亞健康狀態動物模型的構建與評價研究進展

袁 群,毛 欣,王 能,胡海林,曹 淼,何清湖,2*

(1.湖南中醫藥大學,長沙 410208;2.湖南醫藥學院,湖南 懷化 418000)

“亞健康”這一概念最早由前蘇聯學者布赫曼(N.Berhman)提出,是指介于健康與疾病之間的一種低質狀態。 隨著經濟的發展、生活水平的提高以及各種壓力的增加,亞健康已經成為困惱全球的一個社會問題[1]。 據世界衛生組織最新一項調查結果表明全球75%人處于亞健康狀態,健康人群僅占5%[2]。 其實早在兩千多年前,《黃帝內經》一書中就有提到“圣人不治已病治未病”,雖然中醫學中的“未病”不等同亞健康,但是其包括現代醫學所提出的“亞健康狀態”[3],且有大量的研究采用中醫“治未病”的理論來指導亞健康的中醫干預,并取得較好的效果。 隨著對亞健康研究的深入,由于臨床研究的局限性和倫理學的限制,動物實驗為亞健康本質的研究開辟了新方向,但目前對于亞健康動物模型的構建尚無統一標準或推廣模型。

1 亞健康狀態動物模型構建的理論依據

大量的研究證實亞健康的發生發展與不良的生活習慣、心理因素刺激、精神緊張、環境污染、個性特征和遺傳因素等有關。 因此,目前亞健康動物模型構建的理論依據多建立在其發生發展的軀體、心理和環境等因素上。

中醫學對亞健康的認識也是不斷在完善。 有學者認為亞健康的易感因素主要是外感和內傷兩種,其主要病因是臟腑陰陽氣血失調、七情內傷、氣機紊亂,其次是飲食不節、勞逸損傷所致[4-5]。 但也有學者對當今亞健康的成因歸納為①與中醫體質密切相關,先天不足與后天過用;②情志內傷、肝失疏泄;③飲食不節、損傷脾胃④氣虛、氣郁。 總之離不開中醫傳統的“三因學說”[6]。 有研究結果表明亞健康患者體質以氣虛質、陽虛質、濕熱質多見[7]。疲勞、失眠、記憶力減退和情緒問題是亞健康主癥,因此有研究者認為亞健康狀態與心、肝兩臟關系最為密切。 “心主神明,主血脈”,各種因素所致心血耗傷均可使得血液不能充盈于心,心神失養,從而出現記憶力減退、失眠、心悸等不良癥狀;而“肝主筋”,為“罷極之本”,說明疲勞的產生是以肝為核心;另“肝主藏血”,而睡眠的質量取決于陰血的盈虧,因此失眠也與肝相關;“肝主疏泄”,具備調暢情志的作用,各種精神情志癥狀也與肝密切相關。

以上述中醫理論為依據,目前中醫多從體質、五臟(尤以心、肝)入手進行亞健康動物模型的研制。

2 亞健康狀態動物模型類型

目前,亞健康狀態的主癥變化多樣,且其分類方法也未統一,因此亞健康的動物模型也多種多樣。 有根據常見主癥模擬軀體疲勞、心理焦慮、抑郁來建立軀體亞健康、心理亞健康動物模型,也有根據應激源的來源建立心理性、疲勞性及睡眠性亞健康動物模型,但以疲勞和心理亞健康動物模型最為常見。 在中醫學中則多見根據中醫證型來進行亞健康的分類。 黃風等[8]的調查研究發現亞健康患者中醫證型以肝郁氣滯、心脾兩虛、肝腎陰虛、肝郁脾虛、脾腎陽虛、肺腎氣虛等證型多見,張建峰等[9]的調查發現亞健康證型以氣虛型、痰濕型、肝郁型居多。 因此在中醫亞健康動物模型的構建中常見根據中醫證型來建立亞健康動物模型,其中以腎陽虛[10-11]、脾氣虛[12]、肝郁證[13-14]、濕困脾胃等[15]證型多見。

3 亞健康狀態模型建立的動物選擇

目前,在亞健康動物實驗中,研究者們多選用大鼠、小鼠來構建動物模型。 一方面是因為鼠類與人的機能、代謝、結構和疾病特點相似,尤其是大鼠的神經系統與人類相似,另一方面是低等哺乳動物如嚙齒類動物易繁殖、易飼養,麻醉及手術操作簡單,維護費用較低。

