環狀RNA在自身免疫性疾病中的研究進展①

吳亞彬 劉建華 秦曉松 （中國醫科大學附屬盛京醫院檢驗科，沈陽110004）

環狀RNA（circRNA）是一類新型長鏈非編碼RNA，與線性RNA不同，circRNA 形成共價閉合的連續環并在哺乳動物中充當基因調節劑。1976 年，在病毒中首次鑒定出 cricRNA［1］。circRNA 主要通過反向剪接或套索形式產生，其環化結構可抵抗RNA核酸外切酶降解，具有高穩定性。生物體內，circ-RNA具有2個顯著特性：高度保守及半衰期較長，因此可穩定地存在于外泌體和血漿［2-3］。就人類疾病診斷而言，circRNA 可能優于miRNA 和lncRNA。通常，免疫細胞具有可區分自身（即天然結構）和非自身或異常自身（即病原體或腫瘤抗原）的受體，從而使其能夠發現病原體或惡性轉化細胞。免疫細胞在精確調節部分免疫相關基因同時，促使生物體對病原體產生強大免疫能力，并限制其對自身抗原的免疫力。因此，當人體免疫力平衡時可有效抵御外界感染及損傷，而當機體免疫失調時則可導致炎癥反應加重，甚至引發自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、干燥綜合征等［4-5］。已有研究指出，miRNA 在免疫反應中具有重要作用［6］。隨著高通量測序技術發展，逐漸發現circRNA 在免疫性疾病中同樣發揮重要作用。circRNA 具有多個可與miRNA 結合的位點，因此能夠通過吸收miRNA 發揮作用，并通過堿基配對影響其他 RNA［7］。另外，circRNA 能夠與不同下游蛋白質結合，從而抑制蛋白活性。本文結合circRNA 的國內外最新研究進展，闡述circRNA 形成機制、分類、功能及其在自身免疫性疾病中的作用，以期為自身免疫性疾病診斷及治療提供新思路。

1 circRNA形成機制、分類和功能

1.1 circRNA 形成機制 circRNA 通過對初級RNA的反向剪接或套索機制產生［8-9］。與線性RNA不同，通常存在于RNA 分子兩端的3'和5'末端通過共價鍵連接導致環化。生物體內，反向剪接比套索機制更為常見，反向剪接可伴隨轉錄，也可在轉錄后發生［10-11］。反向剪接與套索機制具體表現為以下3 種形式：外顯子跳躍、內含子配對驅動環化及RNA 結合蛋白（RBP）驅動環化。外顯子跳躍產生包含跳過外顯子的套索結構，不但能夠產生穩定的含外顯子的circRNA，還產生1個不含跳過外顯子的線性轉錄本［12］。內含子配對驅動環化是基于外顯子側翼的內含子反向互補匹配，不同于環化外顯子跳躍機制。反向互補匹配可誘導側翼內含子間堿基配對，促進發夾形式形成，使外顯子5'和3'末端進入臨近空間，并誘導“頭對尾”拼接，此過程中，作用于RNA的腺苷脫氨酶（adenosine deaminases acting on RNA，ADARs）發揮重要作用，但此酶將通過對雙鏈RNA分子中的腺苷轉化為肌酐分子解壓縮雙鏈RNA 分子，從而減少circRNA 形成［13］。除單純內含子和外顯子參與circRNA 形成外，一些RNA 結合蛋白也可促進circRNA 形成。如果蠅研究發現，剪接因子Musblindblind（MBL）通過與 circMBL 序列側翼的內含子內的MBL結合位點特異性結合，驅動MBL的第2 個外顯子環化產生circMBL［14］。前列腺癌研究發現，RNA 剪接因子HNRNPL 參與其中，類似于果蠅研究中發現的剪接因子 MBL［15］。

總之，RNA 出現斷點后，在反向確認中誘導上游5′剪接供體位點與下游3′剪接受體位點連接，最終生成circRNA。不同斷裂點位置決定circRNA 組件的多樣性，表明circRNA 可被外顯子、內含子、基因間區域、非轉錄區域隨機組合環化而形成［16］。

1.2 circRNA 分類 根據circRNA 所形成的內部元素可將circRNA 分為3 類：外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA，其中，人類組織相關研究中，約80%~90%circRNA 來自外顯子基因序列，外顯子 circRNA 通常由 1~5 個外顯子組成［17］。另外，circRNA 可來源于單個宿主基因，包含相同的反向剪接連接，形成多個circRNA同工型。

