嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）在疾病治療中的研究進展

孫 強 金宇亭 黃 晶

（吉林大學第一醫院，長春130000）

嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法自產生以來，在臨床治療中發揮重要作用，尤其對血液系統腫瘤及實體瘤來說是一種有效的治療手段［1-2］。目前利用CAR-T 技術治療的血液系統腫瘤包括急性髓系白血病、急性淋巴系白血病、慢性髓系白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤等，并且在治療肝癌、前列腺癌等實體瘤中也具有一定的效果［3-5］。近年來，CAR-T 細胞免疫療法在治療自身免疫疾病、心臟病等方面也初見成效。該技術不僅明顯改善了患者的預后，而且還極大地提高了患者的生活質量，為更多的患者帶來福音［6］。

1 CAR-T生物學特征

1.1 CAR-T 結構 CAR-T 是由單克隆抗體的單鏈可變區（single chain variable region，scFv）和T 細胞信號傳導區連接而成，針對不同的腫瘤細胞抗原構建不同的單克隆抗體代替T細胞受體（T cell receptor，TCR）中的互補決定區，避免主要組織相容性復合體（MHC）限制性，CAR 中scFv 通過特異性識別腫瘤特異性抗原直接將信號傳到T 細胞內，使T 細胞活化，分泌細胞因子，殺滅腫瘤細胞［7］。與TCR 相比，CAR抗體能夠識別更廣泛的相應的腫瘤細胞抗原，以MHC 非限制性方式使T 細胞活化，進而發揮高效性和特異性的抗腫瘤效應［8-9］。

CAR 作為CAR-T 的核心，其結構主要由胞外區、鉸鏈區、跨膜區和胞內區四部分組成［10］。胞外區通常由針對腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）的單克隆抗體的輕鏈及重鏈連接而成［11］。鉸鏈區針對不同腫瘤相關抗原需要調整鉸鏈區長度，以便更好地發揮靶向結合能力，因此鉸鏈區對于腫瘤相關抗原的識別很重要。跨膜區常由CD3、CD8、CD28 的跨膜區構建，在T 細胞活化中發揮重要作用。胞內信號區主要由如CD28、CD134、CD137 等組成。CAR 大體結構由膜外段和膜內段組成，膜外段主要是抗原來源的抗原結合的單克隆抗體可變區，膜外段由刺激結構域和共刺激結構域組成［12］。目標靶抗原的選擇對于CAR 的特異性是關鍵性因素，隨著CAR-T 的廣泛應用，其演化過程也不斷優化。

1.2 CAR-T 分類 CAR-T 根據CAR 胞內區組成的不同，可將其分為四代：①第一代：胞內只有1 個激活結構域，即免疫受體酪氨酸活化基序（immune receptor tyrosine activated motif，ITAM），ITAM 活化后可激活下游序列，分泌低水平的細胞因子，產生較低的抗腫瘤作用，為了克服這一不足之處，產生了第二代CAR-T［13］。②第二代：胞內有1 個激活結構域和一個共刺激結構域，即在第一代的基礎上加入了CD28共刺激結構域，產生更強的刺激信號活化T細胞，大量的細胞因子產生，提高了T細胞的細胞毒性，從而加強抗腫瘤作用［14-15］。與第一代CAR-T 相比，第二代CAR-T 能夠增加對腫瘤細胞裂解的記憶效應以及CAR-T 介導的殺傷效應［16］。為了進一步提高T細胞的細胞毒性、增殖活性和存活時間，產生更強的免疫應答反應，第三代CAR-T 應運而生。③第三代：有1 個激活結構域和2 個共刺激結構域，即在第二代的基礎上加入了CD137 共刺激結構域，活化T 細胞產生更多的細胞因子，發揮更強更持久的抗腫瘤效應［17-18］。④第四代：又稱TRUCK T 細胞（T-cell redirected for universal cytokine killing，TRUCK），在第二代的基礎上添加IL-12，含有1個活化T 細胞核因子（nuclear factor of the activated T cell，NFAT）轉錄相應元件，使CAR-T 在腫瘤區域分泌IL-12，從而調節腫瘤微環境，募集并活化其他免疫細胞進行免疫殺傷［19］。

1.3 CAR-T 技術原理 CAR-T 免疫療法是一種治療腫瘤的新型精準靶向療法。CAR-T 將抗原抗體的特異性和T 細胞的高效殺傷作用結合，針對不同的腫瘤特異性抗原、腫瘤相關性抗原以及腫瘤基質細胞表面特異抗原，采用基因工程改造患者的T 細胞，通過基于熒光素酶的TOPANGA 試劑對CAR 的表達進行分離檢測，在體外大量培養生成特異性CAR-T，然后回輸到患者體內，以達到殺滅腫瘤細胞的作用，最終達到治愈的目的［20-24］。近年來，CAR-T免疫療法除在治療急性白血病和非霍奇金淋巴瘤方面取得關鍵性突破外，也被用來治療實體瘤、自身免疫病和心臟病等疾病，具有更廣闊的應用空間，是現代醫學發展的重要里程碑。

