環(huán)狀RNA與非酒精性脂肪肝疾病的研究進展

宋子羽，秦 虹，鄭溫雅

(中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，湖南 長沙 410078)

非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的患病率在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都逐年增加，與肝臟相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率也較高，且其患者更易患有肥胖、糖尿病、心血管疾病等代謝性疾病，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前減肥和改善胰島素抵抗是治療NAFLD的關(guān)鍵步驟，生活方式改變和飲食干預(yù)通常依從性較差，然而現(xiàn)有的藥物治療效果不明顯且副作用較大，總的來說NAFLD至今尚缺乏有效的治療方式，尋找新的治療思路是十分有必要的。在過去的幾年中高通量技術(shù)不斷發(fā)展，許多研究集中在對NAFLD發(fā)病機制的表觀遺傳方面，提示非編碼RNA在肝臟代謝中起重要作用，其中環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)的研究取得了新的突破，被認(rèn)為可能與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。本文整理了circRNA與NAFLD進展中關(guān)鍵機制肝臟脂質(zhì)蓄積、胰島素抵抗和星狀細(xì)胞活化的相關(guān)研究，為以靶向circRNA作為NAFLD診斷治療的分子標(biāo)記物及藥物研發(fā)潛在靶點提供了新的思路。

1 NAFLD的現(xiàn)狀及主要發(fā)病機制

NAFLD包括一系列連續(xù)進展的肝病，其中，疾病早期一般表現(xiàn)為單純的肝脂肪變性，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)被認(rèn)為是更嚴(yán)重的炎癥和肝細(xì)胞損傷過程，可能進展為肝硬化甚至肝癌[1]。據(jù)估計，NAFLD在中國大陸的患病率接近30%，在世界范圍內(nèi)其患病率也在逐年增加[2]。Estes等[3]采用馬爾可夫模型預(yù)計，2016-2030年，中國患病率的相對增幅可達(dá)22.2%，因此，根據(jù)NAFLD的發(fā)病機制找到其有效診斷及藥物治療的靶點對提升人們健康水平至關(guān)重要。

NAFLD的發(fā)病機制十分復(fù)雜，其機制尚未完全明確，目前已經(jīng)提出的幾種中最為經(jīng)典的是“二次打擊”理論。該理論認(rèn)為單純性脂肪肝的主要發(fā)病機制包括肝臟中脂質(zhì)蓄積和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[4]。此外，NAFLD的進展與肝臟纖維化程度有關(guān)，肝臟星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化可促進細(xì)胞外基質(zhì)中膠原沉積，造成NASH的持續(xù)惡化，逐漸進展為肝硬化，甚至肝癌[5]。因此，在進行NAFLD的藥物治療中，以減少肝臟脂質(zhì)蓄積、改善胰島素敏感性以及減少肝臟星狀細(xì)胞激活為主要目的，本文總結(jié)相關(guān)資料，主要從這幾方面進行綜述。

2 CircRNA的形成及生物學(xué)功能

CircRNA是一種通過反向剪接過程形成的具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，沒有5’端、3’端和多聚腺苷酸尾，已發(fā)現(xiàn)circRNA在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)豐富，具有高度保守、穩(wěn)定、組織特異性等特點，并具有一定的生物學(xué)功能，逐漸成為非編碼RNA領(lǐng)域的重要研究方向[6]。CircRNA根據(jù)基因組位置可分為3大類：(1)外顯子circRNA(circular exonic RNA，ecircRNA)；(2)內(nèi)含子circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)；(3)外顯子-內(nèi)含子circRNA(exon-intron circular RNA，EIciRNA)[7]。不同的circRNA形成方式導(dǎo)致其在細(xì)胞中發(fā)揮作用的方式也不同。ciRNA和EIciRNA更加穩(wěn)定，可正向調(diào)控核中RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄，EcircRNA可通過一些其他方式參與功能調(diào)控，例如與蛋白質(zhì)結(jié)合，少數(shù)ecircRNA也具有翻譯潛力[7]。此外，EcircRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)結(jié)合微小RNA(microRNA，miRNA)，從而間接調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，這種競爭性結(jié)合miRNA的作用也被叫做miRNA海綿作用(microRNA sponges)，該作用是目前發(fā)現(xiàn)最多的circRNA參與疾病進程的作用[8]。

