氧化鋅納米粒子的神經(jīng)毒性研究進(jìn)展

裴星瑤，李道穩(wěn)，湯樹生

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

近年來，納米技術(shù)已從工業(yè)機(jī)械領(lǐng)域轉(zhuǎn)化到醫(yī)藥技術(shù)、食品生產(chǎn)及養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域［1］。由于人們對(duì)納米材料，特別是金屬或金屬氧化物修飾納米粒子的大量投資，納米技術(shù)目前已蓬勃發(fā)展，并帶來了深刻的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益［2］。其中鋅（Zn）的金屬氧化物納米顆粒在化妝品、藥品和食品中的應(yīng)用潛力被逐漸開發(fā)［3-5］。Zn是必需微量元素，人和動(dòng)物體內(nèi)有數(shù)百種功能酶含有Zn，因此氧化鋅納米粒子（zinc oxide nanoparticles，ZnO NP）常被用于營養(yǎng)目的，增強(qiáng)胃腸道的消化吸收功能［3］。此外，由于優(yōu)異的抗菌能力，ZnO NP已被添加到醫(yī)學(xué)材料和食品中［6］。然而，人類和動(dòng)物通過各種途徑接觸納米顆粒而產(chǎn)生的健康風(fēng)險(xiǎn)正日益引起關(guān)注。除接觸范圍廣的特點(diǎn)，改造為納米材料之后，本體化合物的理化性質(zhì)和生物反應(yīng)也會(huì)被改變，如ZnO NP體積小，表面積大，與ZnO本體相比更具活性［7］。因此，作為具有納米材料獨(dú)特屬性的ZnO NP，是否區(qū)別于其原始形式，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和公眾健康有更大的威脅，這也是一個(gè)值得關(guān)注的問題。

近年來，隨著研究的逐步深入，人們對(duì)納米材料毒性的理解已擴(kuò)展至中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS），CNS整合和接收身體各部位的信息并反過來協(xié)調(diào)和影響身體活動(dòng)［8］。ZnO NP能與神經(jīng)系統(tǒng)相互作用，引發(fā)神經(jīng)毒性并介導(dǎo)腦組織損傷［9］。針對(duì)ZnO NP的安全評(píng)估雖證明了其對(duì)大腦的威脅，但其神經(jīng)毒性作用機(jī)制并未得到廣泛和系統(tǒng)的認(rèn)知。因此，本文對(duì)ZnO NP的神經(jīng)侵襲特點(diǎn)和神經(jīng)毒性機(jī)制進(jìn)行了分析，以期更全面地掌握ZnO NP對(duì)CNS造成的危險(xiǎn)，為其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和使用監(jiān)管提供參考。

1 ZnO NP介導(dǎo)CNS中Zn聚積的主要途徑

ZnO NP的生物分布已得到評(píng)估，其可進(jìn)入大腦，到達(dá) CNS［9］；在大腦中的分布呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。雄性C57BL/6J小鼠分別以每只單次氣管灌注ZnO NP 3 μg（低劑量），6 μg（中劑量）和12 μg（高劑量），利用等離子體質(zhì)譜對(duì)收集的大腦皮質(zhì)組織進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腦皮質(zhì)Zn水平以劑量依賴性方式上升，暴露后第3天，Zn濃度隨ZnO NP灌注濃度的增加，從＜600 μg·L-1逐漸上升到700 μg·L-1［9］。也有研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)Zn2+敏感，ZnO NP轉(zhuǎn)化后可能以Zn2+或其他形式在大腦中產(chǎn)生毒性效應(yīng)。Zn2+能從ZnO NP中釋放，擴(kuò)散到包括腦在內(nèi)的各個(gè)器官，而剩余的ZnO NP也能繼續(xù)不斷地促進(jìn)Zn2+在大腦中積累［10］。目前，ZnO NP向CNS轉(zhuǎn)化的主要途徑包括血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）途徑［11］、感覺神經(jīng)易位途徑［12］和微生物-腸道-大腦軸途徑［13］。

