同位素標記的靶向藥物體外篩選研究

黃立群,李曙芳,周文華,孫鴿,秦秀軍,李建國

(中國輻射防護研究院GLP中心，太原，030006)

0 引言

藥物篩選是新藥研究開發的起點和重要環節，篩選的靶點包括受體、酶、離子通道等，其中受體參與機體的各種生理和病理過程，是藥物篩選的主要靶標之一[1]。受體是細胞表面或細胞內識別、接收、傳遞、放大信號的一類生物大分子，能引起靶細胞產生生物效應。受體與配體的相互作用具有高特異性、高選擇性、高親和性、飽和性和可逆性等特點，現有藥物中超過50%的藥物以受體為作用靶點[2]。

單克隆抗體、多肽等配體標記放射性核素后，通過與受體的特異性結合可以達到顯像或治療的目的。藥物篩選是通過規范化的實驗手段從大量化合物或新化合物中選擇對某一特定作用靶點具有較高活性化合物的過程，成像技術的發展使得基于熒光標記和配體的檢測成為可能，盡管熒光標記法已廣泛用于細胞親和性實驗，但基于同位素標記的親和性試驗具有靈敏度高、專一性好、更好模擬核素標記靶向性等特點[3]。蛋白質配體-受體的作用本質上是蛋白質的相互作用，其親和性基于蛋白質相互作用的理論，但實際操作中要想精確測定面臨許多挑戰[4]。其中最重要的兩點是親和反應的平衡時間和配體的消耗，親和反應的平衡高度依賴于配體的濃度和親和性的強弱，通常需要數小時達到平衡；親和性的精確測定需要對平衡時自由配體的濃度進行測定，通常假定實驗起始時的配體濃度等于平衡時自由配體的濃度，這個假設成立的前提是系統中起始配體的濃度遠遠大于受體的濃度，如果配體消耗較多，會導致親和曲線右移，使解離常數Kd較實際值偏大，只有基于合適的體系，才能準確測定配體-受體的親和性[5]。

PSMA-617是已遞交FDA上市申請的PSMA靶向藥物，用于轉移性去勢抵抗性前列腺癌的靶向放射配體治療，其結構包含3部分，左側為PSMA靶向單元，右側為DOTA結構，用于螯合金屬離子，中間部分為連接結構。PSMA-617結構圖見圖1。本實驗在離體條件下，基于人前列腺癌LNCaP細胞表面前列腺癌細胞膜抗原(PSMA)靶點，通過與125I標記的靶向藥物A(由PSMA-617右側單元改為酪胺基團而成，用于125I的標記)的競爭性結合，篩選特異性結合的靶向配體，并比較其親和性大小，從而建立靶向藥物的體外同位素標記篩選方法。

圖1 PSMA-617結構圖

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人前列腺癌細胞，南京科佰生物科技有限公司。RPMI 1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶，Gibco公司。磷酸緩沖液，上海生工生物工程有限公司。DMSO，索萊寶生物技術有限公司。Na125I溶液，中國同輻股份有限公司。多孔過濾板、篩選架，Millipore公司。化合物A為靶向PSMA已知配體，B、C、D和E為待測配體，對PSMA-617靶向單元進行了改進，親和特異性未知。

1.2 實驗系統

人前列腺癌細胞，用含有15%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，每2天更換培養基，當細胞融合度達到90%以上時按照1∶3傳代，細胞生長融合度達到70%～80%時用于實驗。

1.3 125I標記與質控

125I標記采用氯胺-T法，吸取1 nmol的多肽溶液，2.0 mCi的Na125I溶液充分混勻，在混合液中加入14 μL的氯胺-T溶液，混勻后室溫靜置5 min，加入2 μL的抗壞血酸鈉溶液，混勻2 min，加入HLB柱抽提，經2次純化后使用。薄層層析法檢測標記化合物的放化純度。

1.4 實驗方法

1.4.1實驗準備

(1)Binding buffer 溶液配制：取47.5 mL RPMI 1640培養基，加入2.5 mL 5%BSA溶液，混勻待用，現用現配。

(2)125I標記配體工作液配制：根據原溶液放射性活度濃度用Binding Buffer溶液稀釋混勻，配制成放射性濃度約為0.4 μCi/mL的125I-A放射性標記配體工作液，現配現用。

(3)配體工作液配制：A-D配制成濃度為2 000 μmol/L的儲備液，吸取儲備液5 μL，加入245 μL Binding buffer溶液中，混勻配制成40 μmol/L的工作液。依次取20 μL按10倍梯度用Binding buffer溶液，按10倍梯度逐級稀釋，配制配體工作液，現配現用。

1.4.2劑量與分組

設計空白對照組(不含細胞)、陽性對照組(含細胞，不含配體)、化合物組，化合物組包括待測配體B、C、D、E及參考配體A，每種化合物分別設置6組，組1、組2、組3、組4、組5、組6的配體溶液終濃度分別為0.1、1、10、100、1 000、10 000 nM。

1.4.3親和性試驗

將對數生長期細胞用Binding buffer(RPMI 1640加上0.25%BSA，防止非特異性結合)溶液懸浮配制成濃度為(1～3)×106個/mL的細胞懸液，以每孔100 μL的量將細胞懸液接種于96孔過濾板中(空白組除外，空白組加入150 μL的Binding buffer)。每孔中分別加入50 μL的125I-A放射性標記化合物(每孔總放射性活度約0.02 μCi)?；衔锝M分別加入50 μL系列梯度濃度工作液，陽性對照組加入50 μL的Binding buffer。每個濃度和組別均設3個復孔。以參考配體A為例，每組化合物的試驗體系中各種組分加樣體積列于表1。