迄今為止，circRNA已被證明與衰老、癌癥以及多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種疾病中可作為生物標(biāo)記物進行疾病的診斷。已有研究發(fā)現(xiàn)circRNA在外泌體中含量豐富，對RNA核酸外切酶具有抗性，可通過血液、尿液等體液收集，在結(jié)腸癌、乳腺癌等多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)可作為新型的非入侵型分子標(biāo)記物。如Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005397在肝細(xì)胞癌患者血液中過表達(dá)，且敏感性高于常用的血清篩查指標(biāo)甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)和AFP-L3，其高水平表達(dá)還與患者腫瘤大小和TNM分期密切相關(guān)，提示將其與傳統(tǒng)指標(biāo)結(jié)合可能有助于臨床診斷并預(yù)測惡性程度。CircRNA較線性RNA更保守穩(wěn)定，并參與調(diào)節(jié)糖脂代謝穩(wěn)態(tài)，如Stoll等[10]發(fā)現(xiàn)ciRS-7可促進胰島素的分泌且在人胰島中表達(dá)較高，因此CircRNA在代謝相關(guān)疾病中同樣擁有作為分子標(biāo)記物的潛力，其生物學(xué)功能也提示可作為藥物治療的潛在靶點。

目前越來越多的研究也發(fā)現(xiàn)circRNA在肝臟疾病中表達(dá)失調(diào)，其對NAFLD、病毒性肝炎、肝癌等肝臟疾病的調(diào)節(jié)作用已受到了一定的關(guān)注[7]。如Guo等[11]對NAFLD小鼠模型進行了肝臟組織的芯片測序，構(gòu)建了差異性表達(dá)的circRNA及與其相互作用的miRNA網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)有一些miRNA可以與兩個circRNA相互作用從而橋接這兩個circRNA，這些miRNA中miR-27a，miR-27b，miR-29b和let-7d與NAFLD相關(guān)，表明差異表達(dá)的circRNA可以通過與這些miRNA競爭性相互作用來調(diào)節(jié)疾病相關(guān)途徑。Jin等[12]利用NASH小鼠模型也構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，揭示了circRNA及該網(wǎng)絡(luò)可作為NASH中的調(diào)控途徑，實現(xiàn)circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的級聯(lián)擴增作用，為NASH的發(fā)病機理和通過circRNA靶向藥物的診斷治療提供了新的線索。

3 CircRNA與NAFLD的發(fā)病機制

3.1 CircRNA對肝臟脂質(zhì)蓄積的影響以甘油三酯為儲存形式的肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積是NAFLD的主要特征，肝臟中脂肪酸β氧化和脂質(zhì)合成的脂代謝調(diào)節(jié)影響著肝臟中脂質(zhì)蓄積[13]。對NAFLD動物模型進行circRNA的基因表達(dá)譜分析表明，有許多circRNA參與了該過程。

3.1.1CircRNA調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸β氧化 脂肪酸β氧化是肝臟脂代謝中的重要內(nèi)容，可改善肝脂肪變性。Guo等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，154個circRNA在脂肪變性的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)是正常細(xì)胞的2倍以上，203個水平顯著降低，其中circRNA_021412在游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)誘導(dǎo)的高脂刺激下明顯表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)抑制了脂肪酸β氧化。circRNA_021412發(fā)揮作用的機制為首先通過減弱對miR-1972的競爭抑制作用使該miRNA表達(dá)水平增高，miR-1972進而抑制脂蛋白1(lipin 1，LPIN1)的轉(zhuǎn)錄翻譯，LPIN1的靶基因中長鏈酰基輔酶A合成酶占主導(dǎo)地位，使LPIN1能夠選擇性地激活脂肪酸氧化和線粒體氧化磷酸化，當(dāng)LPIN1下調(diào)時脂肪酸β氧化受到抑制。

