褪黑素在骨肉瘤治療中的應用機制

譚芷芬,張宏方?,郝曉霞,蔡 婧

(1.陜西中醫藥大學醫學技術學院,西安 710000;2.西北大學生命科學院,西安 710000;3.陜西中醫藥大學基礎醫學院,西安 710000)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)大多起源于間充質干細胞(MSC)或更定向的骨祖細胞,占原發性惡性骨腫瘤發生率的25%~30%,是兒童與青少年最常見的骨腫瘤。 骨肉瘤病發原因和具體機制目前尚未明確,治療手段十分有限,而手術治療是骨肉瘤治療的主要手段。 對于某些晚期骨肉瘤患者,術后復發患者或處于轉移期的患者來說,只能通過藥物與大劑量的化療姑息性治療。 伴隨新輔助化療方案的實施,骨肉瘤患者的5 年生存率已有較大提高[1]。 因此,尋找并開發新的有效藥物,從而提高骨肉瘤患者的生存率和生存質量是當前臨床上亟待解決的重要問題。

褪黑素(melatonin,MT),又稱N-乙酰基-5-甲氧基色胺,是一種由松果體產生的吲哚類激素。 晝夜的節律變化、四季的更改替換和環境光信號的強弱變化均能影響機體褪黑素的含量。 褪黑素在不同生理狀態中均發揮著不同的作用,如調節睡眠-覺醒周期、抗氧化和改善機體免疫功能等[2]。 體內外實驗表明,褪黑素可減緩諸如肝癌、乳腺癌、卵巢癌等疾病的發生發展[3]。 此外,褪黑素在骨骼的形成中也發揮著至關重要的作用,其激素水平與骨代謝密切相關,而褪黑素的缺乏可能與骨肉瘤的形成和發展相關[4]。 因而,褪黑素能夠作為一種潛在的治療候選或作為佐劑與其它抗腫瘤劑共同作用于骨肉瘤治療。

1 骨肉瘤發病機制

骨肉瘤的發病原因復雜,目前認為化學物質、電離輻照、基因突變、相關病原病毒感染等可能與其發病相關[5],主要發病人群為兒童和青少年,發生部位通常位于長骨干骺端,具有發現晚、進展快、浸潤與轉移早、死亡率高等特點,且多數骨肉瘤患者的病因學仍不明確。 骨肉瘤患者最初的臨床癥狀表現為關節周圍輕度疼痛伴酸脹感,伴有組織腫脹,后可觸及疼痛部位的腫塊,伴有局部紅腫和關節活動受限,多表現為持續性疼痛,夜間加重,通過休息與藥物治療,疼痛未見明顯緩解。 臨床上尚無統一標準對骨肉瘤分型,可根據骨肉瘤的具體位置,腫瘤分化程度,腫瘤組織特征等進行分類。

1.1 骨肉瘤的發生與基因遺傳學相關

基因突變是骨肉瘤發生的重要原因之一。 通過基因組范圍的預測、基因表達的評估和表觀遺傳修飾的分析,研究者們指出骨肉瘤與復雜的克隆性染色體數目和染色體結構異常、乳酸脫氫酶增高、分子遺傳學改變和基因產物過度表達相關[6-7]。 最常涉染色體數量與結構異常及基因的過度表達,涉及的染色體有12q13-15、3q26、1p21-23、8121-23、17p11-12 等;涉及的基因有細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、MET 原癌基因(MET)、FOS 基因家族(FOS、FOSB、FOSL1 和FOSL2)、MDM2 癌基因、MYC 癌基因(C-myc, N-myc, L-myc)等[8-9]。 骨肉瘤中MYC、CDK4 和MDM2 基因的過度表達則多表明骨肉瘤預后差[7]。 例如,許多腫瘤的發生與WWOX 基因的表達相關,WWOX 作為一種腫瘤抑制因子,與腫瘤的侵襲性和預后有關。 如骨肉瘤患者的病例中,約有30%的病人可觀察到WWOX 基因的減少,直觀的表達了基因的突變與缺失與骨肉瘤密切相關[10]。 此外,在散發性骨肉瘤中存在P53基因和視網膜母細胞瘤基因1 (Rb1)突變的情況[9]。 Rb1 基因突變導致轉錄因子E2F 功能增強。在原發性骨肉瘤中,高水平的E2F1 具有生長抑制作用,如P73 誘導[11]。