表1 每組化合物的試驗體系中各種組分加樣體積(以參考配體A為例)

在37 ℃培養箱中孵育1 h后抽濾，每孔加入200 μL Binding buffer溶液清洗抽濾3次。將板托取下晾干后，小心撕下濾膜放置于離心管底部，γ-counting檢測計數。

1.4.4結果統計與分析

計算公式：

式中，Cs為系列濃度受試物放射性計數；Cc為陽性對照組放射性計數；Cb為空白對照組放射性計數。

以125I-A結合率為縱坐標，logM濃度為橫坐標，通過GraphPad Prism5.0線性回歸分析計算受試物的IC50濃度(即競爭性結合50%125I-A的受試物濃度)，建立擬合曲線計算IC50。

根據IC50值大小可以判斷化合物與PSMA靶點親和性的相對大小，IC50越小，化合物與PSMA靶點的親和性越高。

2 實驗結果

2.1 125I-A標記及質量控制

125I-A標記放化純度檢測結果見圖2。放射化學純度受制備方法及原料的化學純度、產物存放條件等影響，對于體外篩選研究，一般放化純度控制在90%以上。由圖2可見，125I-A的標記放化純度達到了91.92%，滿足體外篩選實驗需要。將醇洗餾分加入含0.5% VC-Na的pH 7.5磷酸溶液中，混勻后分裝保存于-80 ℃，可穩定保存1個月以上。

圖2 125I-A標記放化純度

2.2 親和性實驗結果

化合物A、B、C、D、E的競爭性結合擬合曲線見圖3，IC50值列于表2。由表2可見，與PSMA靶點的親和性由大到小的化合物為：C>B>A>D>E，即化合物C與PSMA靶點的親和性最高。

表2 化合物的LogIC50和IC50擬合值

圖3 化合物的競爭性結合擬合曲線圖

親和性試驗中必須考慮非特異性結合，放射性配體除了結合我們感興趣的靶點外，還可以與其他物質非特異的結合，如細胞膜、多孔板、濾膜甚至其他受體等，從而產生不依賴于靶點的“背景”信號。非特異性結合的水平可以通過增加非標記配體量從而完全占據結合靶點(替代放射性配體)時的放射性計數進行測定。理想的親和性實驗中，放射性配體應有較高親和性，較低的非特異性結合，高度的特異性結合(70%～100%)。降低非特異性結合可以提高特異性結合比率，通常降低非特異性結合的方法有：控制反應體系中受體的含量，非特異性結合通常隨著受體濃度的增加而增加；多孔板使用BSA或聚乙烯預處理可以降低非特異性吸附；另外過濾和緩沖液的清洗可以清除大多數非特異性結合信號。本實驗中，Binding buffer中添加了0.25%BSA，最后buffer清洗3次可以顯著降低非特異性結合，對于管壁和濾膜的非特異性吸附通過設定空白組，計算特異性結合率時進行了扣除，最終特異性結合率控制在了85%以上，滿足親和性試驗要求。

3 討論

與基于可溶性蛋白質的體外實驗相比，基于細胞的配體-受體親和性試驗具有內源性的優點，可以防止受體形成復合物，影響親和實驗結果[6]。細胞親和性實驗有直接測定法和競爭性結合測定法，直接測定法是將系列梯度濃度的標記化合物與細胞共同孵育，達到平衡后分離上清液，測定細胞的標記化合物含量，根據結合率計算親和性曲線。競爭性結合是在上述體系中引入定量的標記配體，待測配體與標記配體競爭性結合細胞表面受體，最后測定細胞表面競爭性配體的含量，建立競爭性擬合曲線圖，求得IC50值，由Cheng-Prusoff方程可以計算化合物的Kd值

方程中已知競爭性配體的Kdcompetitor值和競爭性配體的濃度，根據測得的IC50值，可以間接求得待測化合物的Kd值,但應注意競爭性配體的Kdcompetitor值必須是基于同樣條件下在同種細胞內測得的結果[7]。無論直接或者間接方法，盡管親和性試驗容易開展，但Kd值的精確測定仍面臨挑戰，受操作者和試驗條件的影響較大。但在早期候選藥物篩選過程中，依據競爭性結合實驗測得的IC50值判斷其親和性相對大小，可以滿足早期候選化合物篩選的需要。

藥物篩選中常使用的放射性同位素有14C、3H、125I、131I等，在使用上各有優缺點，可根據標記物、供應和實驗要求選擇合適的核素。使用C和H標記不改變化合物的結構及免疫學活性，且半衰期很長，制備的標記物可以長時間放置，但標記過程較為復雜，難以獲得高比放射性的標記物，并且衰變產生弱β射線，需要液體閃爍計數器才能準確測量，測量步驟繁瑣，對于碘標記容易喪失免疫化學或生物活性的藥物才考慮使用該方法[8]。碘供應的方便性、較低的價格及高效率的樣本檢測使其成為藥物篩選試驗中最常用的核素，相較于131I，125I的使用有更多的優勢，首先，半衰期適中，允許核素和標記化合物的貯存和應用；其次衰變發射低能γ射線，輻射自分解少，標記化合物能穩定貯存，同時對操作人員的防護要求較低。