2 CAR-T的臨床應用

2.1 CAR-T治療血液系統腫瘤

2.1.1 白血病 白血病是一種起源于造血干細胞的高度異質性的造血系統惡性腫瘤。根據FAB（法-美-英）協作組將白血病分為急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL），在人體造血過程中，各分化發育階段的B 淋巴細胞均表達特異性的分化抗原，如CD19、CD20 等，而且針對這些抗原分子的單抗本身也具有顯著的抗腫瘤作用，并已在臨床得到證實且廣泛應用［25-26］。體外構建CD19-CAR-T 對于ALL 已經取得較好的療效。一些研究表明CD33、CD123 等AML 分化抗原作為CAR-T 作用靶點，構建CAR-T將有望治愈AML［27］。

2.1.2 其他血液系統腫瘤 研究發現第三代CD19-CAR-T 治愈非霍奇金淋巴瘤已取得進展［28］。針對多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的潛在靶點有CD138、CD38、CD56，報道稱，靶向B 細胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）的CAR-T用于治療MM，并證實了CAR-T 對MM 細胞有較強的細胞毒性［29］。 同時，一些新的靶點如CD38、CD319（SLAMF7），已進入臨床研究階段，為治愈其他B細胞腫瘤帶來了福音［30］。

2.2 CAR-T治療實體腫瘤

2.2.1 肝癌 乙型肝炎病毒感染者更易發生肝硬化和肝癌，清除HBV 才能有效阻止肝癌的發生。HBV復制以共價的閉環結構的DNA為模板，因此構建具有共價環狀DNA 的CAR-T，DNA 特異性的CAR-T 可定位病毒感染的肝臟部位，特異性識別殺滅HBV 復制，從而發揮強烈的抗腫瘤效應［31］。此外，研究發現，甲胎蛋白（alpha-fetal protein，AFP）作為肝癌的特異性標志物，構建AFP-CAR-T 可有效進行抗腫瘤反應，為肝癌免疫治療提供新途徑［32］。

2.2.2 前列腺癌 前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是一種由前列腺上皮細胞分泌的蛋白酶，是診斷前列腺癌的特異性腫瘤標志物，據此構建抗PSA-CAR-T，特異性識別并殺傷表達PSA的腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞的生長［33］。

2.2.3 卵巢癌 葉酸受體（folate receptor，FR）在卵巢癌中異常表達，但在正常組織中很少表達，因此靶向FR 的CAR-T，其產生細胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-4 和TNF-α 等，從而進一步增加CAR-T 對卵巢癌細胞的識別，卵巢癌細胞可被特異性溶解［34-35］。糖蛋白抗原CA125，又稱MUC16，是診斷早期卵巢癌的重要指標，目前針對該靶抗原的CAR-T 的研究已初見成效［36］。研究表明，將靶向卵巢癌腫瘤抗原受體酪氨酸激酶樣孤兒受體-1（the receptor tyrosine kinase-like orphan receptors-1，ROR1）的CAR-T 包埋于鎳鈦薄膜中可阻止腫瘤生長，此方法還需更多的臨床驗證［37］。

2.3 CAR-T 治療其他疾病 CAR-T 免疫療法可以治療自身免疫性疾病方面的研究已有報道，研究發現，經過基因修飾表達靶向CD19 的CAR-T 可以殺死狼瘡小鼠模型中的B 細胞，這種療法可以根除B細胞產生的自身抗體并延長生命［38］。此外，有報道稱，CAR-T 可以靶向移除促進心肌纖維化的活化的成纖維細胞，顯著降低心肌纖維化并恢復心臟功能［39］。

3 CAR-T存在的問題及展望

綜上所述，CAR-T對治愈CD19表達陽性的B細胞系血液腫瘤具有較好的療效，為治療腫瘤開辟新篇章。但CAR-T 免疫療法亦有不足之處，由于某些特定的靶抗原在正常組織細胞存在，受到CAR-T 的攻擊導致損傷的脫靶效應。此外，輸入的CAR-T 殺滅腫瘤細胞時，釋放大量的細胞因子造成細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），同時，被殺傷的腫瘤細胞會釋放大量細胞因子造成腫瘤溶解綜合征［40-41］。由于實體瘤存在包膜，T細胞殺傷作用釋放的細胞因子難以進入細胞，治療效果還不夠成熟，因而，調節腫瘤微環境成為研究熱點。報道稱將CAR-T 和PD-1 聯合可以有效克服治療實體瘤的困難［42-43］。研究發現，基于納米抗體的CAR-T可殺死黑色素腫瘤細胞，顯著減緩腫瘤生長［44］。CAR-T 在對抗實體瘤細胞時存在T 細胞衰竭現象，為克服此現象，研究發現Nr4a 轉錄因子蛋白在調節T 細胞衰竭方面起著突出作用，動物實驗發現，利用缺乏Nr4a 轉錄因子的CAR-T 治療小鼠的腫瘤體積明顯減小，生存率明顯提高［45］。

總之，CAR-T 能精準地殺傷靶細胞，具有多靶向殺傷，殺傷范圍廣，效果更持久等特點。然而，仍有許多挑戰需要考慮。隨著CAR 技術基礎和臨床研究的深入，CAR-T 免疫療法在治療疾病研究領域仍具有很大的潛在價值。