1.2 骨肉瘤的發生與細胞的異常增殖和凋亡相關

骨肉瘤的發展與調控細胞生長的癌基因的過度表達有關。 例如:參與骨肉瘤的信號通路網絡之一細胞外調節蛋白激酶ERK 是絲裂原活化蛋白激酶MAPK 家族中重要的成員,調節細胞的增殖和凋亡。 高天等人證實,柴胡皂苷D 可以使ERK1/2 的表達下降,腫瘤細胞的增殖作用減弱,而腫瘤細胞凋亡作用加強[12]。 同時,骨肉瘤的發生與抑癌基因的變異、丟失和失活有關,例如野生型P53 基因是腫瘤相關的抑癌基因,調控相關轉錄因子,參與轉錄的下游靶基因失活,并通過細胞凋亡和細胞周期阻滯等途徑抑制腫瘤增殖與轉移。 P53 基因失活(即突變型P53)能夠抑制腫瘤細胞凋亡,在腫瘤組織與細胞中高表達,進而發揮血管生成、侵襲和轉移的作用。 張躍[13]發現細菌氧化還原蛋白Azurin可以結合P53 基因而穩定P53 蛋白結構,其抑制了骨肉瘤的生長。 PTEN 基因為雙專一性磷酸酶活性抑癌基因,PTEN 蛋白低表達時,提示惡性腫瘤發生或進行性生長。 據報道PTEN 蛋白在骨肉瘤中低表達,為miR-208a-3p 的直接靶點,PTEN 蛋白失活使細胞周期負調控能力異常,其與miR-208a-3p 的表達呈負相關,促進骨肉瘤發生[14]。

此外,骨肉瘤的發生與抑制細胞凋亡的癌基因表達高度相關。 Bcl-2 家族蛋白受線粒體調節進而發揮促細胞凋亡作用,Bcl-2 與骨肉瘤的預測、預防、發生、發展過程高度相關。 高宇等發現,在骨肉瘤中下調Bcl-2 的水平可抑制骨肉瘤細胞的增殖。 此外,正常骨組織Bcl-2 的陽性表達率低,但在骨肉瘤中高度表達[14]。 Bag-1 是Bcl-2 結合抗凋亡基因,Bag-1 編碼的蛋白可以通過與多種分子靶點相互作用進而調節細胞的生長調控途徑(包括凋亡、信號轉導、增生、轉錄和細胞能動性等[15]),在腫瘤中表現尤甚。 多種惡性腫瘤中Bag-1 陽性表達,同時Bag-1 可以與Bcl-2 結合,增強Bcl-2 的抗凋亡作用,而后者也可單獨抑制細胞的凋亡[13]。 Mcl-1 是Bcl-2 家族蛋白抗凋亡亞家族中的另一種抗凋亡蛋白,并在各種惡性腫瘤中高表達,下調Mcl-1 可以促進細胞凋亡[16]。 在阿霉素作用下,骨肉瘤中Mcl-1 蛋白呈高表達,同時經Mcl-1 轉染后,過表達Mcl-1 可以抑制Caspase3/7 的活化[16]。 Bcl-xl 表達下調與caspase-3 的表達上調相關,顯著增強了腫瘤的放射敏感性和化學敏感性[17]。 此外,TGF-β 蛋白是五種異構體(轉化生長因子-β1-5)超家族的成員之一,對骨肉瘤細胞系具有促有絲分裂作用。 TGF-β1 生長因子在腫瘤中起著促進與抑制的“雙刃劍”作用,即早期抑制腫瘤生長,晚期則促進腫瘤的侵襲、遷移[18]。 同時,青少年在青春期飛速成長,骨生長率與骨肉瘤的發生率可能存在相關性,性激素的紊亂也是骨肉瘤的發生原因之一,大量的性激素與對應的受體可直接影響骨肉瘤的生長[19]。

2 褪黑素作用于惡性腫瘤的機制研究

褪黑素是哺乳動物的松果體、胃腸道、視網膜和骨髓等器官分泌的一種吲哚類激素。 褪黑素在多項實驗中均表現出顯著的抗腫瘤作用,被認為是治療腫瘤的潛在藥物,具有強大的抗氧化與抗炎作用。 在正常細胞中,褪黑素發揮抗凋亡作用,而腫瘤細胞中則發揮促凋亡作用[20]。