該團隊的研究還發(fā)現(xiàn)circRNA_0046366表達(dá)與HepG2細(xì)胞中TG水平呈負(fù)相關(guān)。circRNA_0046366通過與miR-34a靶向互補結(jié)合拮抗其表達(dá)，miR-34a可通過其高親和靶標(biāo)過氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α，PPAR α)轉(zhuǎn)錄調(diào)控多個脂質(zhì)代謝基因，尤其是脂質(zhì)氧化相關(guān)如肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1等，因此circRNA_0046366的缺失通過影響脂肪酸β氧化導(dǎo)致了肝細(xì)胞脂代謝失衡[15]。此外，circRNA_0046367也同樣靶向miR-34a，在脂肪變性的HepG2細(xì)胞中恢復(fù)circRNA_0046367的表達(dá)可消除miR-34a對PPAR α的抑制作用[16]。可見circRNA_0046366和circRNA_0046367可通過miR-34a/PPAR α這一調(diào)節(jié)系統(tǒng)改善脂肪酸β氧化。

3.1.2CircRNA調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)合成 Yuan等[17]采用高脂飲食(high fat diet，HFD)誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型進行circRNA的測序，發(fā)現(xiàn)有93個circRNA失調(diào)，其中57個上調(diào)，36個下調(diào)，GO分析差異性表達(dá)最為顯著的生物學(xué)過程為脂肪酸代謝過程，KEGG途徑分析則表明基因參與的信號傳導(dǎo)途徑主要有環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)信號通路，cAMP在NAFLD的脂肪變性的減輕中起積極作用，其中circRNA chr3_145845704_145853276_ +和chr3_109562742_109578364_ +的靶miRNA可能被抑制以調(diào)節(jié)二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，DDAH1)的表達(dá)，DDAH1是一種降解不對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)的酶，ADMA-DDAH1途徑對HFD誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)合成有顯著影響，DDAH1可能通過減少ADMA積累來改善NAFLD。此外，該研究中還發(fā)現(xiàn)circRNA_0049392的靶miRNA miR-7037-5p和miR-6919-5p，已被證實是低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的受體，LDL受體(LDL receptor，LDLR)介導(dǎo)LDL被細(xì)胞內(nèi)吞降解，HFD喂養(yǎng)的LDLR敲除小鼠甘油三酯積累減少[17]。在Guo等[14]關(guān)于脂肪變性細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)的circRNA_021412/miR-1972/LPIN1的級聯(lián)反應(yīng)涉及的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1/膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1信號通路與脂質(zhì)合成密切相關(guān)，而circRNA_0046366、circRNA_0046367/miR-34a/PPAR α涉及脂質(zhì)合成相關(guān)基因硬脂酰輔酶A去飽和酶1[15-16]，這些circRNA的上調(diào)均通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成相關(guān)信號改善肝脂質(zhì)蓄積。

3.1.3CircRNA通過其他途徑調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)蓄積 生長激素信號傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激也能對肝脂質(zhì)蓄積造成影響。Li等[18]采用circRNA基因芯片鑒定出與NAFLD相關(guān)的差異表達(dá)的circRNA之一circScd1，其表達(dá)水平的降低會加重NAFLD的脂質(zhì)蓄積，在小鼠肝細(xì)胞AML-12中敲低circScd1表達(dá)時非受體型酪氨酸蛋白激酶2(janus kinase 2，JAK2)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activators of transcription 5，STAT5)的表達(dá)下降，肝細(xì)胞中STAT5的失活可使生長激素信號傳導(dǎo)被阻斷，誘發(fā)脂肪肝[19]，因此，circScd1對細(xì)胞TG水平的降低作用可能是通過JAK2/STAT5影響生長激素傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)的，但circScd1是通過miRNA海綿作用還是直接與相應(yīng)蛋白結(jié)合的方式調(diào)控該途徑的還不清楚。

