外傷性視神經病變動物模型的研究進展

孫 武,周 劍,巢國俊,廖 良,謝 琦,尚孟秋

(1.北京中醫藥大學,北京 100029;2.北京中醫藥大學東方醫院,北京 100078;3.中國中醫科學院眼科醫院,北京 100040)

外傷性視神經病變(traumatic optic neuropathy,TON)是一類通常由眼眶、眼睛或頭面部創傷引起的疾病,可導致嚴重的、不可逆轉的視力喪失。 國際視神經創傷研究結果發現,TON 患者的平均年齡為34 歲,患病最常見的原因是機動車、自行車事故,以及襲擊和跌倒事故[1]。 在閉合性顱腦損傷的患者中,TON 發病率為0.5%~5%[2]。 TON 根據引起損傷的機制分為直接外傷性視神經病變(direct traumatic optic neuropathy,DTON)和間接外傷性視神經病變( indirect traumatic optic neuropathy,ITON)。 DTON 多由槍彈、骨碎片,以及創傷造成的撕脫力或局部出血直接引起[2],ITON 則常繼發于眶上緣和額顳部顱骨區鈍傷,眶尖或視神經管上傳遞的力會引發ITON[3]。 TON 目前尚無有效的治療措施,目前針對疾病治療的研究方向主要集中在視神經的修復與再生[4-6]。 合適的動物模型是進行研究的重要手段,根據臨床損傷類型,目前模型大體分為兩種:直接損傷模型和間接損傷模型。

1 直接損傷模型

1.1 視神經橫斷模型(軸切模型)

視神經橫斷(optic nerve transection,ONT)模型造成的損傷屬完全性視神性損傷,接近臨床視神經斷裂傷,該方法操作簡單易行,可保證實驗動物的損傷量一致。 步驟如下:沿頭部中線從眼睛前方0.5 cm 至后方1 cm 切開后,分離筋膜至眼眶骨,清理周圍組織。 逐一暴露眼部肌肉(上斜肌、內直肌、提上瞼肌和上直肌)后進行牽引,顯示包繞視神經的脂肪鞘。 剝離周圍結締組織,縱向切開脂肪鞘并去除脂肪,可見腦膜鞘包裹的視神經。 旋轉視神經,于腦膜鞘無血管區域縱向切割,暴露白色視神經,將視神經剪斷形成動物模型[7]。

ONT 模型主要用于研究視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell,RGC)的凋亡和存活。 研究發現,視神經橫切術后14 d 損失了90%的RGC[8-10],死亡的主要機制是凋亡。 此外,軸切術后RGC 的細胞凋亡被延遲了大約4 d,為實驗操作留下了時間窗口[7]。 該模型另一個優點是損傷后RGC 細胞存活率容易被定量化。 通過在切斷視神經時將熒光示蹤劑(3% 熒光金)應用于視神經斷端,或在軸突切斷前一周將示蹤劑注入上丘,可以隨時間追蹤RGC的存活情況。

作為研究RGC 細胞凋亡的可復制模型,ONT 模型容易建立,受損標準統一。 易于定量RGC 存活率的同時,具有高度可重現的細胞死亡時間過程。 在該模型基礎上可運用多種方法將靶標靶向視網膜或受損的RGC,以測試實驗性治療對眼底細胞存活的影響[11-16]。 此外,ONT 模型還能用于研究視神經的完全橫斷對神經系統其他部分造成的后續影響。作為直接損傷的典型模型,ONT 模型被廣泛運用于DTON 的相關研究,但造模過程中損傷引起的炎癥反應很難被減輕,對于后續藥物或其他治療措施的修復治療研究較為局限。 同時它不能作為一個理想模型進行ITON 的相關研究。

1.2 視神經擠壓模型

視神經擠壓傷(optic nerve crush,ONC)損傷模型是用于TON 的重要實驗模型,主要用于進行RGCs 存活和軸突再生方面的研究:施用示蹤染料3 d 后,于4 點鐘位置切開眼結膜。 鈍性分離外直肌,向前牽拉眼球,暴露白色視神經。 借助交叉鉗在距眼球約2 mm 處對視神經進行擠壓,持續3 s[17]。 造模中需注意擠壓神經用力不可過大,時間不可太長,以免造成眼動脈損傷,從而導致隨后的視網膜缺血。 此外,在暴露視神經時勿損壞周圍血管。

