胰腺癌組織中轉化生長因子β1、上皮間質轉化相關蛋白表達水平及其臨床意義

施景龍 李 博 賀 歡 宋向暉

1.廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科，廣東廣州 510630；2.廣東省第二人民醫(yī)院消化內科，廣東廣州 510317；3.廣東省婦幼保健院ICU，廣東廣州 510000

胰腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤疾病之一，其起病隱匿且病情發(fā)展較快，疾病惡性程度高，患者死亡率亦較高，是導致我國消化系統(tǒng)腫瘤疾病致死的主要原因之一[1]。近年來隨著腫瘤研究的展開，腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移等多項過程中相關基因在腫瘤病情評估和預后預測的研究成為熱點。上皮間質轉化（EMT）與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關，而E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等為EMT 相關蛋白，亦可參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展[2]。通過上調轉化生長因子β1（TGF-β1）可促進EMT 從而促進癌細胞轉移[3-4]。TGF-β1 和EMT 相關蛋白均可能與胰腺癌侵襲轉移相關，但目前關于胰腺癌組織中TGF-β1、EMT 相關蛋白表達水平及其與侵襲轉移關系研究仍較少。因此，本研究檢測胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關蛋白的表達水平，并分析其與病情以及腫瘤侵襲的關系，旨在為胰腺癌侵襲轉移防治提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月～2020年2月廣東省第二人民醫(yī)院消化內科（32例）和廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科（28例）收治的60例胰腺癌患者作為研究對象。納入標準：①患者均經影像學和病理學檢查確診為胰腺癌，首次確診；②預計存活期在3個月以上；③行胰腺癌根治手術；④知情同意。排除標準：①入院前經抗癌治療或合并手術禁忌證；②合并腫瘤轉移或其他腫瘤疾病患者；③合并肝腎功能障礙患者；④合并心腦血疾病患者；⑤妊娠期或哺乳期女性；⑥精神狀態(tài)異常患者。60例胰腺癌患者中，男35例，女25例；年齡45～76歲，平均（60.52±13.73）歲；高分化癌28例，低分化癌32例；腫瘤部位位于胰頭33例，胰體20例，胰尾7例；合并淋巴結轉移27例；腫瘤直徑＜2 cm 7例，2～4 cm 28例，＞4 cm 25例。所有患者及其家屬均知情同意，且本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 試劑和儀器

即用型SABC 免疫組織化學染色試劑盒、鼠抗人Vimentin 單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體及鼠抗人TGF-β1 單克隆抗體均購自南京凱基公司，工作濃度1∶100，SW-CY-1F型凈化工作臺購自蘇州凈化設備廠，微量移液器均購自德國Eppendorf 公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司，低溫冰箱購自山東青島海爾公司，Model550 酶標儀購自美國BIORAD公司，糖類抗原（CA）199和CA242 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組織化學染色檢測 以手術獲取的胰腺癌組織和癌旁組織為待檢測標本，免疫組織化學染色法檢測胰腺癌組織和癌旁組織的TGF-β1 以及E-cadherin、Vimentin 等EMT 相關蛋白陽性表達率。待檢測樣本經福爾馬林固定和石蠟包埋切制成厚度為4 μm連續(xù)切片，二甲苯浸泡10 min 脫蠟，梯度酒精脫水去除二甲苯，3%過氧化氫溶液進行內源性過氧化物酶的滅活，檸檬酸工作液加熱行抗原熱修復，添加40 μL 相應一抗，室溫（20℃）下孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3 遍，添加40 μL 相應二抗，室溫下孵育0.5 h，PBS 洗滌3 遍，DAB 顯色2 min后顯微鏡下觀察，顯色滿意后以清水終止反應，行蘇木精復染，返藍，脫水，透明，吹干并以中性樹脂封片。隨機選取3個視野（400×）進行觀察，TGF-β1、Vimentin 表達定位于細胞質，E-cadherin 表達定位于細胞膜，以出現棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達陽性，以陽性細胞＜10%為陰性，陽性細胞≥10%為陽性，統(tǒng)計陽性表達率。

1.3.2 酶聯(lián)免疫檢測 入組次日患者均取空腹肘靜脈血3 mL檢測血清CA199和CA242水平，血液樣本采集采用一次性針管和不含熱原和內毒素試管，1500 r/min、3 cm 半徑、4℃環(huán)境中離心10 min，待分層后收集上層血清在-20℃低溫冰箱冷藏待測。CA199和CA242 ELISA 試劑盒固相包被板在室溫（20℃）下平衡約20 min，設立標準品孔與樣品孔，不同濃度的標準品50 μL 分別加入標準品孔，取待測樣本10 μL 和樣本稀釋液40 μL 先后加入樣本孔，標準品孔與樣品孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL 并在37℃水浴恒溫箱孵育1 h，棄去反應液并吸水紙上拍干，洗滌，每孔中均加入顯色劑A、B 各50 μL，輕輕搖晃混勻后在37℃恒溫箱中避光孵育15 min，每孔中均加入終止液50 μL，15 min 內在450 nm 波長處測量各孔的吸光度（OD）值，制作標準曲線并根據標準曲線和樣本吸光度計算樣本濃度。

