內蒙古大興安嶺林區牙克石段的蜱種及蜱攜病原體感染調查

劉 丹，烏蘭圖雅，殷旭紅，崔云虹，王亭富，阿木日汗，曹民治，王國棟，閆大成,李純浦,高娃

蜱媒傳染病是由蜱作為傳播媒介而引發的一類自然疫源性疾病。蜱是一種吸血寄生蟲，它不但可以游離存活在自然界內，還可以寄生于牛、羊、馬、駱駝、鼠等動物體內或體表。蜱可感染、傳播的病原體種類多、范圍廣，而且一種蜱可同時攜帶2種或2種以上的病原體[1]。許多病原體能經卵、經期傳遞，使蜱成為貯存宿主和傳播媒介。近年來，蜱媒傳染病暴發在世界各地頻發，嚴重影響到畜牧業的發展，給居民的健康帶來極大的挑戰，越來越受到國內外學者的廣泛關注[2-4]。

內蒙古東部大興安嶺林區位于中國東北部，與俄羅斯相鄰，擁有我國最大的天然草原區，作為我國重要的林牧業基地之一，植被覆蓋率較高。得天獨厚的自然環境，使得野生動物資源豐富，加之大量家畜牧養，促進了蜱的生長、繁殖。既往研究曾從內蒙古東部草原的蜱樣本中檢出多種病原體[5-6]。牙克石段作為大興安嶺林區的重要組成部分，人的蜱傳萊姆病和森林腦炎發病率較高，近年又在該地發現另一種蜱傳疾病——埃立克體病，其在牙克石地區發病率為14.77%[7]。本研究在大興安嶺林區牙克石段采集蜱樣本，分析大興安嶺林區牙克石段的蜱種、蜱攜帶病原體種類及復合感染，為該地區預防和控制蜱傳病原體感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域 大興安嶺林區牙克石段即牙克石市，它是呼倫貝爾市下轄13個縣級市之一，位于內蒙古東北部(北緯47°39′～50°21′，東經120°28′～122°29′)、大興安嶺中脊中段西坡。市域沿大興安嶺主脈南北分布，平均海拔600余米，屬大陸性寒溫帶氣候特征，年平均氣溫-1 ℃～-5 ℃。野生動物資源豐富，因而使其成為蜱類棲息的良好孳生地。

1.2 標本采集與分類 2016-2019年，在東部林區蜱活躍高峰期(5-6月)采用布旗法采集游離蜱標本，記錄采集時間、地點、方法、寄主等信息。

1.3 蜱蟲的解剖和DNA提取 采集到的蜱蟲標本使用次磷酸鈉和75%的乙醇加碘伏，浸泡5 min，消毒后用無菌水清洗自然干燥。利用體視顯微鏡逐一進行解剖，摘出唾液腺保存于PBS溶液，并使用QIAamp DNA Mini Kit進行DNA提取，按照說明書操作，提取出來的DNA保存于-20 ℃。

1.4 蜱種的分類與鑒定 將采集到的標本使用體視顯微鏡進行形態學初分類。然后對蜱DNA樣本進行PCR擴增，再對擴得的DNA片段測序，最后通過在線BLAST將測得DNA序列與GenBank基因序列比對來確定蜱的種類。

1.5 特異性基因分析 采用靈敏度和特異度較高的靶基因檢測蜱中可能存在的多種病原體。斑點熱立克次體的檢測先采用gltA基因進行初篩，將gltA初篩陽性樣品分類，再選擇代表性樣品擴增合rOmpA基因進行確認。埃立克體屬以omp1、無形體屬以msp2、萊姆病螺旋體以flaB、新型回歸熱螺旋體以glpQ作為靶基因進行PCR擴增。PCR反應體系均使用Blend Tag-Plus，按照說明書操作。PCR擴增中使用的各種特異性引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成，見表1。