1.1 血腦屏障途徑

金屬氧化物納米材料可能通過被動(dòng)擴(kuò)散、抑制外排、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和吸附轉(zhuǎn)胞吞等4種主要機(jī)制增加BBB內(nèi)側(cè)的金屬元素［14］。ZnO NP也可通過BBB進(jìn)入CNS［15］，且其介導(dǎo)的腦部炎癥可導(dǎo)致BBB的完整性和通透性改變，導(dǎo)致BBB內(nèi)側(cè)Zn累積［16］。血中載脂蛋白B和載脂蛋白E可吸附ZnO NP，使其通過受體調(diào)節(jié)的胞吞方式被內(nèi)皮細(xì)胞攝取，從而穿過BBB［9］。ig給予小鼠的ZnO NP可從腸道吸收至血液循環(huán)，通過破壞BBB誘導(dǎo)腦內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）濃度升高［17］。Amara等［18］的代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，血中ZnO NP能穿過BBB并轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦，增加皮質(zhì)和小腦中Zn2+水平。他們同時(shí)用雄性Wistar大鼠一次性iv給予ZnO NP混懸液的方法證實(shí)，ZnO NP給藥后，大鼠血漿和腦內(nèi)Zn2+濃度均升高。

1.2 感覺神經(jīng)易位途徑

早期研究報(bào)道，在鍍Zn鋼板焊接過程中吸入微米級(jí)ZnO顆粒會(huì)導(dǎo)致人大腦功能損傷，這可能與嗅覺神經(jīng)對(duì)ZnO NP的輸運(yùn)有關(guān)，目前這一發(fā)現(xiàn)得到驗(yàn)證［19］。經(jīng)鼻接觸空氣中的ZnO NP和經(jīng)口食用的ZnO NP均可刺激相關(guān)感覺神經(jīng)，包括嗅覺神經(jīng)、三叉神經(jīng)和味覺神經(jīng)，從而沿神經(jīng)通路輸運(yùn)至大腦。有研究推測(cè)，吸入的ZnO NP可能通過嗅上皮后經(jīng)三叉神經(jīng)轉(zhuǎn)移到CNS，也可沿嗅神經(jīng)軸突直接進(jìn)入大腦［12，20］。以含相同物質(zhì)的量的 Zn 的 ZnSO4為對(duì)照，4周齡雄性SD大鼠單劑量鼻內(nèi)滴注ZnO NP 13 mg·kg-1，7 d后，ZnO NP發(fā)生溶解和轉(zhuǎn)化，以Zn2+的形式，通過嗅球-大腦轉(zhuǎn)運(yùn)途徑使大腦中的Zn2+濃度增加。X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（X-ray absorption fine structure）儀器分析表明，ZnO NP和ZnSO4組大鼠在海馬區(qū)表現(xiàn)出類似的化學(xué)形態(tài)和分子效應(yīng)，表明該生物學(xué)效應(yīng)主要來源于ZnO NP釋放的Zn2+［10］。而味覺實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠ZnO NP 50 mg·kg-1連續(xù)滴舌30 d后，可被味蕾吸收，通過味覺神經(jīng)即鼓索神經(jīng)和舌咽神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦。等離子體質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果表明，Zn在小腦、腦干、大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域均有蓄積。海馬區(qū)透射電鏡結(jié)果顯示，ZnO NP組和ZnSO4組有髓神經(jīng)纖維均出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)［21］。有趣的是，舌滴處理組大鼠大腦的Zn含量顯著高于ig處理組［21］。