1.3 circRNA 功能 目前circRNA 研究發現，外顯子circRNA 主要通過結合miRNA 的海綿機制實現其功能。CDR1as 上有63 個miRNA-7 結合位點，因此，將CDR1as稱為“miRNA 海綿”，通過吸附miRNA分子增強miRNA靶基因水平。

與外顯子circRNA 不同，含有內含子的circRNA位于細胞核，主要參與基因轉錄調節。ZHANG等［18］研究發現，源自ankrd52 第2 個內含子的ci-ankrd52，其功能可能取決于1 個共有序列，該序列在其5'剪接位點附近含有1 個富含GU 的7 核苷酸片段，以及靠近分支部位處富含C 的11 核苷酸片段，可防止內含子circRNA 分解，ci-ankrd52 主要在細胞核中積累，通過RNAPol2順式調節作用促進ankrd52轉錄。

circRNA 除充當miRNA 海綿與基因轉錄調節外，還可通過與相應蛋白相互作用發揮作用。如circ-foxo3 通過與p21 和Cdk2 蛋白形成三元復合物阻止細胞周期［19］。癌癥相關性研究發現，癌細胞系高表達circRNA circ-Amotl1，增加致癌蛋白c-myc 核保留，從而提高致癌蛋白穩定性，并增加其與多種啟動子結合的親和力，上調c-myc揭示了circRNA 在腫瘤發生中的新功能［20］。另外，circRNA 還可與其同源mRNA 競爭RNA 結合蛋白HuR，此蛋白能夠與多種RNA相互作用調節蛋白表達［21］。

雖然circRNA 定義為非編碼RNA，但有研究指出，真核生物核糖體可在circRNA 上啟動翻譯，但僅當RNA 包含內部核糖體進入位點（或IRES）元件時才可啟動翻譯［22］。最近，CHEN 等［23］建立 circRNA參考數據庫時，注釋了具有蛋白質編碼潛力的circ-RNA 內部核糖體進入位點和開放閱讀框（ORF），還提供了其通過質譜的蛋白表達證據，并分析從circRNA 翻譯的蛋白特征，包括結構域、N-糖基化位點、黏蛋白型O-糖基化位點和磷酸化位點。

2 circRNA在自身免疫性疾病中的作用

自身免疫性疾病是異質性疾病，主要表現為免疫系統受損及自身抗原免疫耐受喪失。雖然現在仍不清楚其分子機制，但多數研究表明，環境因素及表觀遺傳失調導致易感人群發病。隨著circRNA研究深入，發現其與免疫性疾病密切相關，不僅參與自身免疫性疾病發病機制，還可做為檢測自身免疫性疾病的非侵入性生物標志物［7］。

2.1 circRNA 與SLE SLE 是一種慢性、復雜性自身免疫性疾病，常累及全身多個器官，出現嚴重臨床表現，多發病于 20~40 歲育齡期女性［24］。雖然SLE 是免疫系統介導的疾病，但具體致病機制仍未明確。LI 等［25］采用人 circRNA 微陣列技術測量 SLE患者與健康對照者T 細胞中circRNA 表達譜，鑒定出127 種差異表達circRNAs。通過定量PCR 驗證，SLE 患者T 細胞中hsa_circ_0045272 表達下調。敲低hsa_circ_0045272 導致Jurkat 細胞早期凋亡明顯增加，ELISA 驗證發現，敲低 hsa_circ_0045272 顯著促進激活的Jurkat 細胞IL-2 產生。同樣，ZHANG等［26］采用 circRNA 微陣列技術分析 SLE 患者和健康對照的CD4+T 細胞發現，SLE 患者有12 個circRNA上 調 ，2 個 circRNA 下 調 。 上 調 的 circRNA 中hsa_circ_001 2919 變化異常明顯。SLE 患者CD4+T細胞中，自身免疫相關基因CD11a 和CD70 表達異常升高與其啟動子區DNA 低甲基化密切相關［26］。將靶向hsa_circ_0012919 的siRNA 導入細胞可明顯減少其表達，hsa_circ_0012919 下調增加SLE 患者CD4+T 細胞中 DNA 甲基轉移酶 1（DNMT1）表達，同時降低CD70 及CD11a 表達。由此得出，hsa_circ_0012919 下調可逆轉SLE 患者CD4+T 細胞中CD11a和CD70 啟動子區DNA 甲基化不足。另外，hsa_circ_0012919可通過與miR-125a-3P結合調節正常T細胞表達及其RANTES與Kruppel樣因子13（KLF13）分泌。SLE 患者堿性粒細胞向RANTES 和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）遷移速率明顯提高，可能與SLE患者組織損傷有關［27］。KLF13 可正向調控RANTES，并與CD4+T細胞中IL-4表達有關［28］。