表1 特異性PCR引物設計Tab.1 Specific PCR primer design

1.6 統計學分析 采用Excel建立數據庫，SPSS 19.0進行數據分析。計數資料采用例數(百分比)來描述，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同地區常見蜱種及所處生態景觀分布 大興安嶺林區牙克石段共采集蜱蟲2 786只，雄蜱1 413只(50.7%)，雌蜱1 373只(49.3%)；幼蜱83只(3.0%)，若蜱125只(4.5%)，成蜱2 578只(92.5%)。通過體視顯微鏡觀察和基因分析，隸屬于1科3屬4種，分別為全溝硬蜱2 191只(78.6%)、嗜群血蜱442只(15.9%)、日本血蜱133只(4.8%)、森林革蜱20只(0.7%)，全溝硬蜱、嗜群血蜱為本地區的優勢蜱種。其中，全溝硬蜱分布于所有地區，嗜群血蜱和日本血蜱的分布也較廣泛，森林革蜱僅在3個地區分布。在所調查的區域內，常見生境均以原始的棕色針葉森林為主，僅烏奴耳鎮(70.6%，211/299)和綽河源鎮(51.1%，95/186)以嗜群血蜱居多之外，其他地區均以全溝硬蜱居多，見表2。

表2 牙克石市不同地理區劃中常見蜱種所處生態景觀分布Tab.2 Ecological landscape distribution of common tick species in geographic divisions of Yakeshi City

2.2 不同地區蜱攜帶病原體種類 在大興安嶺林區牙克石段的7個采樣地區的蜱中，斑點熱立克次體檢出率較高的為烏奴耳鎮和綽河源鎮，分別為74.2%(222/299)和48.4%(90/186)；無形體屬檢出率較高的有博克圖鎮(18.9%，39/206)、免渡河鎮(14.6%，183/1 256)、烏奴耳鎮(13.0%，39/299)和烏爾其漢鎮(10.8%，72/669)；埃立克體屬檢出率較高的為庫都爾鎮和免渡河鎮，分別為26.1%(12/46)和13.1%(164/1 256)；萊姆病螺旋體總檢出率為42.9%(1 195/2 786)，其中庫都爾鎮(76.1%，35/46)、博克圖鎮(54.9%，113/206)、烏奴耳鎮(49.8%，149/299)和免渡河鎮(44.7%，561/1 256)的檢出率均超過平均水平；新型回歸熱螺旋體的檢出率較高的為庫都爾鎮和烏奴耳鎮，分別為13.0%(6/46)和10.0%(30/299)，見表3。

表3 不同地區蜱攜帶病原體情況Tab.3 Pathogens carried by ticks in different regions

2.3 不同特征蜱攜帶病原體情況 在檢出的4種蜱中，斑點熱立克次體檢出率最高的蜱種為嗜群血蜱(66.5%，294/442)，檢出率最低的為全溝硬蜱(2.8%，61/2 191)(χ2=993.756，P<0.001)；無形體屬檢出率較高的為全溝硬蜱(13.5%，296/2 191)和嗜群血蜱(10.4%，46/442)，森林革蜱未檢出無形體(χ2=27.679，P<0.001)；埃立克體屬檢出率最高的為全溝硬蜱(11.2%，245/2 191)，森林革蜱未檢出埃立克體(χ2=17.586，P<0.001)；萊姆病螺旋體檢出率較高的為全溝硬蜱(44.6%，977/2 191)和嗜群血蜱(42.3%，187/442)(χ2=34.895，P<0.001)；新型回歸熱螺旋體檢出率較高的是森林革蜱，為(10.0%，2/20)，日本血蜱未檢出該病原體(χ2=21.814，P<0.001)，見表4。

成蜱的無形體屬檢出率(13.2%)高于若蜱(3.2%)(χ2=23.149,P<0.001)；成蜱的萊姆病螺旋體檢出率(44.3%)高于幼蜱(7.2%)(χ2=46.606，P<0.001)，成蜱、若蜱、幼蜱的新型回歸熱螺旋體檢出率分別為5.1%、4.8%、1.2%，差異無統計學意義(χ2=2.61，P=0.271)。見表4。

表4 不同特征蜱攜帶病原體情況Tab.4 Pathogens carried by ticks with different characteristics

2.4 不同地區蜱攜病原體的復合感染 大興安嶺林區牙克石段蜱的復合感染率為19.5%(544/2 786)。雙重復合感染率為16.4%(458/2 786)，其中斑點熱立克次體和萊姆病螺旋體復合感染率最高，為7.1%(197/2 786)。蜱的雙重復合感染率最高的地區是免渡河鎮，為40.6%(186/458)；伊圖里河鎮最低，為1.3%(6/458)。蜱的多重復合率為3.1%(86/2 786)。烏奴耳鎮是3種病原體復合感染率最高的地區，為47.4%(36/76)。僅烏奴耳鎮(90%，9/10)和綽河源鎮(10%，1/10)的蜱存在4種病原體的復合感染，見圖1。