1.3 微生物-腸道-腦軸途徑

胃腸道是食品中ZnO NP的主要靶器官，而腸道在各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進(jìn)程中扮演著重要角色［22-23］。腸道菌群易受食品添加劑、藥物和毒物的影響，通過微生物-腸道-腦軸調(diào)節(jié)神經(jīng)功能。一旦腸道發(fā)生菌群失調(diào)，會(huì)刺激腸神經(jīng)元興奮,興奮信號(hào)進(jìn)一步傳導(dǎo)至CNS，從而與CNS定向通信［24］。首先，神經(jīng)元連接通路使腸道損傷擴(kuò)散至大腦；其次，腸神經(jīng)系統(tǒng)存在CNS中的5-HT等常見神經(jīng)遞質(zhì)，腸道損傷易對(duì)學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動(dòng)等神經(jīng)功能產(chǎn)生影響［25］。數(shù)據(jù)表明，口服ZnO NP后，腸道神經(jīng)特異性標(biāo)志物Hu家族蛋白和Ⅲ型β微管蛋白（Ⅲβ-tubulin，TuJ1）均升高，表明腸內(nèi)神經(jīng)元被顯著激活。主坐標(biāo)分析法（principal coordinate analysis）研究表明，ZnO NP通過改變放線菌和雙歧桿菌等腸道微生物群落組成誘導(dǎo)微生物-腸道-腦軸紊亂，引起幼小鼠海馬代謝物的改變和神經(jīng)行為障礙［13］。4周齡小鼠連續(xù)30 d ig給予ZnO NP 26 mg·kg-1懸液，可引起腸道病理性改變，誘導(dǎo)腸神經(jīng)元的異常興奮，激活小鼠腸道內(nèi)5-HT的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，通過腸-腦通信增加大腦內(nèi)5-HT的水平［17］。因此，ZnO NP引發(fā)的腸道菌群紊亂可通過微生物-腸道-腦軸損害神經(jīng)系統(tǒng)。

2 ZnO NP的納米特性對(duì)其神經(jīng)毒性的影響

2.1 納米顆粒的特異性

納米顆粒與其母體顆粒相比，具有不同的理化性質(zhì)，包括大小、形狀、比表面積和表面修飾等［7］。比表面積的增加使得ZnO NP相比于ZnO大顆粒具有高度反應(yīng)性［26-27］。ZnO NP可能與生物系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)相互作用，形成納米顆粒-蛋白質(zhì)冠，或通過靜電、疏水或氫鍵作用相互吸附［26］。因此，等量元素的氧化物納米顆粒、氧化物本體和相應(yīng)鹽溶液的毒性效應(yīng)具有明顯差異，氧化物納米顆粒（如ZnO NP）增加了氧化物本體（如ZnO化合物）的生物毒性，且與鹽溶液相比，毒性效應(yīng)更顯著［28-30］。例如，無毒劑量的ZnO制成納米顆粒后，能通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［28］。擔(dān)尼魚（斑馬魚）胚胎期暴露于ZnO NP 1～100 mg·L-1所導(dǎo)致的異常比溶解的Zn2+嚴(yán)重，且ZnO NP導(dǎo)致了更嚴(yán)重的次級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突異常和背根神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常，持續(xù)多代影響擔(dān)尼魚的神經(jīng)和血管系統(tǒng)發(fā)育［29］。星形膠質(zhì)細(xì)胞暴露于ZnO NP時(shí)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成和胱天蛋白酶活性的變化比ZnO本體更顯著。對(duì)比ZnO NP，ZnCl2和ZnO對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)毒性。結(jié)果表明，ZnO NP和ZnO本體導(dǎo)致的線粒體損傷較為嚴(yán)重，而ZnCl2未對(duì)線粒體膜電位產(chǎn)生明顯影響。而在細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中，用高濃度（40和80 mg·L-1）作用時(shí)，ZnCl2和ZnO NP處理組的細(xì)胞總數(shù)明顯降低，而ZnO本體對(duì)細(xì)胞增殖作用無明顯影響。可確定ZnO NP對(duì)細(xì)胞的毒性作用更加明顯，且這種納米特異性毒性不依賴于其溶解和離子的釋放［30］。

