2014-2017年山西省沙門氏菌分子分型及耐藥性研究

姚素霞，郝瑞娥，王 洋，張秋香，楊紅霞，韓吉婷，秦文彥

沙門氏菌是一種常見的人獸共患病原菌。該菌主要通過污染的食物感染人類，引起嘔吐、腹瀉等癥狀[1]。沙門氏菌是全球報道最多、各國公認的食源性疾病所致感染性腹瀉的首要致病菌[2]。目前，抗生素在臨床及畜牧業(yè)中的濫用，出現了大量的沙門氏菌的耐藥菌株。但是不同血清型的沙門氏菌耐藥性會顯著不同，為了解山西省沙門氏菌血清分布與耐藥圖譜，分析耐藥菌株之間的同源性，研究沙門氏菌的耐藥機制，本文對山西省食源性疾病監(jiān)測來源的137株沙門氏菌進行了耐藥性檢測，并對耐喹諾酮類藥物的沙門氏菌進行了耐藥基因與分子分型研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014-2017年山西省食源性病例哨點醫(yī)院分離自患者糞便標本的沙門氏菌共137株。其中，2014年23株，2015年16株，2016年35株，2017年63株。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 沙門氏菌顯色培養(yǎng)基由法國CHROMAgar公司生產，腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管由北京陸橋技術股份有限公司生產，沙門氏菌診斷血清、Swarm Agar誘導軟瓊脂由丹麥SSI公司生產，革蘭陰性藥敏檢測板由美國Thermo公司生產，Taq DNA 聚合酶由寶生物工程 (大連)有限公司生產，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。Seakem Glod瓊脂糖由美國LONZA公司生產，蛋白酶K由瑞士Roche公司生產，限制性內切酶XbaⅠ由美國New England Biolabs公司生產，GelRed染料由美國Biotium公司生產。所用試劑均在有效期內使用。

1.2.2 儀器 藥敏連續(xù)加樣儀由美國Thermo生產，PCR 儀由AB公司生產, PFGE系統(tǒng)與凝膠成像系統(tǒng)由美國Bio-Rad公司生產。

1.3 細菌血清型鑒定 137株沙門氏菌根據《食源性疾病監(jiān)測工作手冊》要求進行生化鑒定，依據 《WHITE-kauffmann-Le Minor 抗原表》分型來確定血清型。

1.4 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法對分離到的137株沙門氏菌進行MIC值測定，藥物有萘啶酸、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、頭孢噻肟、慶大霉素、頭孢西丁等8種抗生素。結果根據美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI2017) 標準進行判斷。

1.5 耐藥基因的測定 耐藥基因序列：gyrAF:5′-ACGTACTAGGCAATGACTGG-3′,gyrAR:5′-AGAAGTCGCCGTCGATAGAA-3′;parCF: 5′-CTATGCGATGTCAGAGCTGG-3′，parCR:5′-TAACAGCAGCTCGGCGTATT-3′。采用煮沸法制備DNA模板，PCR反應體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L的dNTP Mix 2 μL， 耐藥基因上、下游引物 (10 mmol/L) 各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq 酶0.5 μL，去離子水16 μL。 PCR反應條件：98 ℃變性10 s，55 ℃(gyrA基因為15 s，parC為5 s)，72 ℃延伸 60 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴增陽性的PCR 產物經回收純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司進行序列雙向測定。所測序列應用 BLAST 軟件將測序結果與 GenBank 數據庫中的標準菌株Salmonella Typhimurium LT2進行同源性分析比對，確定突變點和氨基酸突變類型。

1.6 PFGE分子分型 根據國家食源性疾病分子溯源網絡(TraNet)中沙門氏菌脈沖場凝膠電泳(PFGE)標準分型方法進行規(guī)范操作。PFGE圖像應用Bio Numerics 6.6軟件進行分析。

1.7 質量控制 藥敏試驗的質控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922。PFGE分子分型的質量標記選用參考菌株沙門氏菌H9812。