2.1 褪黑素通過促凋亡抑制腫瘤生長的研究

褪黑素誘導腫瘤細胞發生凋亡,可通過壞死、核破碎、核溶解等途徑影響細胞,而這正是褪黑素能夠發揮腫瘤治療作用的重要原因。 褪黑素能夠增強腫瘤壞死因子-α(TNF-α)介導的宮頸癌Hela細胞凋亡,并與TNF-α 共同作用引起線粒體能量代謝紊亂,使線粒體凋亡介導的宮頸癌Hela 細胞凋亡[21]。 細胞朊蛋白(Cellular prion protein,PrPC)在神經、肌肉和心臟等多種組織的細胞中高度表達,而褪黑素能夠誘導PrPC 低表達,從而活化LKB1/AMPK/mTOR 信號通路,并最終降低膀胱癌的發生[22]。 在MDAMB-361 乳腺癌細胞中,褪黑素具有促凋亡作用,通過抑制p300/NF-κB、COX-2/PGE2和PI3K/AKT 信號通路來增加凋亡酶激活因子Apaf-1 的表達[23]。 此外,褪黑素能夠增加Bax 的表達,并誘導細胞色素C(cytochrome C)、Bax 和p53 的釋放并抑制Bcl-2 釋放,刺激caspase3、6、7、9 活性裂解,進而誘導卵巢癌凋亡[24]。

2.2 褪黑素通過抗增殖抑制腫瘤生長的研究

延緩腫瘤細胞的增殖能力、抑制腫瘤的發生發展,是褪黑素抗擊腫瘤的另一優勢。 褪黑素能夠激活正常細胞中的ERK1/2 而抑制腫瘤細胞中的ERK1/2,從而發揮抗腫瘤細胞增殖的作用,并降低腫瘤對化療的耐藥性。 研究表明,ERK1/2 可調節細胞分裂,而褪黑素可阻止細胞內ERK1/2 的表達。在胃癌細胞系MFC 細胞中,褪黑素干預能夠下調ERK1/2 與Akt 的磷酸化水平,并發揮胃癌細胞的抗增殖作用。 在腫瘤演變過程中,TGF-β1 信號通路可發生異常,某些腫瘤細胞(如胃癌細胞)可以合成分泌TGF-β1。 宋軍[25]研究發現,大劑量的褪黑素能夠抑制胃癌患者血清中TGF-1β 的分泌,下調胸腺中CD4+CD25+Treg 的表達。 凋亡抑制因子Survivin 的低表達可增加腫瘤的細胞凋亡和化療敏感性,并發揮抗腫瘤作用。 褪黑素可以延長細胞在G0/G1 期積聚或延遲進入S 期發揮抗增殖作用。如HepG2 肝癌細胞中,給予褪黑素干預后,HepG2細胞中可見周期滯留和凋亡[26]。 魯倩倩[26]的研究證明了褪黑素可以使腫瘤細胞滯留于G1 期,進而減少S 期細胞。

2.3 褪黑素在腫瘤預防轉移中的作用

腫瘤轉移一直是臨床中迫切解決的問題,褪黑素已被證明有預防各種腫瘤轉移的作用。 例如在肺癌與前列腺癌的骨轉移中,褪黑素可直接減少骨細胞分化,骨吸收活性,促進成熟骨細胞的凋亡,下調p38/MAPK 通路表達,抑制RANKL 產生[27]。 基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、人表皮生長因子受體-2(HER2) 和MAPK/ERK 信號通路的激活可增加腫瘤細胞的侵襲力,腫瘤血管新生和淋巴管新生促進腫瘤細胞的浸潤和轉移[28]。 研究表明,褪黑素的使用可顯著降低MAPK/ERK 的表達,抑制腫瘤細胞的生長,并減少腫瘤治療中化療和放療引起的氧化應激和毒性[29]。 在對卵巢癌細胞SKOV3 的研究中發現,褪黑素能通過阻止上皮間質轉化相關的能力,對卵巢癌細胞SKOV3 產生一定的毒性,并抑制卵巢癌細胞SKOV3 的浸潤與轉移[24]。 而在聯合用藥中,褪黑素通過PI3K/AKT 和Jak/Stat3 信號通路與脂多糖(LPS)聯用解除由M1 型巨噬細胞發生的LPS 耐受,使巨噬細胞維持M1 型以實現抗腫瘤的目的[30]。 臨床中順鉑(DDP)可引起患者耳毒性,使用褪黑素治療后可降低相應的毒性反應。 體內實驗研究表明,褪黑素能夠降低DDP 的腎毒性和急性腎損傷[31]。 此外,在人結腸癌細胞實驗中,輻射與褪黑素聯合治療能夠顯著改善該腫瘤細胞對γ 射線輻射敏感性,從而對該腫瘤細胞生長有顯著抑制效應并發揮其抗腫瘤作用[32]。 以上研究表明,褪黑素具有潛在的腫瘤治療效應,褪黑素能夠作為初級治療藥物用于腫瘤的輔助治療,或通過聯合用藥來增加其抗腫瘤作用。