GUO 等［4］采用二代測序分析 SEL 患者外周血單個核細胞（PBMC）中circRNA 表達譜，并按其疾病活動特征（穩定或活躍SLE）和健康對照進行分層，發現與健康對照組相比，SLE 患者PBMC 中僅hsa_circ_0000479 顯著上調。經過驗證階段及外部驗證階段隊列中，hsa_circ_0000479表達可作為SLE患者與健康對照組及類風濕性疾病患者診斷標志物。生物信息學分析顯示，hsa_circ_0000479 通過調節代謝途徑和Wnt 信號傳導途徑調節SLE 進展。Western blot 顯示，SLE 患者 Wnt-16 蛋白表達顯著降低。此外，18 例SLE 患者和10 例健康對照者PBMC中 hsa_circ_0049224、has_circ_0049220 和 DNMT1 表達研究發現，健康對照組hsa_circ_0049224 和has_circ_0049224 表達均顯著高于非活動和活動性SLE患 者［29］。DNMT1 表 達 與 hsa_circ_0049224 和 has_circ_0049220表達呈正相關。此外，SLE疾病活動指數（SLEDAI）與hsa_circ_0049224和has_circ_0049220表達呈負相關。

此外，SLE 患者血漿中circRNA 同樣發生改變，如 LI 等［30］對 SLE 血漿進行 circRNA 譜篩查，確認hsa_circ_400011、hsa_circ_102584、hsa_circ_101471和hsa_circ_100226 發生失調，但樣本量少及未進行其他人群篩查，缺乏診斷SLE 特異性。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）新型生物標志物研究發現，LN患者血漿 circRNA-002453 水平顯著升高［31］。與 RA患者和健康對照組相比，SLE 患者血漿circRNA-002453 表達上調，且其表達與24 h 蛋白尿和腎臟SLEDAI 評分顯著相關。因此，LN 患者血漿circRNA-002453 水平上調與腎臟受累程度有關，可作為LN患者診斷的潛在生物標志物。

2.2 circRNA 與類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA） RA 是一種具有多種病因的高度流行慢性疾病，其重要特征為多個關節普遍受累發炎，導致軟骨和骨侵蝕及關節變形，主要由遺傳易感性和環境刺激導致［32］。標志性自身抗體主要有類風濕因子、抗環瓜氨酸肽2及抗氨基甲?；鞍卓贵w等，但這些抗體變化與疾病活動度評分或長期治療反應無關，僅可反映免疫抑制強度，因此尋找更多潛在生物標志物對RA治療非常重要［33］。

研究發現，RA 與健康對照組單個核細胞數無顯著差異，circRNA 微陣列分析和qRT-PCR 驗證發現 ，RA 患 者 PBMC 中 circRNA-092516、circRNA-003524、circRNA-103047、circRNA-104871 和 circRNA-101873 與健康對照差異明顯［34］。circRNA-104871 顯示出最高的ROC AUC 值，其作為診斷生物標志物潛力較大，但由于樣本量小及未與其他自身免疫性疾病進行對比研究，本實驗結果需進一步研究。同時，ZHENG 等［35］研究發現，RA 與健康患者外周血單個核細胞中，hsa_circ_0092285、hsa_circ_0058794 顯著升高，而 hsa_circ_0088088、hsa_circ_0038644 顯著降低，其中hsa_circ_0088088 變化最為顯著。作為miRNA 的海綿，circRNA 可競爭性結合并抑制相應miRNA，從而增加相應miRNA 靶標。miRNA 在疾病進展具有組織及階段特異性，miRNA參與RAMMP 產生、白細胞活化、炎癥反應和滑膜細胞增殖［36］。hsa_circ_0088088 作為 hsa-miR-16-5p 的海綿，當hsa_circ_0088088 顯著降低時，hsa-miR-16-5p明顯升高，miR-16參與細胞凋亡和自噬調節［37］。

除對 RA 進行 PBMC 中 circRNA 篩查研究外，LI等［38］首次將RA 滑膜組織與正?；そM織進行層次聚類分析，并經功能分析研究表明，circRNA 是導致基因表達差異的重要因素。hsa_circ_0001859 通過充當海綿直接抑制miR-204/211 轉錄，從而充當調節ATF2 表達的誘餌。ATF2 為CREB 家族成員，通常與AP1（c-Jun和c-Fos）和異二聚體相關，在骨骼系統、中樞神經系統和炎癥中起重要作用［39］。在SW982 細胞中進行驗證，siRNA 沉默hsa_circ_0001859可抑制ATF2表達并降低其炎癥水平。