2.2 ZnO NP的性質(zhì)與其神經(jīng)毒性的關(guān)系

納米ZnO的毒理學(xué)效應(yīng)與其大小、形狀、表面積和分散性等理化性質(zhì)有關(guān)［30］。因此，無論是出于安全使用還是實(shí)驗(yàn)性暴露，納米ZnO的毒性大小都要考慮從物理化學(xué)表征的角度來解釋。直徑50和100 nm的納米ZnO對(duì)多巴胺能（dopaminergic，DA）神經(jīng)元的毒性大于直徑1000 nm的納米ZnO，這可能由于小尺寸納米ZnO易穿透BBB或被細(xì)胞吸收，也可能由于比表面積和表面原子增加所致［31］。擔(dān)尼魚和SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)ZnO NP、短納米棒（nanorod，NR）和長NR等不同形狀和大小的納米ZnO的反應(yīng)程度不同。在低濃度范圍內(nèi)，尺寸較小的ZnO NP和短ZnO NR比尺寸較大的長ZnO NR表現(xiàn)出稍高的毒性；而相對(duì)高濃度下，長ZnO NR的風(fēng)險(xiǎn)增加，如其與ZnO NP相比能夠同等水平地通過ROS誘導(dǎo)帕金森病（Parkinson disease，PD）樣癥狀，包括運(yùn)動(dòng)缺陷、DA神經(jīng)元丟失和α-突觸核蛋白的積累，這可能由于在高濃度情況下，小粒徑的ZnO NP易團(tuán)聚所致［32］。對(duì)于不同模型，納米ZnO性狀與毒性的關(guān)系也未必一致［33］。ZnO NR對(duì)人肺上皮細(xì)胞的毒性大于ZnO NP，對(duì)HepG2細(xì)胞的損傷程度也高于ZnO NP［34-35］。相反，ZnO NP對(duì)Ana-1細(xì)胞的毒性比ZnO NR更大［36］。在3種富營養(yǎng)水體生物中，ZnO NP的LC50值低于ZnO NR［33］。而在海洋雙殼類動(dòng)物體內(nèi)ZnO NP則具有更強(qiáng)的促凋亡和促炎作用［37］。根據(jù)以上研究結(jié)果可知，不同理化性質(zhì)的納米ZnO的風(fēng)險(xiǎn)比較還取決于不同的生物模型。只有風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)考慮其不同的表征特點(diǎn)，才能找到納米ZnO暴露的真正安全范圍。

3 ZnO NP的神經(jīng)毒性作用

3.1 神經(jīng)行為障礙

神經(jīng)行為障礙包括感覺功能、運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能障礙。嚙齒動(dòng)物行為學(xué)研究表明，ZnO NP能誘導(dǎo)神經(jīng)行為障礙［25］。ZnO NP暴露（ip給予）8周后，通過損害突觸可塑性改變了4周齡Wistar大鼠的空間認(rèn)知能力［38］。連續(xù)5dip給予ZnONP300mg·kg-1后，Swiss 小鼠腦內(nèi)出現(xiàn) Zn2+積累和焦慮行為［39］。ZnO NP誘導(dǎo)神經(jīng)行為障礙腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和Discs大同源物4（recombinant discs，large homolog 4，DLG4）等相關(guān)標(biāo)志物水平發(fā)生變化，如4周齡幼小鼠ig給予ZnO NP 26 mg·kg-1，連續(xù)30 d，Morris水迷宮和即野外曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幼小鼠出現(xiàn)了明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙且運(yùn)動(dòng)功能受到抑制，可能與幼小鼠海馬組織的特異性神經(jīng)行為相關(guān)基因BDNF和DLG4被上調(diào)有關(guān)［25］。連續(xù)3 d暴露于環(huán)境相關(guān)劑量（14.6 mg·kg-1）的ZnO NP后，小鼠在物體識(shí)別測(cè)試中出現(xiàn)認(rèn)知障礙，該毒性與一氧化氮、硫代巴比妥酸反應(yīng)物水平升高及乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性降低有關(guān)［40］。

3.2 腦組織損傷

研究表明，在未見神經(jīng)行為障礙的條件下，ZnO NP對(duì)腦組織的損傷已存在［41-42］，如ZnO NP導(dǎo)致大鼠腦組織臟器系數(shù)下降和病理性結(jié)構(gòu)損傷。在處理組中，舌灌注ZnO NP使大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)更為稀疏，皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)的尼氏體數(shù)量減少，核萎縮，表明該區(qū)域神經(jīng)元受損。免疫組化結(jié)果顯示，皮質(zhì)和海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）陽性信號(hào)增加，膠質(zhì)細(xì)胞從靜息態(tài)轉(zhuǎn)化為激活態(tài)［41］。雄性白化大鼠ig給予ZnO NP 5.6 mg·kg-1后，BBB損壞，小腦神經(jīng)元變性、排列紊亂，浦肯野細(xì)胞和顆粒細(xì)胞出現(xiàn)病理性變化，尼氏體丟失，膠質(zhì)增生。ZnO NP誘導(dǎo)的腦組織損傷與凋亡和炎癥相關(guān)蛋白水平相關(guān)，如腦組織中的凋亡標(biāo)志物胱天蛋白酶-3蛋白水平在浦肯野細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中顯著上調(diào)，P53和環(huán)氧化酶-2在小腦組織中的表達(dá)量顯著升高，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的分泌也明顯增加。研究表明，這些變化與腦氧化應(yīng)激有關(guān)，且姜黃素可通過抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用緩解ZnO NP對(duì)小腦皮質(zhì)的損害［42］。同樣，小鼠經(jīng)氣管內(nèi)給予ZnO NP（每只12 μg）后，HE染色可見，小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)畸變、細(xì)胞核萎縮或斷裂，且這些病理變化改變可持續(xù) 7 d［9］。

