基孔肯雅病毒小鼠感染模型研究進(jìn)展

蔣小武，朱樂欣，艾莎珍

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)屬于披膜病毒科病毒，是一種主要經(jīng)伊蚊叮咬而傳播的蟲媒病毒[1]。該病毒顆粒直徑約65 nm，具有20面體衣殼，基因組大小約11.8 kb，含兩個主要的開放閱讀框，其中靠近5′端的ORF編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP1- nsP4)，靠近3′端的編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C，兩個包膜糖蛋白E1和E2)和2種小肽(E3和6K)[2-3]。CHIKV流行毒株分為亞洲(Asia)型、西非(WA)型、東中南非(ECSA)型和印度洋(IOL)型4個遺傳譜系[1,4]。CHIKV有城市(urban)和森林(sylvatic)兩種不同的循環(huán)模式進(jìn)行傳播擴散，其中城市感染模式由人類被蚊媒叮咬再傳染人類，而森林模式則從非人靈長類動物起始傳給蚊媒再傳給人類。Sylvatic模式傳播的CHIKV主要局限于于非洲森林的伊蚊和非人靈長類動物體內(nèi)，流行性和感染規(guī)模有限。大部分CHIKV感染暴發(fā)病例均為城市傳播模式，埃及伊蚊和白紋伊蚊作為重要的傳播媒介，極易在人群密集的地方引發(fā)基孔肯雅熱疫情[5-6]。不同流行毒株基因組變異，尤其是囊膜蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白某些位點的突變，會提高CHIKV對伊蚊的適應(yīng)性，增強病毒復(fù)制與傳播能力[2]。

人類感染基孔肯雅病毒可以發(fā)生基孔肯雅熱(Chikungunya fever，CHIKF)。CHIKF的典型癥狀是急性發(fā)熱與嚴(yán)重關(guān)節(jié)痛，具體表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、肌痛、頭痛和皮疹，關(guān)節(jié)疼痛位置一般對稱性的分布于手臂和腿部。該病致死率較低，急性感染患者7～10 d內(nèi)癥狀自行消退，但30%以上的患者會發(fā)展為慢性感染，出現(xiàn)持續(xù)性的關(guān)節(jié)腫脹和肌肉疼痛，疼痛和炎癥反應(yīng)可持續(xù)數(shù)月至10年之久，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[7-9]。自1952年首次在坦桑尼亞南部地區(qū)發(fā)現(xiàn)基孔肯雅病毒以來，CHIKF多次在非洲、美洲、拉丁美洲、歐洲、南亞以及東南亞國家暴發(fā)，特別是對蚊媒密度較高的熱帶與亞熱帶地區(qū)威脅較大[4-5, 10]。我國于1987年首次在云南西雙版納地區(qū)發(fā)現(xiàn)CHIKF輸入病人，2010年廣東東莞暴發(fā)過一次小范圍CHIKV本土感染(10例確診)，國內(nèi)多個入境口岸先后檢出CHIKV輸入性病例[11-13]。目前，全球已有100多個國家報道出現(xiàn)CHIKF散發(fā)或暴發(fā)，CHIKV被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為可能導(dǎo)致全球嚴(yán)重疫情暴發(fā)的8種潛在危險病原體及3種次危病原體之一[5,14]。

活體動物感染試驗對探究CHIKV如何在體內(nèi)復(fù)制、侵染與誘發(fā)機體病毒血癥，解析宿主抗病毒免疫反應(yīng)以及開發(fā)、評價疫苗或抗病毒藥物的療效等研究至關(guān)重要。迄今，已報道的關(guān)于CHIKV動物感染模型包括小鼠、非人靈長類動物、倉鼠以及斑馬魚[10,15-17]。非人靈長類動物模型(主要為獼猴)與人類的遺傳進(jìn)化關(guān)系較近，采用該模型感染CHIKV獲取的試驗數(shù)據(jù)更加貼近真實情況，但獼猴屬于大型動物，實驗材料不易獲取，價格昂貴，需要專門嚴(yán)格的飼養(yǎng)環(huán)境與管理措施，加之不能完全替代人體的微環(huán)境特征，因此應(yīng)用范圍窄，文獻(xiàn)報道不多。倉鼠與斑馬魚模型個體較小，尤其是斑馬魚作為模式生物，具有通體透明，發(fā)育周期短，遺傳背景清晰與實驗操作技術(shù)成熟等優(yōu)點，但是這兩種實驗動物在CHIKV感染試驗研究中的成果不多，結(jié)論尚不成熟，還有待進(jìn)一步論證。目前，小鼠是CHIKV感染研究應(yīng)用最多的動物模型，其主要優(yōu)勢在于實驗小鼠遺傳背景清晰，個體大小適宜，品系多樣，成本較低，易于管理，而且和市面上眾多的小鼠相關(guān)靶向基因或抗體檢測試劑匹配，特定基因修飾的轉(zhuǎn)基因小鼠也相對容易獲得。本文旨在詳細(xì)論述、匯總分析不同小鼠模型在CHIKV感染研究中的應(yīng)用及其優(yōu)缺點，以期增強對CHIKV感染機制的理解，并為其它蚊媒病毒動物模型的開發(fā)提供參考。

