在與變應性鼻炎比較中探索局部變應性鼻炎模型的建立

曹文燦,蔣明君,馮勝嵐,敬 然,李林霜,李玖林,劉 洋,李昕蓉?

(1.成都中醫藥大學附屬醫院耳鼻喉科,成都 610072;2.成都中醫藥大學,成都 610072)

局部變應性鼻炎(local allergic rhinitis,LAR)是具有典型變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)癥狀,血清特異性IgE(allergen specific IgE,sIgE)及變應原皮膚點刺實驗(skin prick test,SPT)陰性,而變應原鼻腔激發試驗陽性、鼻腔局部sIgE 陽性的I 型變態反應性疾病[1]。 有研究顯示47%~62.5%的SPT 和外周血sIgE 陰性患者可能為LAR,過去的部分非變應性鼻炎(non-allergic rhinitis,NAR)或特發性鼻炎可能實際上是LAR[2]。 雖然LAR 確切發病率有待進一步研究,但近年臨床流行病學調查則提示我國華南地區鼻炎患者中14.3%為LAR[3],Rondon 等[4]則發現西班牙鼻炎患者中LAR 約占25.7%,LAR 的流行率總體呈高發趨勢,隨著環境惡化及空氣污染的加劇可能進一步升。 LAR 逐漸成為一個常見但未被充分認識的疾病,其發病機制及病理學研究還有待進一步深入[5],LAR 動物模型則是最有效的研究手段之一。

相對LAR,AR 的動物模型及發病機制研究較為深入。 1988 年首次應用甲苯二異氰酸酯(2,4-tolylenediisocyanate,TDI)成功制成的豚鼠AR 模型問世后[6],AR 動物模型研究便未停下腳步。 由于AR 動物模型研究的成熟性及LAR 與AR 的相似性,LAR 動物模型的建立在一定程度上借鑒了AR造模經驗,這使得LAR 與AR 動物造模既有關聯又有區別。 本文在與AR 動物模型的對照中,就LAR動物模型的研究進展做如下綜述。

1 動物模型建立方法

1.1 動物選擇

選用無特定病原體動物(specific pathogen flee animal,SPF)以消除其他無相關因素對實驗的影響是動物選擇的前提[7]。

既往AR 造模多用豚鼠。 使用豚鼠造模的優勢在于其血清補體豐富,易致敏而產生IgE、IgG 等高效價抗體而誘發速發相反應和遲發相反應[8],豚鼠對抗過敏藥物敏感,因此經常被用于過敏性疾病的發生機制以及藥物治療效果方面的研究。 但豚鼠飼養成本高,環境控制要求較為嚴格,且致敏的豚鼠極易激活補體系統釋放過敏毒素C3a 和C5a 等導致因毛細血管通透性增加、支氣管平滑肌痙攣致死而影響建模成功率,增加實驗成本[9]。

小鼠也是AR 常用且理想的造模選擇。 相對于豚鼠,小鼠價格低廉、飼養簡單、對變應原反應較為迅速,且基因圖譜已被科學家研究繪制完成、分子免疫學也已被深入的研究。 不同小鼠品系具有不同氣道反應性、T 淋巴細胞免疫等方面特點,可根據不同的變應原選擇小鼠品系,如:C57BL/6 小鼠對塵螨和豚草抗原的反應性較強,而BALB/c 小鼠較易產生針對卵白蛋白(OVA)和花粉的高滴度IgE 等[10]。

大鼠是現今常用的AR 造模動物。 大鼠兼有小鼠和豚鼠的優點,繁殖力強,產仔多,生長發育快,對吸入性刺激物易敏,易產生IgE 并表現出明顯的遲發相反應,且遺傳性狀穩定。 但大鼠的體重有較大的差別,應按體重分組使用,避免應大鼠體重造成的實驗誤差。

