晚期糖基化終末產物受體和血管內皮生長因子蛋白在非小細胞肺癌中的表達及意義

毛志方

江西省人民醫院腫瘤科，江西南昌 330006

非小細胞肺癌是全世界范圍內最為常見的惡性腫瘤之一，近幾十年研究發現，在多數發達及發展中國家中，非小細胞肺癌的發病率及死亡率均呈上升趨勢，5年生存率不足20%，每年新發的病例數達130萬[1-3]。而且非小細胞肺癌患者在確診時常處于晚期，治療效果較差。因此進一步探討非小細胞肺癌的發病機制，對于非小細胞肺癌的治療具有重要意義。晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE） 是一種細胞免疫球蛋白，主要以兩種形式存在于機體內，可與特異性配體結合，激活細胞內多種信號通路，促使細胞的炎癥反應加強，引起機體組織重塑，使肺部發生病理變化，因此與肺部疾病的發生、發展密切相關[4-6]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促進血管生成的重要因子，通過促進血管新生來滿足腫瘤的指數生長，并向腫瘤周圍浸潤轉移，因此成為多種惡性腫瘤的判定指標[7-9]。因此，本研究選取10份非小細胞肺癌組織和癌旁組織作為考察對象，探討非小細胞肺癌組織中RAGE 及VEGF 的表達及相關性，以期為非小細胞肺癌的發病機制闡述及臨床治療提供一定的指導依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月～2019年12月江西省人民醫院收治的10例非小細胞肺癌患者，每例患者僅取1份組織標本，共取10份非小細胞肺癌組織。患者男7例，女3例；＜50歲2例，≥50歲8例；腫瘤直徑＜4.0 cm 患者6例，腫瘤直徑≥4.0 cm 患者4例；分化程度：低分化5例，中分化3例，高分化2例。另外收集癌旁正常組織10份（距離腫瘤邊緣5 cm）作為對照。本研究經江西省人民醫院醫學倫理委員會審核及同意。

納入標準：患者經病理證實為非小細胞肺癌，并簽署研究知情同意書。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；合并肝腎功能異?；蛘咝墓δ懿蝗撸挥芯窦膊≌撸挥蟹呕熓氛摺?/p>

1.2 方法

將組織研磨后，按照Trizon 試劑盒提取RNA，采用UV-1600PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）測定mRNA 濃度和純度，后根據HiFi Script cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在CFX ConnectR實時熒光定量PCR 儀[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]上進行檢測，以GAPDH為內參，計算出各組RAGE、VEGFa mRNA 的相對表達量。

操作體系：RNase Free dH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Rrimer 1 μL、2×qPCR Mixture 12.5 μL，總反應體系25 μL。反應程序，三步法。預變性：95℃、10 min，變性：95℃、10 s，退火：58℃、30 s，延伸：72℃、30 s，40個循環。溶解曲線分析：95℃、15 s，58℃、1 min，95℃、15 s，58℃、15 s，58℃、15 s，95℃、0.5℃。

RAGE、VEGF-a、β-actin 的引物序列、引物長度、產物長度、退火溫度情況見表1。

表1 不同引物的引物序列、引物長度、產物長度及退火溫度情況

1.3 Realtime PCR 法檢測RAGE、VEGF mRNA 的含量

擴增結果利用2-ΔΔCt法進行分析，△△Ct=△Ct 試驗-△Ct 對照，△Ct 試驗=Ct 目的-Ct 內參，△Ct 對照=Ct 目的-Ct 內參。

1.4 統計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，不符合正態分布者經過變量轉換為正態分布后行統計學分析；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RAGE 及VEGF 在非小細胞肺癌組織及癌旁組織中的表達

RAGE mRNA 擴增曲線、溶解曲線見圖1，VEGF mRNA 擴增曲線、溶解曲線見圖2。

非小細胞肺癌組織中RAGE mRNA 的表達量（0.015±0.009）低于癌旁正常組織（1.000±0.000），差異有統計學意義（P＜0.01），非小細胞肺癌組織中VEGF mRNA 的表達量（4.040±1.650）高于癌旁組織（1.000±0.000），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 非小細胞肺癌組織中RAGE 及VEGF 相關性分析