3 褪黑素在骨肉瘤中的應用機制

目前,骨肉瘤的治療存在手術治療致殘率高、假體功能差、放化療毒副作用大、治療晚期骨肉瘤容易產生藥物耐受等問題,且復發率較高,患者的生存質量差,生存率低,而褪黑素在骨肉瘤中的研究為臨床中骨肉瘤的治療打開了新視野。

3.1 褪黑素在骨肉瘤中發揮促凋亡的作用

誘導腫瘤細胞凋亡是褪黑素抗擊骨肉瘤發生的重要機制之一。 林晉等[33]發現褪黑素能夠通過Survivin 的表達調控骨肉瘤細胞MG63 和U2 的凋亡,降低Survivin 蛋白的活性與提高半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的活性可發揮促凋亡作用。 另外,骨肉瘤U2 細胞中,褪黑素能夠通過將細胞阻滯于G2/M 期,同時上調Fas 蛋白表達來發揮其促凋亡作用[34]。 聯合用藥時,低濃度的DDP 與褪黑素聯合用藥可以實現與甲氨蝶呤(MTX)等同的抗腫瘤效應[35]。 褪黑素影響脫乙酰化酶SIRT1 的表達是實現細胞凋亡的重要路徑。 SIRT1 主要依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)發揮作用,抑制SIRT1的表達可作為治療骨肉瘤的一種潛在選擇[36]。 另外,褪黑素可誘導骨肉瘤SOSP-9607 細胞凋亡,調控P53 的乙酰化作用降低Bcl-2 的水平,上調Bax 和Cytochrome C 的水平能夠阻斷SIRT1 信號通路,從而觸發內在的凋亡途徑[36]。 在對骨尤文氏肉瘤細胞的研究中,褪黑素能夠通過上調Fas 死亡受體與其FasL 配體的表達水平,且同時通過Fas/FasL 系統誘導骨肉瘤細胞凋亡[37]。

3.2 褪黑素在骨肉瘤中發揮抗增殖的作用

由于褪黑素受時間調控,因而某些特定的時間點褪黑素的激素水平表達較低時,則伴隨著骨肉瘤的高病發率。 假設提高褪黑素的激素水平可以降低骨肉瘤的發病率,即褪黑素對骨肉瘤細胞具有抗增殖作用。 已有多項研究表明褪黑素可調節多種信號通路來發揮抗骨肉瘤作用。 如骨肉瘤細胞SaOS-2 研究中,褪黑素可抑制細胞活性,阻斷G1 期細胞周期,誘導細胞凋亡,發揮抗增殖作用,且褪黑素對低濃度DDP 有拮抗作用,而對MTX 或高濃度DDP 有協同作用[38]。 高水平的褪黑素會以時間依賴性方式對骨肉瘤MG-63 細胞具有抗增殖作用,特異性地下調ERK1/2 的磷酸化,將顯著下調與細胞周期G1 進程相關的細胞周期蛋白D1 和CDK4 蛋白的表達,以及其G2/M 期有關細胞周期素B1 和CDK1 蛋白的表達來充分發揮骨肉瘤中的抗增殖作用[39-41]。 此外,褪黑素抗增殖的另一重要內在機制為上調P53 的表達,下調C-myc 基因的表達,且其抗增殖作用與絲裂原激活激酶和AKT 信號轉導有關。 同時,一些證據表明褪黑素與抑制劑PD98059聯合使用對ERK1/2 具有雙重阻斷作用,且褪黑素本身可以特異性抑制ERK 轉變為p-ERK[39]。 同時,褪黑素可以抑制血管內皮生長因子A(VEGFA)中對miR-424-5p 的表達調控,調控腫瘤血管形態,血管原生長因子與周圍內皮細胞增殖和遷移。 激活miR-424-5p/VEGFA 軸在腫瘤抑制中起關鍵作用[42]。