基于AR 建模經驗,目前LAR 動物模型更多地選用了小鼠。 陳柏文等[11]選用BALB/c 小鼠經1%OVA 滴鼻10 d 后成功建立LAR 動物模型,出現明顯噴嚏及鼻中隔嗜酸性粒細胞浸潤,鼻腔灌洗液IL-5、IL-13 增高但不伴有血清sIgE 增高。 Kato 等[12]使用野生型BALB/c 小鼠并以豚草花粉(1 mg/20 μL 磷酸緩沖液)分3 個階段(第0~5,7~12,14~17天)間斷性滴鼻建立LAR 動物模型,即便變應原刺激停止1 周,小鼠仍表現出噴嚏等過敏癥狀而不伴有血清sIgE 的增高,成功建立LAR 小鼠模型。

對LAR 的探索動物模型的探索已不止于僅建立有鼻部AR 癥狀且血清sIgE 陰性的動物,而是深入到LAR 免疫過程的動態觀察、揭示該過程中炎性細胞的網狀關聯作用以尋求LAR 免疫反應的核心環節。 為研究LAR 免疫反應過程中IgE 與B 細胞、肥大細胞等炎性細胞的交互作用,Kato 等[12]采用基因敲除小鼠,對缺乏IgE 高親和受體(Fcer1a-/-)及B 細胞缺乏(lghm-/-,μMT)的BALB/c 小鼠行豚草花粉致并與野生型小鼠相對照。 結果提示Fcer1a-/-及lghm-/-( μMT) 小鼠噴嚏明顯減弱,但不論Fcer1a-/-還是野生型小鼠在致敏早期(致敏第7 天)或是致敏晚期(致敏3 周)頸部淋巴結(cervical lymph node,cLN)細胞產生的Th2 細胞因子及嗜酸性粒細胞浸潤均出現類似變化,說明IgE 對于炎性細胞的招募及激活并非必需。

為進一步證實固有免疫反應抑或是獲得性免疫反應是LAR 更為重要的病理過程,Kato 等[12]進一步使用了B 細胞和T 細胞缺如的Rag2-/-BALB/c小鼠,結果提示Rag2-/-較Rag2+/+小鼠噴嚏頻率隨時間推移明顯減少,且CD45+CD3-B220-細胞中CCD3+Singlec-F+中的比例也明顯減少,說明T 細胞對于肥大細胞及嗜堿性粒細胞功能的維持具有重要作用,且獲得性免疫可能是LAR 核心病理環節也可能是將來LAR 的治療調節靶點。

總體說來,LAR 作為一個待深入的研究目標,所選動物種類較為局限,還有待更為豐富的造模物種類型。

1.2 變應原選擇及致敏方法

LAR 已成功造模的變應原主要有豚草花粉、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)。 豚草花粉對人體有較強的致敏作用,是主要的吸入過敏源之一;OVA 是一種具有載體活性的抗原蛋白質,具有很強的免疫原性,OVA 致敏后產生的抗體具有持久性。 兩者均廣泛的應用于建立LAR、AR 動物模型。

在致敏方法上,LAR 與AR 出現了較大的不同:

AR 致敏常分為基礎致敏、加強致敏和局部激發3 個階段,各階段采用的致敏方式稍有不同。 AR基礎致敏可用腹腔注射、皮下注射、灌胃和滴鼻。腹腔注射與皮下注射能快速建模,其中腹腔致敏最為常用。 但隨研究深入,發現腹腔注射致敏的建模方式與自然病程存在差異。 與之相比,滴鼻雖需花費更長時間,但更接近自然發病進程,因此滴鼻致敏越來越受研究者的青睞。 AR 加強致敏常用方法有滴鼻、霧化吸入、皮下注射。 因霧化吸入容易導致OVA 吸入下呼吸道引發哮喘,因而加強致敏普遍使用變應原滴鼻。 目前國內外AR 動物模型流程沒有統一標準,但基本共識是低濃度腹腔注射基礎致敏,后高濃度滴鼻激發,一般需要2~6 周[13]。