1.8 統(tǒng)計學方法 數據采用SPSS 15.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 菌株情況 137株沙門氏菌79株分離自男性，58株分離自女性，男女比例為1.36∶1；各個年齡段均可感染，中青年組(18～60歲)發(fā)病率最高，共分離菌株67株(48.91%)，其次為嬰幼兒組(0～5歲)，分離菌株37株(27.01%)。137株菌分離自山西省6個市，大同市56株(40.88%)，太原市23株(16.79%)，長治市22株(16.06%)，陽泉市17株(12.41%)，晉中市15株(10.95%)，臨汾市4株(2.92%)。全年均可檢出，高峰期為5～10月，共檢出111株沙門氏菌，占總檢出數的81.02%。137株沙門氏菌經診斷血清凝集后共分為16個血清型，主要為腸炎沙門氏菌51株，鼠傷寒沙門氏菌47株，其他沙門氏菌39株(表1)。

表1 137株沙門氏菌血清分布Tab.1 Serotype distribution of 137 Samonella isolates from patients

2.2 藥敏結果 本文選取了8種抗生素的藥敏試驗，發(fā)現137株沙門氏菌對萘啶酸的耐藥率最高，為56.93%；其次為四環(huán)素，耐藥率為34.31%；對頭孢噻肟、慶大霉素及頭孢西丁的耐藥率較低，分別為8.03%、5.84%及0.73%(表2)。比較不同血清型的沙門氏菌對這8種抗生素的耐藥性，發(fā)現腸炎沙門氏菌對萘啶酸的耐藥率明顯高于鼠傷寒沙門氏菌，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.401，P<0.05)；鼠傷寒沙門氏菌對環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素的耐藥率高于腸炎沙門氏菌，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為34.489，10.319,19.218，均P<0.05)(表3)；腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌對四環(huán)素的耐藥率差別無統(tǒng)計學意義(χ2= 1.528，P>0.05)，對頭孢噻肟、慶大霉素、頭孢西丁耐藥率都很低。

表2 137株沙門氏菌對8種抗生素的耐藥情況Tab.2 Drug resistance of 137 isolated Samonella strains to eight antibiotics

表3 腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌抗生素藥敏試驗Tab.3 Susceptibility testing of S. enteritidis and S. typhimurium

2.3 喹諾酮耐藥基因的測定 從藥敏結果中可以看出，沙門氏菌對萘啶酸的耐藥率最高，因此我們篩選出對萘啶酸耐藥的78株沙門氏菌，進行gyrA基因和parC基因點突變的測定，發(fā)現對萘啶酸耐藥的沙門氏菌gyrA基因與parC基因檢出點突變129個。gyrA基因中最常見突變?yōu)榈?7位氨基酸突變?yōu)锳sp87Tyr(48.72%)，其次為Asp87Asn(14.10%)、Ser83Leu(7.70%)和Ser83Phe(5.13%)。parC基因中只檢出1個突變點，為 Ser80Arg(89.74%)。

2.4 PFGE分型 篩選出對萘啶酸耐藥的51株腸炎沙門氏菌與21株鼠傷寒沙門氏菌，分別進行PFGE分析。51株腸炎沙門氏菌的相似度在70.6%～100%，共得到21種PFGE圖譜，各帶型包含的菌株數不等，E14包含有10株菌，E17包含9株菌，E19包含7株菌等(圖1)。21株鼠傷寒沙門氏菌的相似度在58.9%～100%，共得到15種PFGE圖譜，各帶型包含的菌株數不等，同一帶型菌株數最多的為5株(圖2)。

圖1 萘啶酸耐藥的腸炎沙門氏菌聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of S. enteritidis resistance to nalidixic acid

圖2 萘啶酸耐藥的鼠傷寒沙門氏菌聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of S. typhimurium resistance to nalidixic acid