4 亞健康狀態造模方法

亞健康狀態的產生與長期反復的社會、心理應激密切相關,因此在亞健康動物模型構建中,應激源多是模擬人類生活中的各種不良生活方式、行為習慣、社會精神壓力等,有單獨采用軀體、心理應激源造模,也有采用軀體心理復合應激源造模。

4.1 心理應激造模

4.1.1 單因素刺激

束縛應激(wrap restraint stress, WRS)方法在心理亞健康及疲勞型亞健康模型構建中多見,可單獨也可與其他方法聯合使用。 研究人員[16-19]通過使用WRS 限制大鼠活動用以模擬人類存在的心理上的限制性因素,也有通過WRS 后聯合懸尾實驗觀察大鼠為克服不正常體位而進行掙扎的狀況,來探討應激對大鼠記憶能力、學習能力等的影響,造模方法中多采用每天1 次的干預頻次,連續造模21 d。

4.1.2 非軀體復合因素

是目前心理亞健康動物模型常用造模方法,通過模擬人類生活中存在的各種不良心理應激,如孤獨、晝夜節律失調、飲食不節、工作生活事件的不確定感等,在造模中常采用孤養、空瓶應激、晝夜紊亂、飲食不節、旁觀電擊應激等多種形式,且全部造模刺激采用隨機表來安排,以使其與人類生活中所遇到的各種不良應激環境更貼近,造出的模型更具有代表性[20-21]。

4.2 軀體應激造模

4.2.1 過度運動

構建疲勞亞健康模型時多采用此方法,且常采取無負重強制游泳[22]、跑臺訓練、強迫水中站立[23]等方法。 但在造模過程中運動量和運動時間尚無統一的標準或計算公式,有研究采用每日同一運動強度、運動時間的方式,也有采取逐漸增大運動量或延長運動時間的方式來造模[24]。 造模時間也不統一,有連續造模2 周,也有先采用無負重游泳2周,再采取遞增負荷游泳4 周的方式。 尚未見到不同造模時間或不同運動方式造出的疲勞亞健康模型是否存在差異或優劣性的報道。

4.2.2 睡眠剝奪(sleep deprivation, SD)

該方法多見于睡眠障礙或疲勞型亞健康動物模型構建,用以模擬人類在社會中因長期的睡眠不足所致亞健康狀態。 多采用持續照明和或改良水平臺的方式[25-27],采用水平臺的原理在于,動物發生睡眠時其由于肌肉張力松弛機體處于失平衡狀態則易掉入水中,大鼠只能爬上平臺,這樣反復多次從而達到SD 的效果。 大部分研究采取造模時間為2 周,于造模結束后對大鼠采用鼠尾懸掛實驗檢測大鼠疲勞程度與體力狀態,通過大鼠“絕望”時間、掙扎次數與靜止時間等對模型進行評價。

4.2.3 飲食不節

飲食不節也是現在亞健康人群常常面臨的一個問題,主要包括飲食不適度、飲食不合時宜、飲食無節律和飲食過雜。 在亞健康動物模型構建中多模擬人類飲食時間的不規律、饑飽無常、高脂飲食等不良飲食習慣。 王輝[28]通過采取飲食不節的方法建立大鼠亞健康狀態,實驗通過給予不同類型飼料(全家顆粒飼料、普通飼料和高脂飼料)結合限時給食的方法,連續6 d 完成造模,并對模型進行評價。

4.2.4 軀體復合因素刺激

在亞健康造模中常采取復合造模的方法,有研究者運用睡眠剝奪聯合負重力竭游泳的方法來建立疲勞型亞健康模型,通過動態監測與評價最終確定每日睡眠剝奪20 h 復合負重其體重5%力竭游泳的作用因素,連續4 d 即造模成功[29]。 張玥莉等[30]模擬現代人“起居無常、飲食失節”致生物鐘紊亂現象,采用打破大鼠正常生活節律,給予大鼠長期24 h/24 h 間歇SD 聯合飲食失節的方法造成亞健康狀態,持續10 周,進行亞健康動物模型的構建通過比較正常組與模型組大鼠行為學指標、血液學指標、心電學差異,并觀察模型可逆性來判斷造模成功與否。 杜旭等[31]采取 WRS 結合游泳運動21 d 來制備亞健康狀態模型。 復合因素刺激方式與現代人生活特點更為貼近,能更好的模擬人類的生存環境,用該類方法所研制出的動物模型更具代表性與說服力。