1.3.3 淋巴結轉移、浸潤分期狀況檢測 采用PhilipsIE33型超聲儀、3.5～6 MHz 探頭頻率常規(guī)行超聲檢查，觀察胰腺腫瘤形態(tài)、回聲、陰影狀況以及邊界模糊情況，行常規(guī)淋巴結掃描，對可疑淋巴結轉移部位取樣行病理檢查，確定淋巴結轉移、浸潤分期狀況，采用美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）第8版TNM 分期[5]中的淋巴結轉移、浸潤分期標準。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；Kendall 相關法分析胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關蛋白表達與其血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移、浸潤分期的關系，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織與癌旁組織中TGF-β1 和EMT 相關蛋白表達水平的比較

以出現棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達陽性，TGF-β1、Vimentin 表達于細胞質而E-cadherin 表達于細胞膜。胰腺癌組織細胞中TGF-β1 和Vimentin陽性表達細胞數占多數，僅有少數胰腺癌組織細胞為E-cadherin陽性表達；而在癌旁組織細胞中僅有少量細胞為TGF-β1 或Vimentin陽性表達，而E-cadherin陽性表達細胞數占多數（圖1～2，封三）。與癌旁組織比較，胰腺癌組織中TGF-β1 和Vimentin陽性表達率升高而E-cadherin 的陽性表達率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在胰腺癌組織中的表達（免疫組織化學染色法，400×）

圖2 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在癌旁組織中的表達（免疫組織化學染色法，400×）

表1 胰腺癌組織與癌旁組織中TGF-β1 和EMT 相關蛋白表達水平的比較[n=60，n（%）]

2.2 不同胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關蛋白表達水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期的比較

TGF-β1 陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期為T3～T4期比例均高于其陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；E-cadherin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期為T3～T4期比例均低于其陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Vimentin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期為T3～T4期比例均高于其陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關蛋白表達水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期的比較

2.3 胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關蛋白表達水平與其血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期的關系分析

Kendall 相關分析結果顯示，胰腺癌組織TGF-β1和Vimentin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期均呈正相關（TGF-β1：r=0.786、0.835、0.882、0.874，P＜0.05；Vimentin：r=0.757、0.792、0.808、0.849，P＜0.05），而胰腺癌組織E-cadherin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期均呈負相關（r=-0.842、-0.889、-0.818、-0.793，P＜0.05）。

3 討論

胰腺癌是臨床常見惡性腫瘤，好發(fā)于男性人群，發(fā)病率近年來呈現不斷上升的趨勢，其早期癥狀隱匿均無明顯的特異性，早期確診困難，且病情發(fā)展迅速，死亡率較高[6-8]。侵襲轉移是胰腺癌患者病情惡化和患者死亡的重要原因[9-12]。本研究中，近一半的確診胰腺癌患者出現了淋巴結轉移而浸潤分期為T3～T4期，而血清CA199和CA242水平明顯較高，其侵襲轉移明顯，需對其侵襲轉移進行有效預防和控制以緩解病情，改善療效和預后。近年來，腫瘤研究開展較多，腫瘤相關基因和蛋白表達檢測在腫瘤病情和預后評估中應用成為熱門。

TGF-β1 參與腫瘤的細胞增殖、分化調節(jié)、胚胎發(fā)育調節(jié)、促進細胞外基質形成以及免疫反應調節(jié)等多個過程，在腫瘤疾病早期具有腫瘤抑制因子的作用，而隨著腫瘤發(fā)展，TGF-β1 對腫瘤細胞的抑制作用失效，反而可刺激腫瘤血管生成、細胞外基質合成、抑制免疫并促進腫瘤細胞轉移[13-16]。本研究中，胰腺癌組織中TGF-β1 陽性表達率高于其癌旁組織（P＜0.05），證實TGF-β1 在胰腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能具有促進作用；TGF-β1 陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期為T3～T4期比例均高于其陰性表達患者（P＜0.05）；相關分析結果顯示，胰腺癌組織TGF-β1 表達與其血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移、浸潤分期均密切相關，可能促進胰腺癌侵襲轉移，TGF-β1 在胰腺癌組織中表達水平的檢測可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉移評估。EMT 在胰腺癌等腫瘤疾病演進中扮演重要角色，EMT 具有上皮細胞極性喪失和間質特征，可下調E-cadherin 等上皮細胞性標志物并上調Vimentin 等間質性標志物，從而促進腫瘤侵襲轉移[17-19]。本研究中，胰腺癌組織中E-cadherin陽性表達率降低而Vimentin陽性表達率升高，提示EMT 在胰腺癌發(fā)展中可能具有促進作用，這與Krebs 等[20]研究的Zeb1 激活EMT 促進胰腺癌的轉移結論以及Sheng 等[21]研究的促進EGF 誘導的胰腺癌細胞EMT 可促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展結論一致。E-cadherin、Vimentin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期為T3～T4期比例與其陰性表達患者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Kendall 相關分析提示，胰腺癌腺癌組織E-cadherin和Vimentin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結轉移率、浸潤分期均密切相關，EMT 可能促進胰腺癌侵襲轉移，E-cadherin、Vimentin 等EMT相關蛋白在胰腺癌組織中表達水平的檢測可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉移評估。而對TGF-β1 以及EMT干預可能為胰腺癌防治的有效措施。

綜上所述，胰腺癌組織TGF-β1、Vimentin、E-cadherin 表達均與腫瘤侵襲轉移密切相關，可能用于胰腺癌侵襲轉移評估。