1 新生幼鼠模型

回顧性隊列分析發(fā)現(xiàn)：懷孕母體感染CHIKV引發(fā)病毒血癥，其分娩的新生兒CHIKV感染率高達(dá)50%，患兒易出現(xiàn)血流異常、心室功能不全、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷以及腦膜炎等神經(jīng)癥狀，死亡風(fēng)險較高[18-19]。因此，有學(xué)者采用新生幼鼠模擬人類感染CHIKV引發(fā)致死性腦炎相關(guān)表型與機制的研究。Couderc等以106PFU的CHIKV胸腹部皮下接種6 d齡與9 d齡C57BL/6新生幼鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼鼠對CHIKV易感，感染后3 d即可在幼鼠皮膚、肌肉、血液、肝臟、關(guān)節(jié)組織及腦內(nèi)檢出活病毒。6 d齡幼鼠感染CHIKV引發(fā)的病毒性腦炎癥狀最為嚴(yán)重，所有試驗組幼鼠在12 d內(nèi)死亡，死亡率達(dá)100%[20]。Ziegler等以新生ICR與CD-1幼鼠進(jìn)行CHIKV感染試驗，結(jié)果顯示感染CHIKV的幼鼠出現(xiàn)嗜睡、行走困難、體重增長減緩。新生幼鼠1周內(nèi)出現(xiàn)病毒血癥，腿部肌肉與腦內(nèi)也可檢出高滴度的CHIKV，其它癥狀包括骨骼肌局灶性壞死與炎癥反應(yīng)，但I(xiàn)CR與CD-1幼鼠感染CHIKV病死率明顯低于C57BL/6幼鼠模型[21]。進(jìn)一步采用新生幼鼠進(jìn)行CHIKV腦內(nèi)接種感染試驗，發(fā)現(xiàn)該病毒可感染誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡，誘導(dǎo)CD206+等樹突狀先天免疫細(xì)胞募集、活化，引發(fā)炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致幼鼠形成腦炎損傷[22]。Zhang等構(gòu)建了熒光蛋白標(biāo)記的重組CHIKV病毒，并成功以BALB/c新生幼鼠模型進(jìn)行了顱內(nèi)接種試驗，結(jié)果顯示重組病毒能在腦內(nèi)復(fù)制并有效侵染幼鼠全身臟器[23]。另外，新生幼鼠作為體內(nèi)動物試驗?zāi)Ｐ驮诳笴HIKV中和抗體與治療藥物有效性檢測方面也有應(yīng)用。Saraswat等以抗CHIKV高免血清被動免疫新生BALB/c幼鼠，發(fā)現(xiàn)幼鼠可以完全抵抗CHIKV的感染[24]。Lam等以新生幼鼠模型驗證了中和CHIKV-E2糖蛋白N218表位的單克隆抗體和拮抗病毒翻譯起始作用的磷酸二氨基酯嗎啉代寡聚物的抗病毒作用[25-26]。上述試驗說明新生幼鼠對CHIKV易感，是CHIKV相對理想的感染、病理與抗病毒藥物功效評估模型，但因其免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，感染CHIKV易引發(fā)致死性腦膜炎并迅速死亡等特征，極大地限制了其在CHIKV誘發(fā)更大范圍的輕、中癥與急、慢性肌肉關(guān)節(jié)炎等疾病表型的致病機理、宿主抗炎與激活機體免疫反應(yīng)機制等方面的應(yīng)用。