4.3 軀體兼心理復合因素

單因素造模法由于涉及因素單一而常出現模型癥狀不明顯、效果不穩定、維持時間短等情況,具有一定的局限性。 為了能更好的模擬人類亞健康的成因和癥狀,目前多采用軀體和心理應激源刺激相結合的復合造模法,且在中醫證候相結合亞健康狀態中常見。 有選擇性的結合強迫游泳、SD、夾尾刺激、限制活動、飲食不節等軀體、心理壓力的復合刺激來進行造模[32-34],但對于每一種刺激給與方式、強度、持續時間、評判標準等尚未統一。 這也說明亞健康動物模型標準化任重而道遠。

4.4 中醫分型

關于亞健康的研究中,中醫多數采取分型來進行辯證治療。 現有針對亞健康中醫證型進行造模,如腎陽虛、陰虛、脾氣虛、心腎不交、肝郁證、濕困脾胃等,都體現中醫辨證論治的特點,并且在具體的實驗當中也充分運用了中醫辨證治療理念。

4.4.1 腎陽虛亞健康狀態模型

付蕓升[11]通過給予大鼠灌服腺嘌呤(20 mL/(kg·d),濃度1%),連續10 d 來研制腎陽虛夜尿癥大鼠模型,周海亮等[35]通過給予雄性大鼠灌胃腺嘌呤(200 mg/(kg·d)),連續21 d 來建立腎陽虛證不育模型。

4.4.2 陰虛亞健康狀態模型

有研究通過給大鼠灌胃性味辛、熱的附子(制烏頭)、甘姜(根莖姜)和肉桂(肉桂)中藥湯劑構建陰虛證亞健康狀態[36],吳柳花等[37]根據“過勞傷陰”原理采用負荷遞增游泳的方法建立陰虛內熱模型,每天1 次,每周5 d,連續造模8 周,游泳時間由每日10 min 逐日增加至第8 周的每日180 min,水深60 cm,水溫30℃來制備腎陰虛模型。

4.4.3 脾氣虛與濕困脾胃亞健康狀態模型

劉文俊等[38]采取飲食不節加力竭游泳的方法構建大鼠脾氣虛證模型,具體方法是3 d 為一循環,先飽食1 d,再禁食2 d,自由飲水,每在28℃~32℃水溫中游泳至力竭,連續15 d。 馮玉華等[12]通過采取措施使大鼠饑飽失常、飲食不節、負重游泳等法式使其疲勞過度聯合夾尾刺激方法激惹大鼠造成情志失調復合因素的方法構建脾氣虛慢性疲勞型亞健康大鼠模型。 劉瑤等[15]采用軀體聯合心理的復合刺激進行亞健康濕困脾胃病證結合動物模型的構造,具體采取水中站立、飲食調控、被迫游泳與改造環境等方式模擬“情志不遂、飲食不節、饑飽失常、過勞耗氣與久居濕地、外濕過盛”等具體措施。

4.4.4 心腎不交亞健康狀態模型

趙鑫等[39]采用4℃冰水游泳、45℃熱水游泳、潮濕墊料24 h、無墊料、晝夜顛倒、夾尾、震動鼠籠、禁食和禁水,每天隨機安排1~2 種刺激,持續14 d,避免大鼠對外界刺激產生適應性,之后采取大鼠腹腔注射濃度為對氯苯丙氨酸(PCPA)混懸液(濃度45 g/L,450 mg/kg),每日 1 次,連續 3 d,黃運芳等[40]直接采取對大鼠進行腹腔注射PCPA 混懸液(400 mg/(kg·d)),連續2 d 來進行模型心腎不交失眠模型的構建。

4.4.5 肝郁證亞健康狀態模型

吳天浪等[41]采用自治頸部枷鎖套在大鼠脖子上,同時加用自制的腳鐐束縛其雙后足,以限制大鼠活動,連續21 d,建成亞健康狀態(肝郁證)模型;馬作峰等[42]早在2008 年就提出亞健康從肝治的觀念,并且采取運動、睡眠剝奪、應激等符合因素進行亞健康狀態模型建立,并對其進行了評價。