與AR 造模相比,LAR 致敏時間更短,致敏部位也更為局限,不采用全身致敏,常直接以變應原滴鼻實現鼻敏化。 Kato 等[12]以1 mg 豚草花粉混懸于20 μL 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)制成致敏液,采用“三階式”致敏法:第一周和第二周連續6 d、第三周連續4 d,即第0~5 天、第7~12 天和第14~17 天滴鼻,同時以PBS 單獨滴鼻作為對照;或者豚草花粉(1 mg 加入20 μL PBS)致敏液持續滴鼻于第3、5、7天間斷滴鼻或無間隙連續滴鼻10 d,但具體的滴鼻劑量及滴鼻細節未行進一步介紹。 陳柏文等[11]以PBS 配置1% OVA(V 級,Sigma 公司,美國),0.22 μm 尼龍網過濾后分裝于1.5 mL 離心管-20℃保存,隨后分別采用兩種方式制作LAR 小鼠模型:一是“二段分割式”,首周以1% OVA 溶液連續滴鼻5 d,間隔2 d 后次周連續滴鼻4 d 結束造模,即第0~5天、第8~11 天;另一種方法是“五天三步式”,即第1、2 周每周5 d,歇1 周,第4 周5 d。 為精細化每次滴鼻劑量,該課題組以碳素墨水滴鼻發現當每側鼻孔滴鼻劑量大于5 μL(7.5 μL,10 μL)時,解剖小鼠發現氣管和食道中出現肉眼可見的墨水痕跡,因此5 μL 為每側滴鼻推薦劑量。

此外,為避免因滴鼻藥液倒流致嗆咳使藥液進入肺部和食道而增加肺部炎癥及增強細胞因子的表達,滴鼻時可稍反折小鼠頸部,緩慢滴鼻,5 μL 分3~4 次,至小鼠完全吸收再滴入下一滴,滴完一側再操作另一側,避免引起嗆咳,影響實驗準確性[7]。

2 AR、LAR 造模的實驗評價方法

LAR 動物造模參照AR 模型評價方式,包括表觀指標,病理指標和生化指標,其中生化指標包括血清學測定和細胞因子檢查,血清學測定是確定建模成功關鍵而有效的方式。

2.1 表觀指標-行為學評價

動物行為學評分僅作為建模成果與否的初評參考。 該法較為簡單,但易受主觀因素影響,故不建議單獨使用判斷是否建模,可作為第一步判斷建模是否成功的方法與其他方法一起聯合使用。

AR 建模成功與否的行為學評分可參照2018 年中華中醫藥學會中藥實驗藥理專業委員會擬定標準[14]:從每次致敏開始根據出現鼻癢、噴嚏、鼻清涕及鼻塞等鼻變態反應癥狀等進行積分累加,共30 min。 主要表觀指標的分類見表1。

在2018 年中華中醫藥學會中藥實驗藥理專業委員會擬定標準之前行為學評分已被列為一項觀察指標,觀察方法同表1 總積分大于5 分便可認為造模成功[15],被認為客觀性較低。 現改進后多采用如下方法[14]:試驗結束后,行為學評價各癥狀表觀指標權重系數為0.4 與炎性細胞因子測定,組織病理學觀察和細胞因子檢查總積分乘以相應指標的權重,將指標積分相加,即變應性鼻炎動物模型制備成功時的總積分。 所得總積分大于0.7,便可認為造模成功。

表1 變應性鼻炎主觀指標評分Table 1 Subjective index score of allergic rhinitis

LAR 行為學評價仍參照AR 的標準。 但陳柏文等[11]發現OVA 末次激發后經10 min 觀察,單純鼻腔致敏組與腹腔注射致敏組小鼠的噴嚏數無統計學差異。 Kato 等[12]采用豚草花粉第0~5 天、第7~12 天和第14~17 天“三階式”滴鼻法則發現小鼠從第5 天噴嚏次數逐漸增多,到第10 天達到高峰后即維持平穩勢態,盡管后續滴鼻到第17 天,噴嚏仍處于平臺期不再繼續增加,且到第17 天與腹腔系統致敏組相比噴嚏頻率無統計學差異。

2.2 生化指標

生化指標包括免疫球蛋白和細胞因子檢查,可動態反應造模時機體變化過程。 造模將變應性鼻炎動物模型各類指標進行分類,并確定各類權重系數,生化指標權重系數為0.3[14]。