3.3 褪黑素受體在骨肉瘤中的應用機制

褪黑素受體在不同的腫瘤中有著不同的抗腫瘤作用,其受體屬于G 蛋白偶聯受體超家族,包括的亞型有MT1、MT2、MT3。 人類主要有MT1 和MT2兩種亞型的褪黑素受體,MT1(由MTNR1A 編碼)和MT2(由MTNR1B 編碼)主要負責調節相應的下游效應[43]。 已有的研究認為MT1 對于腫瘤細胞增殖的調節起重要作用,而MT2 主要調節晝夜節律、血管舒張、機體免疫功能等,且MT2 受體廣泛分布于成骨細胞、四肢血管和視網膜等。 這些分布位置為褪黑素治療骨肉瘤奠定了基礎[43]。 另外,骨肉瘤與M1 受體密切相關[44],MT1-mRNA 和MT2-mRNA 在骨肉瘤細胞HOS 和MG63 中的表達,為褪黑素在骨肉瘤治療中的應用提供了研究基礎。 此外,大多數MT1 受體在骨肉瘤臨床試驗中呈強陽性表達。 例如,在骨軟骨瘤中,有14.2%的標本MT1 受體呈弱陽性表達[45],表明編碼MT1 受體的基因在骨肉瘤的發展過程中被激活,從而表達大量的MT1 受體。

3.4 褪黑素在骨肉瘤轉移中的應用機制

臨床治療骨肉瘤最為棘手的問題之一就是骨肉瘤的轉移。 研究證明,褪黑素對骨肉瘤細胞浸潤與轉移有防御作用,并有濃度依賴性,其機制與蛋白激酶A(PKA)和肉瘤基因Src 平行參與介導環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)依賴性基因轉錄相關[46]。 SOX9 轉錄因子是褪黑素介導骨肉瘤的關鍵因子之一,在骨骼生長中發揮著重要作用。 體內實驗研究表明,褪黑素能夠顯著抑制模型小鼠中骨肉瘤的啟動和轉移,并調節骨肉瘤細胞的上皮-間充質轉化(EMT)標記,并下調SOX9 參與的信號通路,從而阻止其發生和轉移[47]。 此外,褪黑素還可通過細胞骨架重組、細胞外基質重塑、上皮-間充質轉化來抵消血管生成反應,從而抑制骨肉瘤腫瘤細胞的轉移與浸潤[48]。 在骨肉瘤的轉移樣本中,Notch1 和Notch2 受體在高度轉移的骨肉瘤標本呈高表達[49]。Fas/Fas 配體通路的下調使細胞促凋亡作用減弱并發生骨肉瘤的轉移,而Src 和Wnt/β-Catenin 通路也參與其中[49]。 此外,褪黑素的細胞毒性低,并顯著抑制細胞的機動性。 如褪黑素可下調骨肉瘤細胞U2OS 中的趨化因子CCL24 的表達水平[50],而CCL24 的表達水平是影響骨肉瘤細胞遷移的關鍵。細胞遷移和侵襲,因高表達的CCL24 而增強,并因CCL24 的沉默而減弱。 減少細胞外ERK1/2 和JNK1/2 的激活,可下調CCL24 的表達[42]。 降低CCL24 的表達與抑制JNK 信號通路的轉導可預防骨肉瘤的浸潤[50]。 綜上所述,這些結果說明褪黑素可由多種途徑和機制發揮抗骨肉瘤的作用。

4 結語

骨肉瘤最常見的骨原發惡性腫瘤之一,其近年來5 年存活率已從20 世紀50 年代的20%上升至55%~70%[1],骨肉瘤晚期患者的生存質量差,多進行姑息療法。 提高患者生存率與生存質量是臨床中治療骨肉瘤最需解決的問題之一。 盡管臨床有許多可用的抗腫瘤療法,但臨床治療中出現的副作用也是層出不窮。 研究人員試圖找到新的藥物與治療方法來克服目前骨肉瘤臨床治療上所面臨的問題。 由于骨肉瘤的發病率與褪黑素水平相關,同時該激素在多種腫瘤中的運用有著良好的抗腫瘤作用,因而可作為治療骨肉瘤的新候選藥物或潛在藥物。 總的來說,目前,褪黑素單獨或與其他治療藥物聯合使用可能是骨肉瘤腫瘤治療的一個很好的選擇。 同時,褪黑素治療骨肉瘤的具體機制尚未完全解開,需要更進一步研究。