5 亞健康動物模型評價

動物實驗研究中,科學合理的評價是動物模型具有可重復性的基礎。 目前對于亞健康的定義、診斷和分類等尚未形成統一的標準,那該如何來評價亞健康狀態動物模型的優劣? 根據亞健康產生與各種應激密不可分,慢性應激時,機體內穩態處于失衡狀態,可以引起動物行為學的改變,也可通過應激引起一系列的神經生化改變,進而影響到情緒變化,機體免疫力下降等。 因此,對于亞健康動物模型的評價雖無統一標準,但大多通過行為學、免疫學、神經遞質等方面來進行研究與判斷。

5.1 亞健康動物模型行為學改變

現有的亞健康動物模型中大多從行為學方面對模型動物進行了評價,包括動物毛發、體重、食欲,大便形態、活動量,也有通過曠場實驗、morris 水迷宮實驗、穿梭主動回避實驗等考察動物模型學習記憶能力和活動時間,通過懸尾實驗、游泳耐力實驗等判斷模型大鼠的絕望時間、活動耐力、情緒變化等[32,27]。 囤秀秀[22]建立心理亞健康大鼠模型后通過糖水偏愛、高架十字迷宮、明暗箱、曠場等行為學實驗結合模型大鼠體質量和臟器指數未發生明顯變化進行模型評價。

5.2 實驗檢測指標及腦中神經遞質的變化

5.2.1 血液生化及肝腎功能相關指標的變化

目前對于亞健康狀態的診斷和評估方法有許多種,量化診斷法是其中一種常規的檢查方式,即體液微觀篩查技術,就是對血液代謝性指標、心肌酶譜等生化指標進行檢測,由于亞健康狀態的誘因眾多,如疲勞、不良生活方式、工作壓力等不同因素誘導產生的亞健康狀態的臨床癥狀與實驗室檢測指標均有所不同。

王德軍等[43]探討多因素、熱水游泳、睡眠不足和WRS 所致亞健康大鼠模型結果發現不同因素誘導的亞健康狀態大鼠的血液生化、血氣電解質指標均出現了不同程度上的改變,因此判定血液生化和血氣電解質指標能有效評估亞健康狀態機體血液微環境的改變。 睡眠剝奪亞健康大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平明顯升高,而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平則明顯降低,同時血液pH 值降低,出現酸中毒表現,動脈血氧分壓(arterial oxygen partial pressure,PaO2)和氧飽和度(oxygen saturation,SaO2%)均明顯低于正常組[27];強制游泳建立的小鼠疲勞型亞健康模型檢測發現血漿中總 SOD 和乳酸脫氫酶( lactate dehydrogenase,LD)活性降低,代謝積累物MDA 及BUN 含量增加,保持同等運動強度一周后,小鼠疲勞狀態未得到恢復,證明2 周的強制游泳時間可以建立較為穩定的疲勞模型[22]。 Sachdeva 等[44]通過強迫游泳28 d 建立的疲勞性亞健康大鼠模型中發現模型組大鼠除行為上有明顯改變外,氧化亞硝化應激和促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-a)都有所增強。 WRS 所致大鼠亞健康狀態模型中氧自由基方面模型大鼠血清中SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性明顯降低,MDA、LD 含量明顯升高,提示亞健康狀態下抗氧化能力下降[13]。