2.3 circRNA 與多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS） MS 是中樞神經系統的一種慢性自身免疫性疾病，早期階段發生炎癥、脫髓鞘及軸突丟失，免疫、遺傳、組織病理學研究和治療試驗結果表明，免疫系統在MS疾病過程中起關鍵作用［40］。

通過在MS 基因組范圍內的相關基因座中尋找非編碼元件可能的富集區，PARABOSCHI 等［41］發現，非編碼元件富集較多，尤其在包含MS 相關單核苷酸多樣性（SNP）的73 個連鎖不平衡區塊（LD）中具有豐富的環狀RNA，并驗證與MS 相關位點即STAT3 基因所表達的hsa_circ_0043813 3 種基因型進行SNP 相關調節，首次表明MS 全基因組相關研究最高變異區位于富含circRNA 的不平衡的區塊。另外，替代剪接異常已成為自身免疫性疾病的復發特征，剪接調控基因普遍缺陷與MS 密切相關。CARDAMONE 等［42］研究發現，與健康對照組相比，復發緩解型MS 患者外周血單個核細胞中替代剪接亞型與鑒定出的circRNA 均明顯失調。RNA異常參與該疾病發生。另一項研究發現，與健康組相比，MS 患者外周血白細胞中有406 個差異表達的circRNA，其中 hsa_circ_0035560 和 hsa_circ_0005402在疾病早期即表達下調，且兩者均位于膜聯蛋白A2（ANXA2）基因內部的 15 號染色體［43］。已報道ANXA2 是 miR-155 的靶標，miR-155 是血腦屏障神經炎癥中的關鍵miRNA，與MS 中Th1 和Th17 細胞分化及髓樣細胞極化有關，MS 患者和EAE 小鼠中，miR-155 在外周血單個核細胞和活動性病變中顯著增加，并與疾病嚴重程度相關［44］。

2.4 circRNA 與原發性干燥綜合征（primary Sj?gren's syndrome，pSS） pSS 是一種炎癥性疾病，主要破壞口腔與眼睛腺體，但pSS 患者有時會出現腺體外表現，如腎小管間質性腎炎和自身免疫性肝炎，主要通過自身抗體過表達介導，可能導致高球蛋白血癥。pSS 病因尚未闡明，但同其他自身免疫性疾病一樣，遺傳和環境因素對pSS 發生發揮重要作用。

通過對外周血中單個核細胞進行circRNA 表達微陣列分析發現，與健康個體相比，pSS 患者hsa_circRNA_001264 和 hsa_circRNA_104121 表達上調，hsa_circRNA_045355表達降低［5］。并且，與晚期患者相比，早期pSS 患者hsa_circRNA_001264 和hsa_circRNA_104121 表達較高，hsa_circRNA_045355 表達下調，且3 種circRNA 表達失調與疾病活動指數密切相關。circRNA 可競爭性結合并抑制相應的miRNA。hsa_circRNA_104121 可結合并抑制miR-203a-3p 和 miR-143-3p，在 pSS 患 者 中 hsa_circRNA_104121 表達升高?？谇唤】挡涣蓟颊咄僖褐衜iR-203a-3p表達更高［45］。RA滑膜組織中miR-143-3p表達顯著高于對照組，抑制miR-143-3p 表達可抑制細胞增殖，降低炎癥細胞因子水平并促進細胞凋亡，首次揭示了pSS患者circRNA異常表達特征［46］。

2.5 circRNA 與原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC） PBC 是一種罕見的慢性自身免疫性膽汁淤積性肝病，其特征為淋巴細胞浸潤導致肝內膽管小導管逐漸破壞，最終演變為肝纖維化。PBC 發病機制復雜，涉及遺傳、環境、自身免疫和其他因素，但機制尚未闡明。