經Pearson 相關性分析，非小細胞肺癌組織中RAGE 與VEGF 表達呈負相關（r=-0.654，P＜0.01）。

圖1 RAGE mRNA 測定結果

圖2 VEGF mRNA 測定結果

3 討論

RAGE 是一種細胞免疫球蛋白，主要以膜結合形式（mRAGE）和可溶性RAGE（sRAGE）存在于體內，主要定位于Ⅰ型肺泡上皮細胞基底膜，另外內皮細胞、神經細胞、嗜酸性粒細胞、氣道平滑肌細胞也均有表達RAGE[8-11]。研究發現，RAGE 在胚胎發育期的多種組織中高表達，成年后在除肺組織以外的其他組織中均低表達[10-11]。另外有研究表明，在腫瘤、神經退行性疾病、糖尿病、血管疾病等疾病中，RAGE 均高表達[10-11]，而在哮喘、肺纖維化、急性呼吸窘迫綜合征、支氣管肺發育不良、間質性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病及肺癌中低表達[12-13]。有研究結果顯示，RAGE 在非小細胞肺癌組織中蛋白及mRNA 表達量均下調，而且與腫瘤的TNM 分期、組織學類型相關，且過表達RAGE 可以使非小細胞肺癌細胞生長受限制，并誘導細胞凋亡[14-16]。本研究結果與以往報道結果一致[14]在非小細胞肺癌組織中，RAGE mRNA 表達量低于癌旁正常組織，提示RAGE 在非小細胞肺癌的發生、發展過程起著抑癌作用，與在其他腫瘤中的表達趨勢不同，原因可能在于RAGE 作為正常肺組織細胞膜上的受體，與肺泡的結構、形態、分化及功能密切相關。RAGE 表達量的下調不僅僅干擾了肺泡細胞的結構功能，也引發了肺部腫瘤的形成；也有可能是非小細胞肺癌細胞屬于支氣管上皮細胞，此類型細胞不表達RAGE，當RAGE 表達量明顯降低，可能會促進此類型細胞增殖，進一步誘導為癌細胞。

腫瘤的發生發展涉及癌細胞的生長、凋亡、遷移、侵襲及血管生成等多個復雜的過程，其中血管生成在腫瘤的生長及轉移過程起著重要作用。血管生成是一個涉及細胞外基底膜降解、內皮細胞遷移、增殖等復雜步驟的過程，整個過程涉及多種生長因子及細胞因子的調控作用，VEGF 是目前已知的血管生長因子中最強、特異性最高的一個。VEGF 不僅可以通過特異性結合于血管內皮細胞上的受體來發揮其生物學效應[17-18]，還可以通過其自身磷酸化、誘導細胞外基質降解、增加血管通透性進而發揮其促血管生成作用[19-20]。目前針對VEGF 抑制劑的研究已經被廣泛應用于臨床研究。本研究Realtime PCR 結果顯示，在非小細胞肺癌組織中，VEGF mRNA 表達量高于癌旁正常組織，與大部分學者的研究結果一致[21-22]，說明VEGF 促進非小細胞肺癌的發生發展。

另外本研究通過Pearson 相關性分析，結果顯示，非小細胞肺癌組織中的RAGE 與VEGF 表達呈負相關（r=-0.654，P＜0.01）。RAGE 的DNA 適體能夠降低對G361 裸鼠黑色素瘤8-羥基-2′-脫氧鳥苷、AGEs、RAGE、增殖核抗原、細胞周期蛋白D1、VEGF、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、CD31 和Mac-3 的水平，RAGE適體通過抑制AGE-RAGE 系統抑制腫瘤血管生成和巨噬細胞浸潤，從而抑制裸鼠黑色素瘤的生長和肝轉移[23]。RAGE 通過激活RAGE/NF-κB 通路誘導人滑膜細胞VEGF 生成及炎癥反應[24]。說明RAGE 可能能夠通過靶向VEGF 影響非小細胞肺癌的惡性生物學行為，成為非小細胞肺癌基因治療的新靶點之一。

綜上所述，RAGE 在非小細胞肺癌中低表達，VEGF 在非小細胞肺癌中高表達，而且非小細胞肺癌組織中RAGE 與VEGF 表達呈負相關。但由于標本數目的限制，目前尚未進一步探討RAGE、VEGF 與非小細胞肺癌患者臨床病理參數的關系，因此本研究未來將對RAGE、VEGF 在肺癌（包括非小細胞、小細胞以及其他病理類型）的發生發展過程中的關系及作用，進行進一步的探討。