目前ONC 模型造模過程中的擠壓時間差異較大,從3 s 到60 s 不等[18-24]。 根據動物類型、模擬損傷程度或造模后的分析方法不同,時間各有差異。 ONC 模型對視神經造成的擠壓傷會導致RGC逐漸凋亡,可用于研究視神經元死亡和存活的一般過程。 另外,該模型在TON 的實驗性藥物研究中運用普遍,常被用來鑒定和測試潛在的治療劑,以治療不同類型的視神經病變。 ONC 模型操作簡單,創傷較小,損傷明確,術后動物存活率高,具有高度可重復性。 相對于ONT 模型更為溫和,可保持視神經鞘膜完整性。 該模型與ONT 模型由于操作簡單、造模設備易獲取等原因,是目前最常用的TON 模型。但ONC 模型仍存在夾持時間差異大、夾力大小不易控制、損傷程度難以精準定量等問題。

1.3 視神經牽拉傷模型

視神經牽拉傷動物模型類似于手術牽拉傷及部分外傷性損傷,按損傷方向可分為與視神經管平行或與之垂直。 前者類似視神經彌漫性軸索損傷,后者與視神經管骨折所致的切割傷相似。Gennarelli 等[25]利用豚鼠制作牽拉損傷模型,將豚鼠全麻后暴露視神經,固定于立體定位架上,利用汽缸-吊帶-視神經的傳動裝置將視神經拉直,進行造模。 該模型模仿了視神經彌漫性軸索損傷。 王開仕等[26]對該模型進行簡化:將大鼠球結膜切開1/4,用血管鉗分離至球后,將眼球向外托出至球后與眶前骨緣齊平,隨后立即恢復眼球至正常解剖位置。 該模型也出現了類似TON 的神經纖維超微結構變化,并伴有相應的電生理表現。 目前興起的橫向定量牽拉法,暴露視神經后,用聚酯縫合線于球后1~2 mm 處圈住視神經并打結,縫線另一頭連接橫向張力計,以不同拉力垂直于視神經方向水平牽拉并持續一定時間,進行造模。 該方法損傷易于定量,視神經受力均勻,對視網膜各個部位的損傷基本相同,且所需器械簡單易控,是較理想的視神經損傷模型[27]。 但此種方法操作相對復雜,對術者要求較高,易出現手術副損傷。

目前視神經牽拉傷模型,不同動物種類的牽拉方法和作用力存在較大差別[28]。 作用力大小和作用時間缺乏統一規范,是此類模型的局限。

1.4 視神經慢性壓迫損傷模型

視神經慢性壓迫損傷模型可模擬外傷后血腫、周圍組織的炎性水腫對視神經的慢性壓迫損傷,為TON 的繼發性損傷研究提供基礎。 呂立權等[29]在貓模型進行造模,取目外眥及耳屏連線皮膚切開,分離肌肉、骨膜后,磨穿顱骨并擴大骨窗。 顯微鏡下切開硬腦膜至骨緣,排除腦脊液后, 抬起顳葉腦組織,沿蝶骨棘深入直至暴露視神經。 在視神經外側植入不可脫球囊, 然后接導管穿皮下引至頸背部,完成造模。 吳昆旻等[30]在兔模型進行造模,經眶上緣分離切斷上、內直肌,暴露視神經孔,放置一細端直徑2 mm,尾端直徑4 mm,高3 mm 的圓錐軟硅膠于孔內,對視神經進行壓迫造模。

此類造模方法簡單,隨著時間推移,視神經受壓迫損傷也逐漸加重,可模擬出外傷后出血、腫脹逐漸加重而導致的軸突變性等病理變化[31]。 但該方法損傷無法定量,同時易于引發感染。

2 間接損傷模型

2.1 眼沖擊傷模型

眼沖擊傷模型模擬了炸藥傷、爆破傷等產生的沖擊波傷害,對于研究爆炸沖擊傷所造成的TON 研究起到了重要作用。 此模型需要一套特定的操作系統,包括加壓空氣罐,連接空氣罐的機槍管彩彈槍,在暴露動物眼睛時保護眼睛不受直接傷害和回彈傷害的密閉空間,以及可對槍管進行操控的移動平臺。 將小鼠眼球位置固定后,調整預期壓力,操控機槍槍口與鼠眼至合適距離,對準眼睛進行爆破,建立模型[32]。 該操作裝置通過計算預期壓力,然后根據預期壓力確定最佳壓力傳感器的位置,進而調整輸出壓力,實現精準沖擊傷。