4 ZnO NP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制

4.1 誘導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)障礙

ZnO NP能通過神經(jīng)遞質(zhì)變化和動(dòng)作電位的失衡誘導(dǎo)神經(jīng)傳導(dǎo)障礙。多組學(xué)分析表明［10］，ZnO NP滴鼻后增加大鼠海馬中乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）的合成、上調(diào)Ach轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，抑制AchE活性，從而增加Ach的釋放。ZnO NP抑制AchE活性可能是由于其釋放出的Zn2+與AchE二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用或通過轉(zhuǎn)錄機(jī)制下調(diào)AchE的活性［10］。髓質(zhì)神經(jīng)元釋放的谷氨酸是產(chǎn)生呼吸驅(qū)動(dòng)的興奮性遞質(zhì)，ZnO NP可通過干擾谷氨酸代謝和抑制突觸后受體功能影響神經(jīng)傳導(dǎo)。此外，ZnO NP可增加小鼠大腦皮質(zhì)中5-HT遞質(zhì)釋放含量，從而導(dǎo)致小鼠記憶障礙和運(yùn)動(dòng)缺失［25］。ZnO NP通過破壞神經(jīng)傳導(dǎo)從而影響正常的呼吸驅(qū)動(dòng)，在新生大鼠體外腦干-脊髓制備物的急性暴露實(shí)驗(yàn)中，ZnO NP影響了呼吸節(jié)律相關(guān)神經(jīng)元的功能，通過降低動(dòng)作電位幅度和最大峰值影響生物電特性，從而導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的抑制和呼吸節(jié)律的終止。該效應(yīng)可能與Zn2+調(diào)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性有關(guān)［43］。

4.2 誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激損傷和能量耗竭

線粒體是活細(xì)胞能量中心，對(duì)哺乳動(dòng)物維持大腦功能至關(guān)重要［44］。ZnO NP可通過聚集引起線粒體損傷，也可干擾呼吸鏈功能，誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）耗竭從而改變腦內(nèi)能量代謝［45-47］。大鼠鼻滴ZnO NP導(dǎo)致糖酵解上調(diào)、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化下調(diào)，腦內(nèi)ATP水平降低，引起能量供應(yīng)缺失，最終導(dǎo)致能量耗竭。在體外，ZnO NP可被大鼠C6膠質(zhì)細(xì)胞吸收，并在暴露第3和6 h誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［48］。使用ZnO NP 6.6 mg·L-1作用于小膠質(zhì)細(xì)胞10 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS累積增多，線粒體膜電位下降，ATP水平下降到對(duì)照組的50%［44］。用ZnO NP 5，20和40 mg·L-1處理星形膠質(zhì)細(xì)胞6 h，ROS水平分別增加29%，38%和49%。另一觀點(diǎn)認(rèn)為，線粒體功能損害后可能會(huì)出現(xiàn)一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制——線粒體自噬［49］。在線粒體自噬相關(guān)蛋白（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）基因敲除的BV-2細(xì)胞模型中，ZnO NP 10 μg·mL-1誘導(dǎo)了明顯的線粒體損傷，同時(shí)PINK1招募parkin從細(xì)胞質(zhì)向線粒體輸運(yùn)，觸發(fā)線粒體自噬從而保護(hù)ZnO NP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性［50］。

