基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR快速檢測鼠疫耶爾森氏菌

謝 輝，周 蕾，祁芝珍，邵高祥

鼠疫是由鼠疫菌感染所引起的一種自然疫源性疾病，能通過呼吸道直接接觸傳播，引起人間疫情暴發(fā)流行。快速有效的診斷技術(shù)是控制鼠疫疫情的關(guān)鍵，鼠疫菌傳統(tǒng)診斷方法主要有細(xì)菌培養(yǎng)及鼠疫反向血凝試驗(yàn)，在鼠疫監(jiān)測和疫源地調(diào)查中使用頻率高，特異性較強(qiáng)，但操作復(fù)雜且耗時(shí)，易延誤疫情判定。本研究是基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR診斷方法，首先是建立熒光定量PCR(探針)診斷方法以快速準(zhǔn)確檢測鼠疫菌，其次將熒光定量PCR檢測試劑(引物、酶、dNTP)預(yù)混凍干，徹底擺脫冷鏈運(yùn)輸和冷藏保存，從而制備一種能夠在室溫(25 ℃)穩(wěn)定保存的試劑，使用時(shí)僅需將待測核酸溶液與預(yù)混試劑簡單混合(試劑可瞬間崩解)即可上機(jī)檢測，大大簡化了操作流程，降低了外源污染的可能性。這種基于室溫長期儲存的核酸檢測預(yù)混體系的熒光定量PCR檢測方法，適合鼠疫疫源地監(jiān)測以及流行病學(xué)現(xiàn)場調(diào)查，為鼠疫的預(yù)防和控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑及儀器 核酸檢測試劑(探針法)由北京磐創(chuàng)精準(zhǔn)有限公司提供；中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管(批號2020-1)由中國藥品生物制品檢定所提供；熒光定量 PCR擴(kuò)增儀購于鯤鵬基因(北京)科技有限責(zé)任公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 測試菌株：55株鼠疫耶爾森菌菌株是分別從11個鼠疫自然疫源地不同宿主動物分離獲得的代表株；減毒菌株EV76由鼠疫菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。對照菌株：假結(jié)核耶爾森氏菌15種血清型，由鼠疫菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。見表1。

表1 熒光定量PCR凍干試劑檢測試驗(yàn)菌株的結(jié)果Tab.1 Detection of the test strain with fluorescence quantitative PCR lyophilized reagent

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及模板制備 將選取的55株野生鼠疫耶爾森氏菌菌株、減毒菌株EV76及15種血清型假結(jié)核耶爾森氏菌培養(yǎng)于1%溶血赫氏培養(yǎng)基，經(jīng)28 ℃孵育24 h，取細(xì)菌培養(yǎng)物加入0.5 mL滅菌純水制成菌懸液， 100 ℃加熱10 min滅活后離心(12 000 r/min，2 min)，取上清作為DNA模板，其中減毒菌株EV76模板作為陽性質(zhì)控模板。

1.2.2 熒光定量PCR檢測法

1.2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 引物合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號AF350075)公布的鼠疫耶爾森菌3a基因序列，由北京磐創(chuàng)精準(zhǔn)有限公司合成：

Y3a1：5′-TGTAGCCGCTAAGCACTACCATCC-3′；

Y3a2：5′-GGCAACAGCTCAACACCTTTGG-3′。

1.2.2.2 鼠疫菌模板的制備 參照1.2.1取上清作為DNA模板。

1.2.2.3 基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)熒光定量擴(kuò)增反應(yīng)的優(yōu)化 以不同退火溫度(60～65 ℃)進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增反應(yīng)，選擇最佳退火溫度。

1.2.2.4 基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR檢測方法 反應(yīng)體系及擴(kuò)增和循環(huán)條件：反應(yīng)體系20 μL，取制備的各菌株模板19 μL加入凍干試劑(1 μL)進(jìn)行溶解，同時(shí)用EV菌模板作為陽性對照，用滅菌去離子水作為陰性對照，用優(yōu)化擴(kuò)增條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增：42 ℃ 1 min，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃退火延伸30 s，45個循環(huán)；40 ℃保溫 60 s，結(jié)束后進(jìn)行熒光信號采集，根據(jù)熒光信號循環(huán)(Ct)來判斷擴(kuò)增結(jié)果，Ct值<35判為陽性。

靈敏度試驗(yàn)：根據(jù)比濁法測定鼠疫耶爾森菌EV76菌液濃度，將菌液從106CFU/mL以10倍倍比稀釋至1.0×102CFU/mL，取各濃度菌液制備模板(方法同1.2.1)用于熒光定量PCR擴(kuò)增。

特異性試驗(yàn)：將制備的55株野生鼠疫菌菌株模板、假結(jié)核耶爾森氏菌15種血清型進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。

凍干試劑的保存期試驗(yàn)：將試劑分別放置于25 ℃、37 ℃，保存不同時(shí)間，定期進(jìn)行敏感性檢測，考察不同時(shí)間、溫度條件下該試劑的穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR退火溫度的優(yōu)化結(jié)果 以鼠疫EV菌為模板，在不同退火時(shí)間、不同退火溫度下的試驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)條件退火溫度為60 ℃時(shí)，對EV菌株的檢測信號值最強(qiáng)，Ct值最小。

2.2 基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 以鼠疫耶爾森氏菌EV為熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，以比濁法測定菌液濃度稀釋至1×106CFU/mL，再以滅菌純水10倍稀釋至1×10 CFU/mL，取各濃度菌液提取核酸進(jìn)行熒光定量PCR檢測，檢測所得各個標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，熒光定量PCR儀自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1所示。

圖1 鼠疫耶爾森氏菌核酸預(yù)混凍干試劑檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Yersinia pestis detection with nucleic acid premix lyophilized reagent