2 成年野生實驗小鼠模型

人感染CHIKV的主要癥狀表現(xiàn)為急、慢性肌肉腫脹、疼痛與關(guān)節(jié)炎，患者中出現(xiàn)持久性的病毒檢出與炎癥因子釋放的比例越來越高，但關(guān)于CHIKV如何引發(fā)肌肉疼痛與關(guān)節(jié)炎癥的機理仍不清楚[27]。有學(xué)者模仿蚊蟲叮咬模式，采用足墊皮下方式將CHIKV接種至野生型成年C57BL/6小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)CHIKV感染小鼠足部致腳踝腫脹，并伴有關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、肌痛和骨膜炎等典型臨床癥狀。CHIKV在小鼠足部關(guān)節(jié)內(nèi)大量復(fù)制，并引發(fā)持續(xù)性病毒血癥[28-30]。這與人感染CHIKV的常見疾病表型基本吻合，暗示成年野生型實驗小鼠可能適合作為動物模型用于模擬、探索人感染CHIKV典型表型與潛在機制。比較分析不同野生型實驗小鼠(C57BL/6、ICR、CD-1、WT 129和DBA / 1J)對CHIKV感染的敏感性，發(fā)現(xiàn)CHIKV侵染、繁殖能力以及誘導(dǎo)肌肉骨骼損傷的嚴(yán)重程度與不同品系小鼠的遺傳學(xué)差異有一定關(guān)聯(lián)，以C57BL/6小鼠最易感[31-33]。轉(zhuǎn)錄組芯片分析發(fā)現(xiàn)CHIKV感染C57BL/6小鼠引發(fā)關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)組織差異基因表達(dá)譜或相關(guān)免疫分子活化特征與膠原蛋白刺激小鼠引發(fā)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織相應(yīng)分子變化水平基本一致[34]。CHIKV誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)組織NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞活化、浸潤[30,35]。Goupil等以CHIKV感染8周齡野生C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)CHIKV可刺激小鼠骨骼與關(guān)節(jié)相關(guān)組織破骨細(xì)胞活化，這對揭示CHIKV患者感染早期出現(xiàn)骨小梁和皮質(zhì)骨丟失的機制具有重要意義[6,28,36]。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，65歲以上的老年人對CHIKV高度易感，感染后疾病表癥更為嚴(yán)重，所有CHIKV相關(guān)死亡病例中老齡患者占比90%以上[37]。Uhrlaub等將CHIKV分別接種至12周齡與18月齡成年野生C57BL/6小鼠足墊皮下，發(fā)現(xiàn)18月齡組老年鼠關(guān)節(jié)腫脹癥狀表現(xiàn)更嚴(yán)重、持久，組織中病毒載量更高，病毒血癥持續(xù)時間更長。CHIKV感染誘發(fā)過度炎癥因子釋放，可能直接導(dǎo)致老齡組小鼠適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能損傷，機體分泌中和抗體與清除病毒能力顯著降低[38]。有研究發(fā)現(xiàn)CHIKV感染C57BL/6小鼠，其血液、肝臟及脾臟等均可作為靶器官被CHIKV侵染，這些臟器中的病毒粒子4周內(nèi)即可被機體清除，但小鼠關(guān)節(jié)相關(guān)組織病毒RNA或感染性活病毒可至少持續(xù)檢出16周[39-40]。這些長期低水平存在的CHIKV可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤、炎癥相關(guān)因子持續(xù)表達(dá)，從而引發(fā)慢性滑膜炎和關(guān)節(jié)炎。另外，CHIKV的長期感染可能誘導(dǎo)病毒適應(yīng)性變異，基因組關(guān)鍵位點的多重突變對削弱病毒抗體中和活性、增強病毒體內(nèi)存活力具有重要作用[40-41]。野生型成年實驗小鼠先天免疫與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)育完善，因此在抗病毒藥物與疫苗開發(fā)研究方面應(yīng)用更為廣泛。Kuo等以C57BL/6實驗小鼠模型證實廣譜抗錐蟲藥物蘇拉明可明顯降低CHIKV感染后的病毒載量，下調(diào)軟骨細(xì)胞數(shù)量，顯著改善小鼠急性骨關(guān)節(jié)炎癥狀[42]。C57BL/6小鼠在CHIKV減毒苗(通過衣殼蛋白核定位序列與非結(jié)構(gòu)蛋白特定功能氨基酸突變、衣殼蛋白缺失、同義密碼子替換等技術(shù)使病毒致弱)與CHIKV病毒樣顆粒疫苗，BALB/c小鼠在CHIKV滅活苗、重組黑猩猩腺病毒載體疫苗(ChAdOx1與ChAdOx2)、E2蛋白重組亞單位疫苗以及DNA疫苗(pCHIKV-7)等疫苗研發(fā)過程中用于評估不同候選疫苗的免疫原性與保護(hù)效力[43]。