此系統產生的損傷與眼部沖擊傷患者所受損傷相似,可再現地使眼睛暴露于已知壓力的沖擊波中。 由于身體其余部分都受到了保護,因此所有傷害都是眼睛暴露于加壓空氣沖擊的直接結果,且對側眼大部分不受影響。 但此方法需要專門的操作系統,且動物死亡率高,隨壓力變化死亡率達24%~46%不等[32]。 受試眼承受沖擊波損傷的同時會產生嚴重前后節損傷,視網膜組織破損嚴重,對視網膜組織檢測造成極大干擾。 該模型仍需進一步完善。 盡管如此,這也是一個重要的新模型,可用于觀察封閉式爆炸沖擊波所致TON 的短期和長期病程,研究爆炸損傷引起的病理改變及其分子機制,是檢測爆炸沖擊傷所致TON 的潛在治療方法的理想模型。

2.2 眼部撞擊模型

眼部撞擊模型所受損傷類型,以及之后的病理變化接近于臨床ITON,王一等[33]在兔模型中運用閉合和開放打擊法建立間接損傷視神經動物模型:(1)閉合打擊法:將兔頭置于工作臺圓孔窗下,選致傷眼眶上緣切跡內、后各0.5 cm 為打擊點,用聚乙烯板保護打擊點,打擊錘自由落體對準打擊點進行打擊造模;(2)開放打擊法:耳緣靜脈注射麻醉后,顯露兩側眶上緣切跡和眶壁,咬骨鉗向視神經管方向咬除部分眶壁骨板(深7~8 mm、寬6 mm),兔頭置于致傷管下,致傷卡頭卡在視神經孔上方眶板上,調整卡頭和兔頭角度使卡頭與致傷管成一線,致傷球從管上端自由下落擊于卡頭。 閉合打擊法組織損傷嚴重,對對側眼影響較大,且造模成功率低,不宜推廣。 開放性打擊去處部分眶壁后打擊力量更集中,所需致傷力度小,造模成功率較高。 張琳琳等[34]應用液壓沖擊顱腦損傷儀(fluid percussion brain injury device,FPI)產生的的沖擊力打擊Wistar 大鼠左、右眼眶內貼近眼球部的視神經,建立TON 模型。 造模后的閃光視覺誘發電位(flash visual evoked potential,F-VEP)、眼眶磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、視網膜病理等均表現出特征性變化,如F-VEP 主波潛伏期較損傷前延長、振幅降低,眼眶MRI 顯示損傷部位視神經信號增高,組織病理學觀測到視網膜神經元數量減少,視神經軸索萎縮變性、髓鞘腫脹等,與臨床視神經損傷改變相近。

目前出現了一種微創模型:受控軌道撞擊(controlled orbital impact, COI)模型[35]。 在眼內眥切開一個切口,并通過非侵入性眼球牽開器,將眼球從眼眶邊緣牽開,使眼外組織暴露。 用金屬撞擊器尖端對ON 后2~3 mm 的眼眶區眼外組織進行撞擊,創傷的強度可從輕度調整到重度。 COI 模型損傷參數(速度,挫傷深度和挫傷時間)可量化,創傷的強度可人為操控。 此模型能夠實現ERG 反應減弱的可重復電生理終點,小鼠體重以及相對應的撞擊速度是成功復制一致TON 結果的關鍵因素。 由于不涉及眼內手術,不會產生手術變異性和術中組織損傷的干擾。 沖擊直接作用于眼外部位的軟組織,不涉及眶上脊,因此骨折的可能性以及傳遞到對側眼的創傷影響很小,造模過程不會影響到對側視神經。 研究結果亦顯示對側眼與正常小鼠的眼睛沒有顯著差異,可較好地作為內部對照,減少小鼠間的個體差異[35]。 且與其他間接TON 模型(如眼沖擊傷模型)相比,很少發生與損傷相關的眼部合并癥(如白內障和角膜浮腫),死亡率低。 COI 模型具有侵入性小,操作簡單,控制精確,重復性好等優勢,并能引起不同嚴重程度的TON。 該模型的主要局限性是需要一個兼容軟件包的專用設備設置平臺,以便調整造模過程所需參數。