2.3 基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR敏感性檢測 通過對鼠疫菌懸液10倍系列稀釋后制備模板，按照1.2.2進(jìn)行熒光定量檢測，結(jié)果顯示基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR敏感性達(dá)到102CFU/mL，如圖2所示。

2.4 基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR特異性檢測 將提取的我國11個疫源地野生鼠疫耶爾森菌55株作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，55株野生鼠疫菌檢測為陽性，與鼠疫菌近源的假結(jié)核耶爾森菌15種血清型檢測為陰性(圖3)，說明研制的核酸預(yù)混凍干試劑具有較好的特異性。

a～k為我國11塊疫源地野生鼠疫菌代表菌株的擴(kuò)增曲線；l為假結(jié)核耶爾森菌代表菌株；m為陰性對照圖3 鼠疫耶爾森氏菌核酸預(yù)混凍干試劑特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of Yersinia pestis detection with nucleic acid premix lyophilized reagent

2.5 基于核酸預(yù)混室溫儲運(yùn)技術(shù)的熒光定量PCR檢測凍干試劑的保存期試驗(yàn) 結(jié)果顯示核酸預(yù)混凍干試劑置于25 ℃、37 ℃保存180 d后檢測其敏感性，與對照溫度(0 ℃)相比無差異，檢測下限均為1×102CFU/mL。見表2。

表2 熒光定量PCR凍干試劑不同保存條件的敏感性(Ct值)Tab.2 Sensitivity of the fluorescence quantitative PCR lyophilized reagent under different preservation conditions (Ct value)

3 討 論

我國是鼠疫自然疫源地分布廣泛、結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜的國家，到目前為止已有11塊鼠疫疫源地[1]，為防止鼠疫從疫源地向人類傳播，我國針對鼠疫疫源地采取多種監(jiān)測措施[2]，而能夠提高監(jiān)測效力的措施，防止疫源地動物疫情波及人間，最關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)就是建立實(shí)用性鼠疫菌檢測的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。目前在鼠疫疫源地監(jiān)測主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)及鼠疫反向血凝試驗(yàn)，這些方法在過去幾十年里為鼠疫菌診斷發(fā)揮了重大作用，但因其敏感性差、檢測時(shí)間滯后不能滿足快速診斷的需要[3]。現(xiàn)行的鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)納入其中，大大促進(jìn)了鼠疫菌檢測技術(shù)的發(fā)展，但存在操作步驟復(fù)雜、易引起核酸污染而出現(xiàn)假陽性、無法定量分析等不足，尤其是鼠疫疫源地在偏遠(yuǎn)地區(qū)而PCR試劑的運(yùn)輸、儲存及現(xiàn)場應(yīng)用均在低溫條件下進(jìn)行，導(dǎo)致檢測鼠疫菌PCR技術(shù)不能較好發(fā)揮作用。為解決實(shí)際問題，1995年出現(xiàn)的針對PCR實(shí)際應(yīng)用需要室溫保存試劑的研究[5-6]，因能克服上述缺點(diǎn)，已有學(xué)者將其應(yīng)用于病原體檢測[7]。本項(xiàng)目是在上述研究成果上通過依托經(jīng)典、可靠的熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，將全體系預(yù)混室溫儲存技術(shù)應(yīng)用于野外監(jiān)測時(shí)鼠疫菌的檢測。

基于全體系預(yù)混室溫儲存技術(shù)熒光定量PCR方法的工作原理，是將熒光定量PCR反應(yīng)體系中的酶、引物、探針、dNTP預(yù)先混合后進(jìn)行引物探針優(yōu)化設(shè)計(jì)，加入既能保護(hù)核酸試劑的活性又可為試劑復(fù)溶提供賦形與崩解的穩(wěn)定劑，通過采用熱干燥、冷凍干燥等不同干燥工藝和不同工藝參數(shù)分別對支撐體系進(jìn)行干燥，研制成全預(yù)混體系可室溫儲存的凍干試劑。本研究正是應(yīng)用已研制的凍干檢測試劑，只需加入樣品模板，置于熒光定量PCR分析儀檢測鼠疫菌，通過分析軟件直觀記錄整個PCR過程，一步式加樣使操作過程簡便化，避免核酸污染和操作時(shí)的人為誤差。為考察該技術(shù)是否適合檢測我國各鼠疫疫源地菌株，本試驗(yàn)選取我國11塊鼠疫疫源地55株野生菌代表菌株及與鼠疫菌近源的耶爾森氏菌屬中的假結(jié)核耶爾森氏菌15種血清型，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基于全體系預(yù)混室溫儲存技術(shù)的熒光定量PCR凍干試劑的敏感性為102CFU/mL，這與文獻(xiàn)報(bào)道的普通PCR(敏感性為102CFU /mL)相同[8]。特異性結(jié)果表明我國11個疫源地的野生鼠疫菌擴(kuò)增均為陽性，假結(jié)核耶爾森菌15種血清型擴(kuò)增均為陰性，驗(yàn)證該技術(shù)具有良好特異性。凍干試劑在25 ℃(室溫)以及37 ℃(高溫)條件下保存180 d，敏感性與冷凍保存的試劑無差異，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出鼠疫耶爾森氏菌定量結(jié)果。

本研究對該檢測方法的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究，首次應(yīng)用本檢測方法檢測我國各疫源地的鼠疫耶爾森氏菌，該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、可量化的特點(diǎn)，為研制診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)；全預(yù)混的凍干試劑可室溫儲存、運(yùn)輸，試驗(yàn)操作便捷快速，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室精準(zhǔn)技術(shù)在鼠疫野外現(xiàn)場條件下的廣泛使用。