2.2.1 免疫球蛋白測定

變應原可引起局部、血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)升高,特別是特異性IgE(specific immunoglobulin E,sIgE)能夠明確變應原種類,因此檢測IgE、sIgE 的濃度可作為判斷AR、LAR建模是否成功的標準。

AR 和LAR 免疫球蛋白測定最大的區別在于:AR 患者可在血清中發現slgE,但LAR 僅能在鼻腔局部檢測出。 抽取致敏動物的靜脈血、收集鼻腔灌洗液, 采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)測定BALB/c 小鼠血清和鼻腔灌洗液中的slgE,發現LAR 血清slgE 表達偏低,與未致敏小鼠無統計學差異,而AR 小鼠的血清slgE 明顯高于LAR(均P>0.05)[11]。

為使證據更加有說服力,Kato 等[12]測定了生殖系轉錄本(GLT)和免疫球蛋白轉換后成熟轉錄本(PST)在小鼠鼻腔和cLN 細胞中的表達(鼻豚草致敏誘導cLN-B 細胞進行類開關重組(CSR)并分化為產生IgE 的血漿細胞),證明了在小鼠出現鼻炎癥狀的第7 天,產生IgE 的B 細胞聚集,但血清抗原特異性IgE 為陰性。

現測定IgE 濃度一般采用ELISA 和被動皮膚過敏試驗(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)。 酶聯免疫吸附試驗操作簡單,不需特殊實驗設備,敏感性、特異性都較高,應用普遍。 被動皮膚過敏反應試驗同樣是一種敏感度較高、特異性較強的方法,廣泛用于許多免疫學和變態反應研究中。 但若選用大鼠或小鼠為模型則必須使用佐劑,否則會降低實驗的準確性,而使用佐劑則使實驗成本大增加,同時增加了實驗的復雜性。 研究員尚在探索PCA的改良方法。

2.2.2 細胞因子檢查

II 型固有淋巴細胞產生Th2 細胞因子IL-5、IL-13[16]。 在小鼠模型中,LAR 小鼠表現為IL-5、IL-13優勢性的表達,不僅比未致敏小鼠高,且明顯高于AR 小鼠,其結果有統計學意義(P<0.05)[11],驗證了LAR 是Th2 反應占優勢的鼻黏膜變態反應性疾病,也提示:LAR 擁有和AR 相似的Th2 及相似的炎癥介質及細胞因子,但LAR 似乎擁有更強的免疫調節。 是否可推測,在LAR 個體中,黏膜水平產生的IgE 足以使鼻效應細胞敏感,但血清的IgE 還未達到檢測水平。

在建模中還發現局部Th2 細胞的出現是第一個可檢測的信號,Th2 是一種具有調節作用T 細胞亞群,在疾病的發病機制中起著中心作用,Rag2 基因敲定小鼠,缺乏Rag2,無法發育出成熟的T 細胞,此時盡管給予過敏原刺激,但小鼠噴嚏減少,而肥大細胞或(和)嗜堿性粒細胞的活化是誘發打噴嚏的必要條件,證明T 細胞可能對維持肥大細胞或(和)嗜堿性細胞功能很重要,因此Kato 等[12]認為T 細胞可以作為一個靶向治療LAR 方向。 Th2 參與LAR 免疫反應,那么Th2 所分泌的2 型細胞因子IL-5、IL-9、IL-13 是否可作為精準治療LAR 的靶點呢?有待下一次建模繼續進一步論證。

2.3 病理指標-組織病理學觀察

小鼠受變應原刺激后,鼻黏膜組織病理學檢查可以明確地反映炎癥浸潤程度、直觀說明動物的具體變化情況。 提取LAR 動物模型的鼻部和肺部組織行蘇木精-伊紅染色,鏡下觀察鏡下水腫/炎性細胞浸潤和周圍血管情況,按照《變應性鼻炎動物模型制備規范》局部鼻黏膜病理指標分級為參考標準:病理學指標的權重系數0.3,主要分類見表2[14]。