Yang等[20]發(fā)現(xiàn)在油酸/棕櫚酸酯處理的HepG2細(xì)胞中circ_0048179的表達(dá)水平降低，其通過作為miR-188-3p海綿上調(diào)了抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶4的水平，減少活性氧的產(chǎn)生，并減輕線粒體損傷，脂質(zhì)過氧化的改善也有益于減輕NAFLD中的脂質(zhì)蓄積。

上述研究表明，circRNA有望作為減少NAFLD肝臟脂質(zhì)蓄積的新藥物靶點，對相應(yīng)circRNA的調(diào)節(jié)可從促進肝臟脂肪酸β氧化，抑制脂質(zhì)合成，改善氧化應(yīng)激等多個角度對NAFLD起到改善和治療的效果。

3.2 CircRNA調(diào)節(jié)胰島素抵抗在脂肪組織中胰島素可降低激素敏感脂肪酶的活性，隨著脂肪細(xì)胞中IR的發(fā)展，高胰島素血癥激活了脂肪細(xì)胞表面的脂蛋白脂肪酶，可水解脂蛋白甘油三酯，釋放出FFA，較高水平的FFA即離開脂肪細(xì)胞進入循環(huán)系統(tǒng)并被肝臟等其他器官吸收，因此IR可導(dǎo)致肝臟中脂質(zhì)沉積，在NAFLD的發(fā)病機制和疾病進程中起著至關(guān)重要的作用[21-22]。

Stoll等[10]發(fā)現(xiàn)，circHIPK3在胰腺胰島中表達(dá)豐富，其沉默可導(dǎo)致葡萄糖刺激下胰島素分泌能力降低，微陣列數(shù)據(jù)分析和miRNA靶標(biāo)富集分析發(fā)現(xiàn)，circHIPK3沉默時觀察到的基因表達(dá)變化至少可以部分地通過包括miR-124-3p和miR-338-3p在內(nèi)的miRNA來介導(dǎo)。而Cai等[23]針對circHIPK3的研究則進一步發(fā)現(xiàn)，circHIPK3顯著降低了HepG2細(xì)胞miR-192-5p miRNA水平，叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)OXO1)是miR-192-5p的下游調(diào)節(jié)子，抗miR-192-5p顯著增加了血糖含量，而采用FOXO1shRNA干擾FOXO1基因表達(dá)則抑制了血糖含量，因此circHIPK3通過充當(dāng)miR-192-5p海綿并上調(diào)FOXO1導(dǎo)致高血糖和IR，抑制其表達(dá)可能起到改善作用。

已有研究提示部分circRNA的表達(dá)上調(diào)有助于改善IR。例如Ou等[24]采用MCD誘導(dǎo)NASH小鼠模型，發(fā)現(xiàn)circRNA_29981作為 miR-181b海綿可靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白1抗原(sirtuin 1，SIRT1)，肝細(xì)胞中SIRT1的激活有助于減輕HFD引起的葡萄糖不耐受。這些研究表明，以抑制或過表達(dá)相應(yīng)circRNA發(fā)揮對IR的改善作用的藥物靶點可能有助于緩解NAFLD，為延緩疾病的進展提供了新的方向。

3.3 CircRNA調(diào)節(jié)肝臟星狀細(xì)胞活化肝臟纖維化是NASH向肝硬化乃至肝癌進展過程中常見的病理過程，HSC是參與肝臟纖維化的主要細(xì)胞類型，其活化是肝臟纖維化進程中的關(guān)鍵事件，circRNA對HSC活化的調(diào)節(jié)作用可能與NASH的進展有關(guān)。