3 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

I型干擾素及干擾素刺激信號傳導(dǎo)途徑在機體抵抗CHIKF相關(guān)嚴(yán)重并發(fā)癥中扮演重要作用，敲除小鼠I型干擾素關(guān)鍵受體(IFNAR)、其他關(guān)鍵成分(如IRF3/IRF7)或干擾素誘導(dǎo)基因(如ISG-15)可顯著提高小鼠易感性[1,44]。Couderc等以野生C57BL/6(WT)、IFN-α/β R+/-與IFN-α/β R-/-基因敲除小鼠分別感染CHIKV，發(fā)現(xiàn)WT小鼠可以完全抵抗病毒侵染，而IFN-α/β R+/-與IFN-α/β R-/-小鼠分別誘導(dǎo)輕度與重癥感染。IFN-α/β R-/-試驗組小鼠出現(xiàn)嗜睡、肌無力、病毒血癥及神經(jīng)癥狀，小鼠3 d內(nèi)全部死亡，小鼠肝臟、脾臟、肌肉、關(guān)節(jié)、皮膚以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)可檢出高滴度的CHIKV。組織病理觀察發(fā)現(xiàn)CHIKV主要靶向肌肉、皮膚和關(guān)節(jié)中的成纖維細(xì)胞，對腦脈絡(luò)叢與軟腦膜細(xì)胞等組織嗜性也較高，組織中病毒載量高低與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[20]。Cook等進(jìn)一步解析了不同I型干擾素亞群拮抗CHIKV感染過程的差異與機制，其中IFN-α主要作用在于阻礙CHIKV的復(fù)制和傳播，而IFN-β則通過拮抗中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)緩解CHIKV的致病效應(yīng)[45]。A129(I型干擾素受體缺陷)、AG129(I型與II型干擾素受體缺陷)以及STAT(干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因子缺陷)轉(zhuǎn)基因小鼠模型均對CHIKV易感，試驗結(jié)果與Couderc等報道的類似[46]。Tun等應(yīng)用A129小鼠模型比較分析了不同譜系CHIKV毒株的致病差異，結(jié)果顯示ECSA譜系毒株毒力更強，小鼠腦內(nèi)與不同臟器中病毒復(fù)制水平最高[47-48]。I型干擾素調(diào)控子IRF3與IRF7雙基因敲除小鼠(IRF3/7-/-)感染CHIKV，會出現(xiàn)出血、血管炎癥和血小板減少等典型失血性休克癥狀，該模型對CHIKV導(dǎo)致出血熱相關(guān)休克綜合征機理研究具有重要意義[49]。Werneke等發(fā)現(xiàn)干擾素早期誘導(dǎo)因子ISG15對新生幼鼠抵抗CHIKV致死性感染發(fā)揮重要作用，ISG15基因敲除小鼠對CHIKV易感性顯著增強，炎癥因子劇烈釋放，而且ISG15的抗感染作用不依賴于泛素樣結(jié)構(gòu)域UbE1L[15,37]。Delang等采用AG129轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)抗流感藥物法匹拉韋(T-705)可以抑制CHIKV復(fù)制酶活性，降低小鼠體內(nèi)病毒載量，減輕小鼠致死性病毒性腦炎癥狀，提高小鼠存活率[50]。另外，I型干擾素免疫缺陷小鼠模型在研究抗CHIKV單克隆抗體中和效應(yīng)，評估昆蟲特異性甲病毒嵌合CHIKV結(jié)構(gòu)蛋白疫苗(EILV/CHIKV)、VSV病毒載體重組CHIKV囊膜糖蛋白疫苗(VSVΔG-CHIKV)和高效單克隆抗體編碼序列對應(yīng)mRNA疫苗(CHKV-24)的免疫原性與保護(hù)效力等方面均有應(yīng)用[43,51]。