表2 變應性鼻炎模型病理指標的分類Table 2 Classification of pathological indexes in allergic rhinitis model

Rondón 等[17]發現致敏組小鼠氣管上皮細胞排列整齊,氣管形態完整,LAR(鼻部致敏第10 天)較AR(鼻部致敏25 d)形態改變較輕,但均出現鼻粘膜上皮紊,杯狀細胞增生,嗜酸性粒細胞浸潤等現象,且嗜酸性粒細胞計數無統計學差異(P<0.05),與細胞因子檢查一致。 該現象似乎證明了LAR 是鼻部發生了過敏反應,僅由于其癥狀較輕,未引起質變,無全身過敏反應,是否隨著病程進展,將有可能進一步發展成AR?

3 LAR 與AR 動物模型傳變關聯性的研究

LAR 動物模型持續滴鼻是否會導致LAR 向伴有系統過敏的AR 轉變? LAR 是獨立疾病還是僅為AR 的早期階段? 曾有研究以LAR 和健康人群為對象進行5 年期隨訪,發現5 年后LAR 和健康人群分別有4.5%及6.81%出現系統過敏表現,組間差異無統計學意義,提示LAR 與AR 是不同的疾病[18]。有人對LAR 患者和健康患者進行10 年隨訪,觀察其演變為AR 的比率。 5 年的隨訪結果顯示發生率與健康對照組接近(<7%),十年的隨訪結果顯示LAR 患者AR 的長期發展率(9.7%)和健康對照組AR 的長期發展率(7.8%)相似[4],毋庸置疑LAR 是有別于AR 作為一種單獨的鼻炎表性存在的,并非其病程進展中的一環。

LAR 與AR 動物模型的關聯性研究為澄清二者關系提供了直接手段。 Kato 等[12]以豚草花粉或PBS(對照組)于第0~5 天、第7~12 天和第14~17天對小鼠行“三階”滴鼻后,于第18 天處死小鼠,發現豚草花粉組小鼠血清總IgE 和豚草花粉特異性IgE 和IgG1 均出現升高,組間差異有統計學意義。此外,豚草花粉致敏組小鼠頸部淋巴結的豚草花粉特異性Th2 細胞因子明顯升高,且鼻黏膜出現上皮細胞多層化和杯狀細胞化生、嗜酸性粒細胞浸潤,這似乎提示LAR 可能會向經典AR 演化。 對于這個與臨床研究較為矛盾的結論,Kato 等[12]則指出還有待大樣本、長期隨訪研究的進一步證實。 陳柏文等[11]發現“二段分割式”滴鼻組OVA 滴鼻10 d 后,LAR 小鼠血清OVA-sIgE 無升高,而“五天三步式”滴鼻組OVA 滴鼻15 d 后血清OVA-sIgE 出現了升高,這提示持續抗原接觸可使小鼠血清OVA-sIgE升高并表現出典型AR 癥狀。

雖然現有的“LAR-AR”動物模型的關聯性研究均有一定局限性,但目前證據顯示嚴格把控抗原持續刺激時間,防止LAR 向AR 的傳變仍是造模的關鍵質控環節。

綜上,AR 建模手段較為成熟,迄今為止已成功用豚鼠、大鼠、小鼠、新西蘭兔等多種動物建立實驗模型。 LAR 動物模型多依據AR 制定,其中LAR 小鼠模型因與患者相似性好、執行簡單易復制、合乎經濟價值,成為了優秀的實驗動物選擇。 目前,AR變應原種類多、致敏方法趨近統一、實驗評價方法成熟,但LAR 實驗動物和使用變應原較單一、造模方式不盡相同,故實驗流程仍需進一步優化。 盡管LAR 被認為是一種獨立的疾病,但在造模中出現了LAR 向AR 轉變的現象,且臨床研究中也發現了部分患者存在明顯的哮喘演變,LAR 是否可能進化為系統性的過敏性疾病? 這仍然是一個有爭議的課題。 因此,未來更大規模、更長時間的人類研究和動物研究是必不可少的。