γ射線對比格犬凝血功能的影響

李曙芳,岳娟,許文黎,黃立群,王志鵬,孫鴿,胡波

(中國輻射防護研究院GLP中心，太原，030006)

機體受到一定劑量照射后，可引起出血現象。出血是輻射損傷最嚴重的癥狀之一，也是導致機體死亡的主要原因，常表現為全身廣泛性小血管出血，出血原因較為復雜，其中輻射引起凝血功能障礙和微循環障礙是引起出血的重要機制之一[1-2]。照射劑量不同，會導致出血發生時間、出血部位、嚴重程度不同。凝血常規檢測是臨床上常用的血液學檢驗指標之一，主要包括凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶時間(APTT)、D-二聚體(D-D)和纖維蛋白降解產物(FDP)等，可準確反映受檢者的凝血功能狀態[3]。APTT、PT分別檢測內、外源性凝血系統, D-D和FDP則是纖維蛋白階段的檢測，可作為繼發性纖溶亢進主要實驗指標：D-D是一種纖維蛋白降解產物中的一種片段，是交聯后纖維蛋白被纖溶酶降解的特異標志物，是確定體內有無血栓形成及繼發性纖溶的指標，其含量變化可作為體內高凝狀態和纖溶亢進的標志；FDP是在凝血過程中形成的纖維蛋白原被纖溶酶降解形成的纖維蛋白復合物，它是原發性纖溶亢進標志物。

本研究觀察比格犬受到60Co γ射線不同劑量單次全身單側照射后不同時間血小板和凝血功能指標的變化情況，以期為輻射損傷中出血綜合癥的研究提供基礎和依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12只健康比格犬(7.5～8.0 kg)，南京柴門生物科技有限公司[動物質量合格證號：SCXK(蘇)2016-0007]。動物購回后，置于中國輻射防護研究院非嚙齒類實驗動物設施[合格證號：SYXX(晉)2016-0002]獨居籠養。

1.2 照射條件

60Co γ射線照射源，中國輻射防護研究院鈷源房，檢定證書編號：DYjl2013-3512，檢定單位:中國計量科學研究院，檢定時間：2013年10月。

1.3 主要試劑與儀器

HEMAVET 950型全自動血細胞分析儀，美國DREW公司；半自動四通道血凝儀，法國STAGO公司；Konelab Prime30全自動生化分析儀，美國Thermo Fisher 公司；血細胞分析儀試劑包，美國DREW公司；活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)檢測試劑盒為上海太陽生物技術有限公司生產；纖維蛋白原(FDP)、D-二聚體(D-D)檢測試劑盒為廣州科方生物技術股份有限公司生產。

1.4 實驗方法

1.4.1動物分組與照射

比格犬檢疫1個月后，按照體重隨機分為2 Gy照射組、3 Gy照射組和4 Gy照射組，吸收劑量分別為2 Gy、3 Gy、4 Gy，每組4只。比格犬固定后，清醒狀態下接受單次全身單側照射，照射劑量率為 50 cGy/min，源距為2.50 m。

1.4.2觀察指標

(1)觀察動物一般體征，記錄死亡時間。進行大體解剖，分析死因。

(2)血小板計數：照射前及照射后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、30 d，抽取比格犬前肢靜脈血液，檢測血小板計數。

(3)凝血指標：照射前及照射后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、30 d，用檸檬酸鈉抗凝采血管抽取比格犬前肢靜脈血2 mL，經2 500 g離心15 min分離得血漿，用于APTT、PT的檢測；用分離膠-促凝劑采血管采血 5 mL，血細胞凝集后，2 500 g離心15 min，分離得血清，用于檢測D-D和FDP。

1.4.3數據處理

采用SPSS 26.0統計軟件，單因素方差分析，p<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般體征