5.2.2 免疫功能相關指標的變化

臨床調查結果顯示,亞健康患者多以脾、腎虛弱者多見,脾細胞抗體形成能力下降,白細胞移動抑制指數升高,體液和細胞免疫功能下降。 徐孝平等[45]采用不同應激源構建大鼠亞健康模型,大鼠下丘腦-垂 體-腎 上 腺 (hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA) 軸反應性失衡,因皮質醇過度釋放,從而導致內分泌的紊亂,降低淋巴細胞的功能從而出現明顯的機體免疫抑制現象。 但不同的應激源所致的相關指標變化不一致,艾秀峰等[16]從免疫功能方面對WRS 所致亞健康大鼠模型進行了評價,結果顯示與正常對照組比較,模型組大鼠T 淋巴細胞增殖能力、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)細胞活性,白 介 素-2 (Interleukin-2, IL-2) 和 干擾 素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)含量及胸腺指數均顯著下降,提示束縛應激致亞健康狀態大鼠模型的免疫功能下降;何清湖等[46]研究發現腎陽虛雄性亞健康大鼠血清IgG、IgA、IgM、大鼠脾、胸腺重量指數較正常對照組均有明顯降低。 在評價過程中生化指標存在一定的變化,尚未達到疾病診斷標準,符合亞健康定義。 還有研究通過自制應激、強迫運動和擁擠嘈雜的環境持續4 周建立亞健康大鼠模型,也是除采取行為實驗外并對其尿代謝產物進行了檢測與分析,結果顯示亞健康模型大鼠除一些能力物質的代謝紊亂外,還檢測到類固醇技術生物合成和鞘脂代謝的改變過,其中鞘氨醇和21-羥基孕烯醇酮可能是疲勞性亞健康大鼠的關鍵生物標志物,表明亞健康狀態下大鼠存在免疫功能低下和HPA 軸低活性等特點[47]。

5.2.3 腦中神經遞質的變化

亞健康狀態的實質是心身問題,目前普遍認為亞健康的主要原因為社會心理因素導致的心理應激,而中樞神經系統在心理應激過程中又起著非常重要的作用。 有研究表明束縛應激所致亞健康狀態模型大鼠腦組織中乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,TChE) 活性和 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量明顯升高[17]。 馮玉華等[12]發現亞健康大鼠模型多巴胺(dopamine,DA)、5-HT 出現先下降后升高的趨勢。 郝文麗等[32]采用復合因素建立的亞健康小鼠模型下丘腦多巴胺含量及海馬區谷氨酸受體NR2A mRNA 表達水平均顯著低于對照組,而5-HT 含量明顯高于對照組。 王秀云等[25]的研究亞健康狀態下大鼠海馬結構的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性和神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)蛋白表達減少,損害學習記憶等腦認知能力。賈臨超等[48]也進一步證實亞健康狀態大鼠大腦皮質誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表達的陽性面積和總光密度與正常對照組比較顯著增加,平均光密度值顯著減少,且病理表達圖顯示模型對照組大鼠大腦皮質的iNOS陽性表達量明顯增加,大量的皮層細胞的細胞漿內出現棕黃色陽性表達。 孟彥等[20]研究發現亞健康狀態大鼠出現明顯的疲勞狀態,海馬CA3 區椎體細胞數量減少,且形態不規則,包膜不完整,核膜不清,細胞核變形固縮,原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)觀測海馬細胞凋亡情況,陽性細胞散布于整個海馬組織。 從上述眾多的研究發現,亞健康大鼠或小鼠模型其行為上的一些表現與其神經遞質的變化密不可分,也進一步證實亞健康狀態不僅對行為學上有改變,而且對與機體的免疫力、認知水平、抗氧化能力等都有影響,使機體處于一種低質狀態。 Yasui 等[49]采取持慢性持續應力載荷刺激,將大鼠孤養在裝滿水的籠子里(水深1.5 cm),連續6 d,來建立疲勞狀態大鼠模型,結果發現,在造模第2 天就觀察到模型組大鼠腰椎背側根神經節(DRG)神經元出現超過50%的ATF3 陽性神經元,再后來在模型大鼠背角內側可見大量小膠質聚集,且模型組大鼠比目魚的肌電活動比對照組高2~3 倍,這些結果都表明慢性本體感受器激活誘導神經元,沿序激活脊髓反射弧,神經元的激活進一步激活沿弧形的小膠質細胞,表明本體感受器誘導的小膠質細胞激活可能使啟動關鍵因素,以及疲勞型患者異常疼痛的維持原因。

6 小結

目前亞健康動物模型的構建大多集中在中醫證型相結合亞健康、疲勞型亞健康和心理亞健康模型,已有多個團隊進行了亞健康造模的探討,也得到了一定的認可,但仍為形成一個較為理想、成熟、公認的動物模型,造模應激源多種多樣,造模時間長短不一,評價指標不統一、不典型,其實質在于人體本身是一個復雜的機體,且引起亞健康的原因又復雜多樣,該從哪些方面去著手構建動物模型仍需不斷研究探索。 同時也需進一步挖掘與完善亞健康動物模型構建的理論依據。