ZHENG 等［3］首次分析 PBC患者血漿 circRNA 發現，與健康對照組相比，PBC 患者有22 種差異表達的circRNA，其中hsa_circ_402458 在候選生物標志物中表現出最大的PBC 表達差異和最高診斷價值。ceRNA 分析推測顯示，hsa_circ_402458 可能靶向hsa-miR-522-3p 和 hsa-miR-943。miR-522-3p 可能與炎癥異常消退有關，且可能是調節慢性炎癥性疾病的靶標，miR-522-3p可與SFRP2的3'-非翻譯區直接結合，該區域通常被認為是Wnt 信號的抑制劑［47］。另外，miR-943 通過 TGF-β 信號通路參與 DNA 雙鏈斷裂修復，但異常的TGF-β1 信號傳導在小鼠模型中促進 PBC 發展［48］。因此，假設 hsa_circ_402458 可能起miRNA 海綿作用，并通過影響炎癥相關信號通路參與PBC 發病，但這些miRNA-circRNA 軸在PBC發病機理中的潛在功能需進一步研究。

2.6 circRNA 與潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC） UC 是結腸慢性炎癥性疾病，通常表現為腹痛、腹瀉及便血，童年即可發病，成年達高峰［49］。排除傳染性病因，貧血和紅細胞沉降率或C 反應蛋白水平升高即可提示為UC，但目前實驗室指標未發生變化并不能排除為UC。

采用微陣列檢測技術比較分析活動性UC 患者病變部位腸黏膜細胞與非病變黏膜細胞發現，病變黏膜有264 種顯著失調的circRNA 和1 869 種差異表達 mRNA，其中 hsa_circ_0004662 和 hsa_circ_0007919 在UC 組織中變化最為顯著，hsa_circ_0007919 在炎癥治療后持續減少，并與Mayo 內鏡下評分和緊密連接分子表達密切相關［50］。miR-138 在UC 炎癥性黏膜中明顯增強，由于miR-138 可干擾VIPR1 mRNA，抑制其合成，但VIPR1 缺失加速UC炎癥進展［51-52］。hsa-miR-301a 在 UC 中表達上調，并通過降低BTG1 水平破壞上皮完整性［53］。炎癥細胞因子IL-22 誘導的腸上皮細胞（IECs）炎癥中，lncRNA H19 抑制let-7 表達，促進上皮細胞增殖和再生［54］。circRNA-miRNA-mRNA 網絡顯示，hsa-circ-0007919 可與 hsa-miR-301a、hsa-miR-138、hsa-miR-20b 和 hsa_let_7a 結合，因此，調節 hsa_circ_0007919表達可能有助于腸道屏障恢復，并可作為UC 治療的新方法。

2.7 circRNA 與特發性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN） IMN是一種獨特的腎小球病變，是成人腎病綜合征的最常見病因。多數IMN 患者均具有針對足細胞膜抗原PLA2R 的循環IgG4 自身抗體（70%），盡管血清PLA2R 抗體水平（15%）或近期抗THSD7A（3%~5%）為陰性，但活檢PLA2R染色陽性時，仍具有近期免疫學活性，但剩下的10%患者無可證實的抗PLA2R/THSd7A 抗體或抗原，因此，急需尋找潛在的診斷標志物［55］。

外泌體具有雙層質膜結構，并攜帶豐富蛋白、mRNA 和miRNA，可由樹突狀細胞、腫瘤細胞及其他細胞釋放至細胞外微環境［56］。研究表明，外泌體在急性腎損傷、糖尿病腎病、腎小管酸中毒、多囊腎等腎臟疾病中發生特異性變化［57-60］。MA 等［61］首次將外泌體與circRNA 在IMN 中進行研究，發現IMN患者血清和尿液外泌體中circRNA 表達異常，這些差異表達的circRNA 主要為內含子衍生的circRNA，其相應基因可編碼部分小核仁RNA（snoRNA）。snoRNA 經進一步加工可形成較短的RNA 片段，具有類似miRNA 的功能，因此，snoRNA 可充當miRNA前體，在轉錄過程前及轉錄中修飾mRNA，并在mRNA 水平調節基因表達［62］。但疾病中差異表達的circRNA的特定機制和功能需進一步研究。

3 展望

越來越多證據表明，circRNA 是免疫細胞發育及多個免疫調節階段的重要參與者。與癌癥研究類似，circRNA 在免疫疾病中的研究需要檢測circ-RNA 表達，闡明差異表達circRNA 的功能及其潛在機制。分析circRNA 差異變化有助于探索circRNA調節免疫反應機制，有望成為新型生物標志物及治療靶點。由于circRNA 功能復雜，尤其circRNA 可能作為miRNA海綿調節多種生物學過程，包括DNA甲基化、免疫反應及炎癥反應，但目前在自身免疫性疾病中的研究并不充分，許多方面仍處于初級階段。因此，進一步研究circRNA 的分子形成機制、降解機制及參與疾病發生的詳細機制具有重要價值。