4.3 誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥發(fā)生

與神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷不同的是，神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展中扮演更重要的角色。如阿爾茨海默病（Alzheimer disease）、PD和肌萎縮性側(cè)索硬化癥等［51］。ZnO NP可能通過促炎反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、ROS積累和神經(jīng)元丟失而推動(dòng)神經(jīng)發(fā)育障礙和神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程［52］。ZnO NP釋放的Zn2+誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)（nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB）促炎信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可抑制雞顱神經(jīng)嵴細(xì)胞（cranial neural crest cells）的產(chǎn)生和遷移，限制了顱神經(jīng)嵴的發(fā)育，導(dǎo)致雞胚胎顱面部缺陷［53］。大鼠ig給予ZnO NP 600 mg·kg-1后，血清TNF-α、IL-1β、IL-6、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein）、過氧化氫酶和谷胱甘肽的水平提高，大腦皮質(zhì)中的促炎因子TNF-α、IL-1β和一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2）均顯著上調(diào)［54］。qRT-PCR結(jié)果顯示，ZnO NP刺激BV2細(xì)胞分泌更多TNF-α和IL-1β，且在3和6 h達(dá)峰值，該炎癥反應(yīng)受到NF-κB、ERK和P38蛋白激酶（P38 protein kinase，P38）的調(diào)控［41］。ZnO顆粒能激活SH-SY5Y細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路，降低泛素C端水解酶L1（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1，UCH-L1）的表達(dá)。反之，UCH-L1基因過表達(dá)可去泛素化內(nèi)源性抑制劑IκBα，阻滯NF-κB信號(hào)通路，減輕神經(jīng)元損傷［31］。

4.4 誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

大鼠連續(xù)7 d暴露于ZnO NP（40和100 mg·kg-1），可導(dǎo)致大鼠腦組織細(xì)胞凋亡標(biāo)志物胱天蛋白酶3表達(dá)增加，且伴隨明顯的DNA片段化［55］。用ZnO NP 15 μmol·L-1刺激SH-SY5Y細(xì)胞12和24 h后，Akt/胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶7通路相關(guān)性凋亡損傷明顯增加。吖啶橙/溴化乙錠染色實(shí)驗(yàn)（AO/EB）和凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，ZnO NP可誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。ZnO NP能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，且胱天蛋白酶3/7活性呈濃度依賴性增加，其中ZnO NP 80 mg·L-1誘導(dǎo)的胱天蛋白酶活性較對(duì)照組升高（71.9±3.8）%［56］。

4.5 誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡

鐵死亡（ferroptosis）是鐵依賴的新型細(xì)胞死亡形式。鐵死亡的特征被定義為谷胱甘肽過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的失活、鐵的上調(diào)和脂質(zhì)過氧化物的積累［57-59］。據(jù)報(bào)道，納米顆粒通過導(dǎo)致小鼠異種移植腫瘤細(xì)胞的鐵死亡來抑制腫瘤的生長，這預(yù)示了納米顆粒與鐵死亡的關(guān)系［60-61］。近期，ZnO NP誘導(dǎo)鐵死亡也得到證實(shí)［62］。氣管內(nèi)灌注ZnO NP小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生了鐵死亡，其中鐵死亡調(diào)控因子GPX4和溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SCL7A11）蛋白表達(dá)明顯下降；相反，鐵死亡誘發(fā)蛋白（voltage-dependent anion channels 3）的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。ZnO NP處理的神經(jīng)元樣PC-12細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡表現(xiàn)，GPX4和SCL7A11蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低。應(yīng)激活化蛋白激酶（stressactivated protein kinase，JNK）通路參與調(diào)控了ZnO NP誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡，JNK抑制劑SP600125可逆轉(zhuǎn)該過程。特異性鐵死亡抑制劑Fer-1能在體內(nèi)和體外分別抑制ZnO NP誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了ZnO NP誘導(dǎo)了鐵死亡的發(fā)生［9］。