一些circRNA被發(fā)現(xiàn)可刺激HSC活化促進肝纖維化發(fā)生。Zhou等[25]發(fā)現(xiàn)在肝纖維化小鼠模型中，肝臟組織circRNA的表達(dá)譜發(fā)生了改變，生物信息學(xué)分析預(yù)測其中circ_34116/miR-22-3p/骨形態(tài)發(fā)生蛋白7信號軸可能與HSC的激活有關(guān)。circPWWP2A在小鼠纖維化肝組織中以及轉(zhuǎn)化生長因子β和脂多糖激活的HSC中均上調(diào)，可通過競爭性結(jié)合miR-203和miR-223并隨后分別增加卵泡抑素樣蛋白1和Toll樣受體4的表達(dá)來促進HSC活化和增殖，下調(diào)circ-PWWP2A可以減輕體內(nèi)肝纖維化[26]。circRNA-0067835在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中表達(dá)也明顯增加，生信分析預(yù)測其可作為miR-155海綿調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在人肝星狀細(xì)胞LX2中敲除circRNA-0067835可促進miR-155的表達(dá)和雙熒光素酶報告基因檢測也說明了這一作用，miR-155可抑制蛋白激酶B/FOXO3a信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)肝纖維化，可見circRNA-0067835對肝纖維化的促進作用與miR-155/FOXO3a有關(guān)[27]。在肝臟中靶向抑制這些circRNA的表達(dá)可能對治療肝纖維化有益。

此外，也發(fā)現(xiàn)有circRNA可通過抑制星狀細(xì)胞的活化來改善肝纖維化。CircFBXW4被發(fā)現(xiàn)在小鼠肝纖維化中被下調(diào)，其抑制LX2細(xì)胞的活化和增殖，通過作為miR-18b-3p海綿上調(diào)含F(xiàn)-框WD重復(fù)域蛋白7的表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化的作用[28]。circ_0070963在肝纖維化過程中被下調(diào)，可通過與miR-223-3p競爭性結(jié)合的方式調(diào)節(jié)下游含LEM域3 mRNA表達(dá)[29]，因此這些circRNA可考慮作為肝纖維化的潛在藥物抑制劑的靶點。

4 CircRNA在NAFLD患者肝臟中的異常表達(dá)

目前circRNA調(diào)控與NAFLD發(fā)展之間的研究，大多數(shù)基于動物和細(xì)胞模型，它們與人circRNA的序列具有一定的同源性，但對人NAFLD表達(dá)譜的分析仍然相對欠缺。Li等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，具有肝脂肪變性的NAFLD患者較無脂肪變性的對照組相比，肝circRNA_0046367水平顯著下調(diào)，與前文所述細(xì)胞實驗結(jié)果一致。Zhao等[30]針對NASH肝硬化患者和非NAFLD患者肝臟樣本分離出的原代成纖維細(xì)胞的circRNA表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者的肝circRNA SCAR表達(dá)較非NAFLD患者顯著降低，并與胞質(zhì)活性氧水平和纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。上述研究提示在人體內(nèi)差異性表達(dá)的功能性circRNA可考慮作為NAFLD的藥物靶點，然而其存在樣本來源單一，數(shù)量較少的問題，且未探討相應(yīng)circRNA在血液等體液中的表達(dá)變化，能否作為可靠的分子標(biāo)記物或有效的治療靶標(biāo)仍需要來自更多不同地區(qū)的病例對照研究及臨床驗證。

5 小結(jié)

目前許多對NAFLD的動物或細(xì)胞模型及NAFLD患者肝組織的高通量測序分析均發(fā)現(xiàn)有多個circRNA表達(dá)異常，生信分析和RT-PCR等實驗驗證也發(fā)現(xiàn)，circRNA主要通過miRNA海綿作用調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因，影響肝臟脂肪酸β氧化、脂質(zhì)合成、IR及HSC活化，以上研究表明circRNAs參與了NAFLD的發(fā)生和發(fā)展，并有望成為診斷和治療中新的分子標(biāo)記物和潛在藥物靶點，相關(guān)研究歸納見Tab 1，為開發(fā)新的診斷治療方式提供了思路。目前circRNA在肝臟疾病上的研究仍處在起步階段，主要集中在病毒性肝炎和肝癌方面，針對NAFLD的研究十分有限，建立更多的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)可能有助于對調(diào)節(jié)相似功能的信號通路的circRNA進行歸類；且在體內(nèi)外實驗中得到證實的軸較少，尚缺乏流行病學(xué)研究。此外，circRNA發(fā)揮的miRNA海綿作用是否對NAFLD具有有效的功能性作用，是否可通過其他方式發(fā)揮在NAFLD中的作用尚不清楚，仍需要更深入的研究。