2 Gy照射組所有動物均未見明顯異常，30天存活率為100%。

3 Gy照射組有1只動物在照射后15 d精神萎靡，食欲減退，持續2天后狀態恢復，但見便血；30天存活率為100%。

4 Gy照射組照射后20 h內1只動物嘔吐，1只有惡心反胃；有3只動物分別在第15、18、28天死亡，死亡動物解剖均可見肺臟大面積出血，氣管內有泡沫狀液體，心包、脾臟、腸系膜、直腸等局部出血。出血是動物死亡的主要原因。

2.2 血小板計數

比格犬受照后不同時間血小板計數的變化情況列于表1。由表1可見，受照比格犬在照射后7天已有出血傾向，在照射后14天達最低值，接近極期，與動物一般觀察結果一致。

表1 比格犬受照后不同時間血小板計數(109/L)

2.3 凝血指標

2.3.1活化部分凝血活酶時間(APTT)

比格犬受照后不同時間APTT的變化情況列于表2。由表2可見，與照射前相比，照射組APTT從照射后24 h開始顯著縮短。結果說明，受照動物的凝血機制以內源性凝血途徑為主。

表2 比格犬受照后不同時間APTT的變化情況(s)

2.3.2凝血酶原時間(PT)

比格犬受照后不同時間PT的變化情況列于表3。由表3可見，與照射前相比，2 Gy照射組和3 Gy照射組PT差異不顯著，4 Gy照射組照射后14 d開始顯著縮短。結果說明，受照比格犬的外源性凝血機制啟動較緩。

表3 比格犬受照后不同時間PT的變化情況(s)

2.3.3D-二聚體(D-D)

比格犬受照后不同時間D-D的變化情況列于表4。由表4可見，2 Gy照射組、3 Gy照射組和4 Gy照射組D-D水平分別在照后28 d、21 d和24 h顯著高于照射前，受照劑量越大，D-D水平升高的時間越早，提示機體內血液呈高凝狀態和繼發性纖溶亢進的狀況越早。

表4 比格犬受照后不同時間D-D的變化情況(mg/L)

2.3.4纖維蛋白降解產物(FDP)

比格犬受照后不同時間FDP的變化情況列于表5。由表5可見，2 Gy、3 Gy、4 Gy照射組FDP水平分別在照射后28 d、21 d和24 h顯著高于照射前，受照劑量越大，FDP水平升高的時間也越早，機體原發性纖溶亢進的狀況越早。

表5 比格犬受照后不同時間FDP的變化情況(μg/mL)

3 討論

輻射引起的出血可發生在全身各部位，以點狀或者斑狀為主，時間以極期前最嚴重，程度與輻射劑量關系密切，由于具有此類特點規律，故稱之為輻射出血綜合征[2,4]，其發生機制大致有以下3個方面：血小板的數量和質量的異常；血凝、抗凝和纖維蛋白溶解系統障礙；血管壁的結構和功能異常。輻照可造成血小板降低，繼而凝血因子被激活啟動，發生一系列的瀑布反應：凝血酶原激活物形成、凝血酶原激活成凝血酶、纖維蛋白原轉變成纖維蛋白等，血凝和抗凝平衡被打破，可能發生彌散性血管內凝血，最終形成血栓；同時血管壁細胞的損傷和血管脆性增加，也是機體在照后容易出血甚至致死的重要原因。

在本實驗中可以看出，照射后24 h，各受照組比格犬APTT均開始下降，表明在照后早期，機體的內源性凝血機制即啟動，APTT是對輻射較為敏感的指標；而血液學指標PLT在照后7天才發生明顯的下降，提示出血狀況可能就要發生；而D-D和FDP的變化比較一致，表明受照劑量越大，出現彌散性血管內凝血、栓塞的可能性越早，更易出現栓塞性出血疾病[5-9]。結果表明，2 Gy和4 Gy照射均可啟動內源性凝血機制、形成血栓繼而出現纖溶亢進，而4 Gy照射引發出血死亡的機制與血凝、抗凝和纖維蛋白溶解系統障礙有關。

因此，在今后的輻射致出血綜合征機制及救治的研究中，在照后早期可關注內源性出血機制，可能發現輻射敏感標志物；極期前可關注凝血和抗凝平衡以及纖維蛋白降解，以研究具有針對性的預防措施或對癥治療措施。