圖1 不同地區復合感染率構成Fig.1 Composition of multiple infections in different regions

3 討 論

大興安嶺林區牙克石段地處內蒙古東部大興安嶺林區中心區域，有豐富的蜱資源，且蜱叮咬事件和蜱媒萊姆病或森林腦炎在該地區發生較多。但是，由于缺乏認識，使得一些被蜱叮咬的發熱病例得不到進一步實驗室確認，誤診及漏診十分普遍，因此研究該地區蜱攜病原體感染狀況十分必要。

全溝硬蜱在內蒙古東部林區的分布最為廣泛，生境主要是棕色針葉森林，為該地區主要的優勢蜱種，與秦文浩等[7]的研究結果相似。全溝硬蜱在北方針闊混交林帶大量分布，在我國的新疆、內蒙古以及東北3省、河北省北部等地區均為優勢蜱種[11-13]。

本次PCR檢測結果顯示，大興安嶺林區牙克石段蜱的萊姆病螺旋體感染率相對較高，與萬康林等[14]的研究結果相似。不同鄉鎮蜱攜帶病原體差異較大。烏奴耳鎮蜱的斑點熱立克次體和無形體的感染率相對較高，而庫都爾鎮蜱的埃立克體、萊姆病螺旋體和新型回歸熱螺旋體的感染率相對較高。因此，要因地制宜，根據不同地區蜱攜病原體的種類和水平制定相應的應對措施。

不同蜱種攜帶的蜱媒病原體差異很大。嗜群血蜱的斑點熱立克次體感染率相對較高，與吳瓊等[15]的研究結果一致；全溝硬蜱的無形體、埃立克體和萊姆病螺旋體的感染率相對較高；森林革蜱的新回歸熱螺旋體感染率較高，這可能與蜱種及其宿主的特異性相互作用有關，也可能是病原體感染敏感性存在蜱種屬特異性[6]。本研究顯示雄性蜱攜帶病原體高于雌性，與國內外的研究結果一致[16-17]。另外，成蜱的病原體感染率高于幼蜱。這可能是由于多數蜱類在其發育期間需要更換宿主，成蟲被病原體感染幾率高于幼蟲。另外，某些病原菌可經卵傳播，蜱可以將病原菌傳遞給下一代，而無形體和埃立克體例外，二者均不能垂直傳播，故幼蜱中檢測不到該病原體。

大興安嶺林區牙克石段的蜱攜多種病原體復合感染率為19.5%，高于俄羅斯某地報道(12.4%)[18]。以往發表的文獻已證實，復合感染在萊姆病中多見[19]。本研究發現，蜱的萊姆病螺旋體和斑點熱立克次體復合感染率為7.1%，同時萊姆病螺旋體和埃立克體或無形體復合感染率均為5.3%，介于以往美國調查結果(3%～26%)[20-21]。病原體復合感染在全溝硬蜱中較普遍，國內外學者均在全溝硬蜱中同時檢測到2種或以上的病原體[12-13,22-23]，本研究顯示全溝硬蜱復合2種及以上病原體的感染率為14.6%(319/2 191)。全溝硬蜱是典型的3宿主蜱，完成一個生命周期需經過卵、幼蜱、若蜱和成蜱4個不同的階段[5]。全溝硬蜱自卵孵化后，一般需要多次更換宿主才能完成飽血過程，這極大地增加了該蜱被脊椎動物攜帶的幾率，也增加了其攜帶病原體的種類。免渡河鎮和烏奴耳鎮的蜱普遍攜帶多種病原體，需重點加強該地區蜱媒傳染病的監測和預防。

本研究所采集的東部林區范圍相對較窄，較為局限。此外，僅用布旗法采集了林區的游離蜱，缺乏不同采集方法及不同宿主對蜱種及分布特征影響等方面的資料。在后續的研究中，我們會逐漸擴大樣本采集范圍、增加不同寄生宿主蜱的采集，更深入的挖掘不同宿主、不同生境對蜱攜病菌種類的影響。另一方面，我們在病原體的進一步分型中，遇到困難，目前課題組正在努力處理，序列分析結果未能呈現。