4.6 誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是細(xì)胞的一種炎性死亡方式，特征是細(xì)胞內(nèi)外刺激通過激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和內(nèi)容物的釋放［62］。ZnO和焦亡之間可能存在潛在關(guān)系。ZnO NP 80 mg·L-1可引起B(yǎng)V-2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)ROS積累和線粒體損傷。但事實(shí)上，在細(xì)胞死亡過程中，annexin Ⅴ/PI雙染法未檢測(cè)到ZnO NP導(dǎo)致的早期凋亡細(xì)胞（annexin Ⅴ+PI-細(xì)胞），同時(shí)Western印跡法未檢測(cè)到多聚ADP核酸聚合酶和胱天蛋白酶3剪切體的高表達(dá)，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（Annexin Ⅴ+PI+）約占（68.2±6.7）%，表明ZnO NP可能誘導(dǎo)了細(xì)胞質(zhì)膜損傷相關(guān)的非凋亡模式的細(xì)胞死亡，包括壞死和細(xì)胞焦亡［63］。神經(jīng)系統(tǒng)研究雖然無直接證據(jù)，但在早期實(shí)驗(yàn)中，用ZnO NP 10和20 mg·L-1刺激體外培養(yǎng)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549，發(fā)現(xiàn)染毒組上清液中乳酸脫氫酶和IL-1β釋放增加，胞內(nèi)胱天蛋白酶1蛋白表達(dá)也被上調(diào)，最終引發(fā)了細(xì)胞炎性死亡［64］。

5 ZnO NP誘導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)

神經(jīng)退行性疾病逐漸成為帶來沉重社會(huì)負(fù)擔(dān)的重大問題，其中納米二氧化鈦已被證明對(duì)PD的發(fā)展具有顯著風(fēng)險(xiǎn)，可誘導(dǎo)行為缺陷、神經(jīng)元死亡、多巴胺丟失及路易體聚集［65-66］。近年來，ZnO NP通過誘導(dǎo)Tau蛋白聚集從而促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的潛在危害也被揭露，如ZnO NP可引發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞Tau蛋白聚集和蛋白水解片段的出現(xiàn)［32］。Chuang等［67］研究表明，ZnO NP在神經(jīng)退行性疾病中扮演的角色取決于其濃度或性狀。低水平ZnO NP具有神經(jīng)保護(hù)作用，抑制蛋白氧化，激活細(xì)胞自噬，抑制Tau蛋白聚集。高濃度ZnO NP則導(dǎo)致自噬失活，促進(jìn)腦內(nèi)Tau蛋白聚集的形成。他們將7周齡雄性SD大鼠暴露于ZnO NP 10 mg·kg-1后，海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，小腦和海馬中Tau蛋白表達(dá)增加。正常情況下，健康大腦中的Tau蛋白積累可被自噬等降解機(jī)制清除。然而，高濃度ZnO NP染毒未誘導(dǎo)海馬中自噬標(biāo)志物的顯著變化，這與以前ZnO NP介導(dǎo)細(xì)胞自噬的結(jié)果［67］相反，說明高濃度ZnO NP使大腦中的細(xì)胞自噬缺失，因此無法完成對(duì)Tau蛋白的降解，進(jìn)一步促進(jìn)Tau蛋白堆積。

6 結(jié)語

ZnO NP通過增加腦組織中Zn2+水平誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，主要途徑有BBB途徑、感覺神經(jīng)易位途徑和微生物-腸-腦軸途徑。ZnO NP誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性具有納米顆粒特殊性，且與其理化性質(zhì)相關(guān)。ZnO NP可導(dǎo)致明顯的腦組織損傷，引發(fā)動(dòng)物神經(jīng)性行為障礙。通過分析ZnO NP神經(jīng)毒性機(jī)制的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，ZnO NP靶向CNS，會(huì)導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡、鐵死亡和焦亡，最終促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。這些毒性效應(yīng)可能涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括NF-κB通路、MAPK通路、BDNF通路、PINK1通路和胱天蛋白酶3通路。然而，現(xiàn)有研究無法完全掌握ZnO NP在神經(jīng)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化過程和存在形式，造成的神經(jīng)細(xì)胞死亡包括細(xì)胞焦亡和鐵死亡的研究還較少，大多研究集中在神經(jīng)元上，而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的探究還不夠。因此，還需進(jìn)一步闡明ZnO NP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的相關(guān)分子機(jī)制。更重要的是，ZnO NP與其他包括腦缺血、腦損傷、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化在內(nèi)的神經(jīng)疾病的關(guān)系也需要進(jìn)一步探討，如何合理生產(chǎn)、控制用量和加大監(jiān)管力度從而避免ZnO NP的潛在風(fēng)險(xiǎn)，也將是未來的研究重點(diǎn)。