為分析宿主先天免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答在CHIKV感染中的作用，有學(xué)者陸續(xù)構(gòu)建了包括RNA病毒識別受體TLR3、T和B淋巴細(xì)胞重組酶激活基因1(RAG1與RAG2)以及B淋巴與T淋巴細(xì)胞本身在內(nèi)的多種基因修飾小鼠模型用于探究機體抗CHIKV感染的機制。Her等發(fā)現(xiàn)TLR3介導(dǎo)調(diào)控CHIKV中和抗體分泌，Tlr3-/-小鼠對CHIKV更為敏感，缺陷小鼠體內(nèi)病毒載量更高，炎性細(xì)胞浸潤更加嚴(yán)重[52]。CHIKV分別感染野生型、CD4-/-、CD8-/-和B淋巴細(xì)胞(μMT)轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)μMT小鼠易感性最強，CHIKV感染引發(fā)的病毒血癥持續(xù)存在，CD4-/-和μMT小鼠臨床表征最為嚴(yán)重，暗示CD4+，而非CD8+T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)抗CHIKV保護(hù)性抗體作用的持續(xù)時間，并影響關(guān)節(jié)腫脹與關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生發(fā)展過程[29,53]。T淋巴或B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)基因小鼠(靶向RAG1或RAG2基因)對CHIKV易感，較野生型小鼠感染CHIKV的疾病表型與病毒血癥更為嚴(yán)重，機體適應(yīng)性免疫可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以抵抗CHIKV的感染[29,39,54]。CHIKV刺激APCs細(xì)胞分泌IFNγ，活化TH1型CD4+T細(xì)胞極化，募集炎性單核細(xì)胞至感染區(qū)域。Carissimo等發(fā)現(xiàn)ISG蛋白家族的Viperin因子抗CHIKV感染與其調(diào)控CD4+T細(xì)胞的極化作用有關(guān)，Viperin-/-缺失小鼠感染CHIKV誘發(fā)關(guān)節(jié)炎病理表現(xiàn)更為嚴(yán)重[55]。CHIKV感染會刺激機體γδT亞群淋巴細(xì)胞的高水平增殖，γδT細(xì)胞缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠感染CHIKV后體重增長減緩，關(guān)節(jié)腫脹與炎癥反應(yīng)特征明顯增強[56]。上述試驗說明特定免疫應(yīng)答相關(guān)靶基因缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠對CHIKV易感性的改變，對深入挖掘、驗證重要的宿主抗病毒效應(yīng)因子、評估藥物或疫苗的免疫保護(hù)效力等方面具有重要意義，但相應(yīng)小鼠感染CHIKV出現(xiàn)的發(fā)病急、死亡快、病理周期短等現(xiàn)象，限制了轉(zhuǎn)基因小鼠模型在CHIKV引發(fā)持續(xù)關(guān)節(jié)炎型感染表型機制研究的應(yīng)用。

4 小 結(jié)

目前，基孔肯雅病毒已擴散至全球五大洲，累計引起數(shù)百萬人感染。CHIKF的蔓延與傳播加快了科學(xué)家們對CHIKV的研究步伐，尤其是在CHIKV誘發(fā)急性和慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病的感染機制、疫苗與靶標(biāo)藥物開發(fā)等方面取得了較大進(jìn)展[43,57]。合適的動物感染模型對于開展CHIKV基礎(chǔ)與應(yīng)用研究必不可少。

小鼠感染模型是CHIKV研究最深、應(yīng)用范圍最廣的動物模型，近年來，基孔肯雅病毒小鼠模型對加快CHIKV的基礎(chǔ)與應(yīng)用性研究起到了關(guān)鍵性作用。不同類別或品系的小鼠感染CHIKV臨床表型各有特征，適用范圍略有差異，C57BL/6實驗小鼠對CHIKV較為易感，遺傳特性相對穩(wěn)定，在病毒感染與免疫保護(hù)等應(yīng)用最為廣泛。新生幼鼠與轉(zhuǎn)基因小鼠適用于研究CHIKV感染引發(fā)人腦炎等致死性病變的致病機制，探究CHIKV感染相關(guān)宿主關(guān)鍵互作因子、介導(dǎo)宿主抗病毒免疫相關(guān)組分的鑒定與驗證、評估特定中和抗體或藥物的抗病毒效果以及重組載體活疫苗與mRNA疫苗免疫保護(hù)作用，而野生型成年實驗小鼠主要用于模擬CHIKV引發(fā)急性肌肉損傷與骨關(guān)節(jié)疾病、慢性持續(xù)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病以及評估不同類型的疫苗或藥物保護(hù)效果。

盡管小鼠模型在CHIKV應(yīng)用最多，優(yōu)勢明顯，但其仍然存在缺陷。不同品種與年齡組的小鼠CHIKV感染結(jié)局差異較大，小鼠模型不能準(zhǔn)確模擬CHIKV母嬰垂直傳播方式。另外，小鼠與人類的遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，與人體肌理結(jié)構(gòu)及微環(huán)境存在較大差異，病毒黏附鼠源細(xì)胞與胞內(nèi)復(fù)制能力明顯低于人源細(xì)胞[15,58]。小鼠壽命有限，CHIKV感染的小鼠組織易被損傷破壞[10]，也不能完整模擬人感染CHIKV引發(fā)慢性持續(xù)性疾病的終生過程。迄今為止，國內(nèi)外尚無理想的動物模型能夠完全模擬人感染CHIKV表現(xiàn)出的所有急、慢性臨床表型，繼續(xù)探索不同動物模型間的感染差異機制，開發(fā)、優(yōu)化新的動物感染模型，仍是CHIKV研究取得突破進(jìn)展的重點和難點之一。