒表達系統合成輪狀病毒主要衣殼抗原，拉開了研究輪狀病毒樣顆粒疫苗的帷幕。Fromantin等[50]利用表達VP2和VP6的重組桿狀病毒共感染昆蟲細胞，成功制備出輪狀病毒2/6-VLP，經鼻免疫小鼠后可引起高血清抗體反應。Shuttleworth等[51]利用重組桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統把兩種輪狀病毒衣殼蛋白(猿猴VP2和小鼠VP6)自組裝成VLP 2/6，小鼠腹腔注射后可引起強烈的免疫應答。另外，口服VLP 2/6可不依賴佐劑，進一步證明VLP 2/6是一種有效的免疫原。Istrate等[52]將RF 8-2/6/7-VLP與輪狀病毒VP8蛋白融合到截短的VP2氨基端制備出RF 8-2/6/7輪狀病毒樣顆粒，小鼠肌肉注射后可誘導輪狀病毒特異性血清IgG和IgA。Siadat-Pajouh等[53]利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統制備出輪狀病毒2/6病毒樣顆粒(2/6-VLPs)，小鼠經口或鼻腔免疫后均可產生IgA、IgM和IgG。Molinari等人在果蠅幼蟲體內合成了RV2/6 VLP，大大降低了生產成本。Rodríguez-Limas等人首次利用酵母作為表達系統，通過采用不同分子和工藝來生產具有復雜結構的RV病毒樣顆粒[54]。2016年由諾如病毒樣顆粒和桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統產生的重組RV VP6蛋白組成聯合疫苗，用于兒童急性輪狀病毒性腹瀉。相關試驗表明，這兩種成分均能誘導強烈的免疫應答，并且RV VP6蛋白在體內對諾如病毒特異性抗體反應具有免疫佐劑作用，并在體外促進抗原提呈細胞的激活和成熟[55-58]，使得該疫苗達到一舉兩得的效果。但該疫苗只在小鼠、家兔和豬模型中評估了其免疫原性、有效性和安全性，尚未進行人體試驗。

3.4P2-VP8-P[8]重組亞單位疫苗 P2-VP8-P[8]由截短的RV VP8*(P[8])蛋白融合破傷風毒素的P2 CD4+表位重組表達的一種非復制型輪狀病毒疫苗[59-60]。2016年Groome等[61]評估了不同劑量的P2-VP8-P[8]亞單位輪狀病毒疫苗的安全性和免疫原性。在528名嬰兒中，實驗組(99%～100%)抗P2-VP8 IgG血清對P[4]、P[6]和P[8]抗原的應答均高于安慰劑組(10%～29%)，P2-VP8-P[8]疫苗在嬰兒中具有良好的耐受性和免疫原性，接種疫苗的嬰兒表現出較強的IgG反應，為欠發達地區提供了一個輪狀病毒候選疫苗，解決口服疫苗在這些地區免疫效力低的問題。更重要的是，P2-VP8-P[8]亞單位疫苗可以與其他常規嬰幼兒計劃免疫疫苗，如DTP、IPV、HBV等制備成聯合疫苗，簡化免疫程序、減少注射次數。

3.5滅活輪狀病毒疫苗(IRV) IRV是一種腸外給藥的滅活輪狀病毒疫苗，該候選疫苗基于G1P[8]毒株，已在小鼠、大鼠、兔和豬模型中試驗，顯示出較好的免疫效果和保護作用。在進行注射或微針貼片給藥后，小鼠除了產生強烈的血清抗體外，還可誘導腸黏膜免疫[62-64]，是實現輪狀病毒全球免疫最有希望的候選疫苗。

3.6輪狀病毒反向遺傳系統 2017年，Kanai等[65-66]研發了完全基于質粒的輪狀病毒反向遺傳系統，并不斷優化，開始在結構功能、病毒復制研究和抗病毒藥物的篩選中進行探索。將人輪狀病毒基因組拯救出活病毒，與輪狀病毒基因融合構建外源基因表達，獲得一種安全的減毒重組輪狀病毒，在實驗中可以對該系統進行嚴格控制，為開發下一代安全的輪狀病毒疫苗提供了條件。然而，該系統的工作機制仍不清楚，評估這些方法取得成功的潛力還為時尚早。

4 展望和結論

近年來對輪狀病毒的研究已經取得了一定進展，但是輪狀病毒的血清型亦不斷增加；在疫苗研發方面也處于快速發展時期。基于疫苗安全性及制造成本考慮，近年來研究人員逐漸開始轉向非復制型疫苗，但非復制型疫苗也存在不足，需要進一步優化生產工藝，以改善其免疫保護水平，并在將來替代傳統的減毒活疫苗。隨著研究的深入，相信在不久的將來輪狀病毒疫苗開發技術會更加成熟，新型疫苗也將更安全、高效、價廉。

利益沖突：無