3 討 論

沙門氏菌血清型眾多,目前我國發(fā)現的血清型達322個[2]。本次研究中,腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門氏菌是山西省人源沙門氏菌感染的優(yōu)勢血清型,分別占 37.23% 與34.31% 。這與我國北京市、河南省等地的報道相似[3-6]，但與廣東、武漢等地的報道有所差別[7-8]，說明沙門氏菌感染型別分布可能存在地域差別。

抗生素的廣泛使用致大量細菌產生了耐藥性，沙門氏菌的耐藥情況也非常嚴重。本研究發(fā)現，山西省分離到的沙門菌對一代喹諾酮類藥物耐藥率最高，達到56.93%，這與文獻報道一致[9]，可能與萘啶酸也在上世紀被廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)有關。四環(huán)素的耐藥現象也較為嚴重，這可能與四環(huán)素類藥物在不同抗生素之間的交叉耐藥明顯[10]，以及多西環(huán)素和米諾環(huán)素在臨床的廣泛應用有關，也可能與四環(huán)素在養(yǎng)豬業(yè)的廣泛使用，耐藥菌株通過豬肉傳播給人類有關[11]。環(huán)丙沙星作為治療沙門氏菌感染的一線藥物，耐藥率為 14.60%，但它的中敏率達到了33.58%，這可能與臨床中濫用和不規(guī)則治療關系密切[12]。作者又分別比較腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌對8種抗菌藥物的耐藥率，發(fā)現腸炎沙門菌對萘啶酸的耐藥率比鼠傷寒沙門菌高,差異有統(tǒng)計學意義，但鼠傷寒沙門氏菌對環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、慶大霉素的耐藥率均高于腸炎沙門氏菌，差異有統(tǒng)計學意義，這可能與不同型別的沙門氏菌耐藥機制不同有關。沙門氏菌耐藥現象嚴重,今后需加強臨床用藥的科學性和嚴謹性,減少耐藥菌的發(fā)生，防止耐藥菌株的流行。

喹諾酮類藥物通過抑制DNA拓撲異構酶而阻止DNA拓撲異構酶變化，妨礙細菌DNA復制、轉錄及其調控從而達到抑菌和殺菌的目的[13]。在本研究中，對萘啶酸耐藥的沙門氏菌gyrA基因與parC基因檢出突變點129個。gyrA基因中最常見突變?yōu)榈?7位氨基酸突變?yōu)锳sp87Tyr(48.72%)；parC基因中只檢出1個突變點，為Ser80Arg(89.74%)。這些突變可能就是導致耐藥產生的主要原因[14-15]，但同時我們發(fā)現并不是所有耐喹諾酮的沙門氏菌都有基因突變的發(fā)生，沙門氏菌對萘啶酸的耐藥是一個復雜的機制，更多的機制還有待進一步深入的研究。

PFGE具有分辨能力高，重復性好等優(yōu)點，是目前細菌分子分型的金標準，它是采用稀有限制性內切酶對細菌進行酶切，通過比對各個酶切條帶之間的差別，從整個基因組上來反映菌株之間的關系[16]。本研究采用XbaⅠ酶切,共得到21種PFGE圖譜，各帶型包含的菌株數不等，51株腸炎沙門氏菌的相似度在70.6%～100%。除2014年的E1、E2、E3型別外，其余型別的相似度達81.6%，說明這些沙門氏菌緊密相關，特別是包含菌株較多的帶型如E14、E17、E19、E11之間的相似度達90%以上，說明我省腸炎沙門氏菌可能存在相對集中的親緣關系。21株鼠傷寒沙門氏菌PFGE分為15個型別，相似度在58.9%～100%，除2017年長治市發(fā)生的一次聚集性事件外，鼠傷寒沙門氏菌其它型別之間差異明顯,表現出較大的遺傳多樣性,說明鼠傷寒沙門氏菌具有廣泛的來源。