2.3 超聲誘導的TON 模型

最近出現的超聲誘導的 TON 模型[36](sonication-induced TON model,SI-TON),利用超聲波產生的振動波進行造模:小鼠麻醉后,在每只鼠的眶上嵴內側2 mm、距離中瞳孔垂直線2 mm 處放置一個帶有微尖探針(直徑3 mm)的實驗室超聲儀。 調整平臺,使微尖探針與眶上直接接觸,然后激活超聲儀,以35%或40%的振幅發出500 ms 的電擊進行造模(產生230~250 μm 的振動),對側眼用作對照。 由于眶上嵴是解剖上最易接觸到的刺激視神經管的部位,因此超聲脈沖能直接通過視神經的骨骼傳遞并被視神經吸收,聲能集中在視神經管的入口處,造成損傷。

SI-TON 模型在正確操作的情況下死亡率低,無眼部并發癥,并可對RGC 計數進行量化。 該模型模擬了臨床TON 損傷的機制,實現了RGC 缺失的最終結果,且在觸發軸突變性和RGC 死亡的同時保留完好的組織超微結構,為評估新的治療策略,促進RGC 存活和軸突再生提供了最寬松的環境。 損傷后炎癥事件的級聯序列特征也能幫助更好地理解TON 的病理生理變化。 SI-TON 模型易于實現,可重復。 同時,通過定向可調能量水平和顱骨傳遞,該模型可成為研究涉及單側或雙側視神經的不同程度損傷的理想模型。 但此模型所需設備昂貴。 超聲能量從原發損傷部位散射,可能對對側視神經造成損害,尤其在小鼠這樣的小型動物中,會影響對側眼作為完全對照的效果。 此外,操作步驟要求熟練,若定位不準確,超聲微尖端的錯位可導致不同程度的組織損傷,甚至眼球破裂。

3 模型評價方法

總結多種造模方法,目前TON 動物模型主要采用顱前正中矢狀線切口,經上瞼結膜入路,通過直接或間接損傷視神經眶內段進行造模。 次日觀察術眼,如出現眼底缺血、白內障等情況,造模失敗;若出現瞳孔散大、眼球無明顯突出、直接對光反射消失、間接對光反射存在,則可視為成功模型。 對于具體的檢測評價方法,根據需求和研究方向不同,各有選擇。 一般包含RGC 存活率檢測,功能學檢測,形態學檢測等。 常見的RGC 細胞存活率檢測方法,可選用熒光金標記法[7],或brn3a 免疫熒光檢測[35]。 由于RGC 組織學細胞計數與視網膜神經纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)和內叢狀層(inner plexiform layer,IPL)的厚度相關[37],頻域相干光斷層成像(spectral-domainoptical coherence tomography,SD-OCT)也可通過測量視網膜厚度從側面反應RGC 的丟失,RNFL 和IPL 結合層厚度的減少表明視網膜中RGC 的損失。 功能檢測主要包含ERG 檢測及F-VEP 檢測[32],其中ERG 種類較多,包含pattern ERG、flash ERG 和pSTR 等[35-36,38-40]。透射電鏡、SD-OCT、MRI 等可用于形態學檢測[34,36]。

4 討論

目前TON 動物模型大致可分為直接損傷和間接損傷模型,盡管臨床中最常見的損傷類型是ITON[41],當下研究普遍運用的還是ONT、ONC 及牽拉傷模型等直接損傷模型,間接損傷模型運用仍因設備缺乏、操作復雜等問題受到限制。 新的模型如SI-TON、COI 等,雖然有部分局限,但對于特定損傷類型的研究,仍提供了較大幫助。 TON 常用的動物模型包括大鼠、兔、貓等。 其中大鼠視網膜易于分離,取材后完整性較好,易鋪片,目前最為常用。 現將常見模型優勢及局限列于表1,以供參考。

表1 常見TON 動物模型Table 1 Common TON animal models

理想的TON 損傷動物模型應滿足以下條件:(1)盡可能的復制在人體所患TON 中發現的病理變化和結局;(2)可量化和可調節的外力,能造成精準可控的局灶性視神經病變,無眼部其他部位的損傷;(3)操作簡單且可復制;(4)有客觀參數可量化和展現RGCs 和軸突損傷的時間過程。 對于ITON,還應盡量模擬間接閉合性顱腦外傷的臨床特征,避免手術過程中直接接觸視神經而造成額外的視神經損傷。

針對具體的TON 病因和研究需求,采用不同的模型是有必要的。 對直接損傷模型中ONC、牽拉模型、慢性壓迫模型等的損傷程度和標準進行統一,對適合ITON 研究的新模型如COI、SI-TON 等模型做出進一步完善,以更好地開展TON 相關研究,是將來TON 動物模型研究的重要研究內容之一。