金黃色葡萄球菌的免疫逃逸策略①

楊思宇 范釗瑋 李皖豫 崔玉東（黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶163319）

金黃色葡萄球菌（S.aureus）是一種重要的條件性致病菌，定殖于約30%健康人群上呼吸道［1］。S.aureus可引發皮膚和軟組織感染，包括毛囊炎、膿皰瘡及燙傷皮膚綜合征等，還可引發菌血癥、心內膜炎（IE）、骨關節炎、中毒性休克綜合征（TSS）等［2］。抗生素臨床應用前，S.aureus引發的菌血癥患者死亡率超過80%，青霉素的使用大大降低了感染死亡率，但耐藥菌株也隨之出現［3］。1959年首次采用改進的β-內酰胺類抗生素——甲氧西林進行治療以來，關于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株的報道不斷增多。醫院相關MRSA（HA-MRSA）是目前各國醫院感染的主要原因，過去幾十年，社區相關MRSA（CA-MRSA）備受關注［4］。萬古霉素是目前CA-MRSA和HA-MRSA嚴重感染的一線治療藥物，但其耐藥菌株越來越多［5-6］。因此，預防和治療S.aureus感染的疫苗研究成為熱點。S.aureus毒力因子繁多，致病機理復雜，尚未獲得有效的、可用于臨床的S.aureus疫苗。因此，了解S.aureus免疫逃逸策略有助于開發基于免疫輔助療法和安全有效的疫苗。

1 S.aureus可逃避抗菌肽

機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線是宿主屏障結構，如皮膚、呼吸道黏膜和腸道黏膜等。這些組織中含有高濃度抗菌肽（AMPs）和酶，可殺死或抑制入侵微生物。α-defensins是一種帶有疏水區域的陽離子小分子肽，是針對S.aureus的主要抗菌肽，由中性粒細胞大量產生，占中性粒細胞顆粒蛋白的50%，可被分泌至周圍環境或與成熟吞噬體融合殺滅細菌［7］。但S.aureus可利用毒力因子靶向作用于皮膚和黏膜屏障處的α-defensins，如葡激酶（staphylokinase，SAK）是S.aureus產生的一種胞外蛋白，可直接結合和殺滅α-defensins［8］。Cathelicidins是一種具有保守的N端cathelin域和可變的C端AMP域的抗菌肽，具有抗S.aureus活性，與α-defen?sins共同存在于中性粒細胞顆粒蛋白［9］。但S.aureus溶血素和V8蛋白酶可靶向裂解Cathelicidins家族的LL-37使其失活［10］。破壞LL-37是S.aureus引發皮膚感染的重要環節，如過敏性皮膚炎患者LL-37水平下調，更容易感染S.aureus［11］。Lysozyme是一種在黏液分泌物中發現的溶菌酶，存在于眼淚、鼻涕、唾液、汗水和血清，通過攻擊細胞壁肽聚糖殺滅細菌。S.aureus對抗溶菌酶的方式是利用O-乙酰基轉移酶（OatA）將胞壁肽聚糖中的胞壁酸殘基乙酰化，在細胞壁和酶活性位點間產生空間位阻進而抑制溶菌酶活性［12］。

2 S.aureus可逃避補體系統

逃避上皮屏障處抗菌肽殺傷后，S.aureus必須與補體系統抗衡［13］。補體系統是由30余種可溶性蛋白、膜結合性蛋白和補體受體組成的多分子系統，“補充”機體免疫應答。病原感染期，補體具有3個主要功能：調節細菌表面以增強吞噬作用、產生炎癥信號招募吞噬細胞、通過形成膜攻擊復合物（MAC）破壞病原體。補體具有3種激活途徑：經典激活途徑、MBL激活途徑和旁路激活途徑，3種途徑以不同方式激活，均通過C3轉化酶裂解C3，形成C3a和C3b 2個片段，C3a是一種有效的趨化物，而C3b則通過與病原體表面共價結合并與其他補體成分形成蛋白水解復合物，通過裂解更多C3并在細胞表面沉積更多C3b放大級聯反應。補體系統對正常免疫功能至關重要，因此，逃避補體是多種致病菌的優先策略［14］。

葡萄球菌蛋白A（SpA）是S.aureus最具特征性的毒力因子之一，除可被分泌至周圍環境外，還可與細胞壁結合。SpA有5個免疫球蛋白結合結構域，可與免疫球蛋白Fc段高親和力結合，通過干擾經典補體激活途徑幫助S.aureus逃避宿主細胞吞噬作用，還可通過阻止C1q與細胞表面抗體-抗原復合物結合阻斷經典補體途徑激活［15］。免疫球蛋白第二結合蛋白（Sbi）是繼SpA后發現的第二種具有較強抗調理特性的毒力因子，可與脂磷壁酸結合而錨定于細胞膜，并與Fcγ段和C3結合，為S.aureus逃避吞噬作用提供保障［16］。葡萄球菌超抗原樣蛋白7（SSL7）也可靶向免疫球蛋白，與IgA1和IgA2結合，破壞IgA與細胞表面FcaRI相互作用，逃避FcaRI介導的吞噬作用。此外SSL7還可與C5結合阻止C5a產生和MAC形成［17］。葡激酶（SAK）除靶向抗菌肽外，還可裂解血液中的纖溶酶原為纖溶酶，降解IgG和C3b，有效破壞所有補體激活途徑［18］。細胞外纖維蛋白原結合蛋白（Efb）可與C3d結合，通過阻止C3裂解、C3b沉積和C3轉化酶形成阻斷所有補體激活途徑，Efb與C3d結合還可阻止B細胞識別C3d片段，從而破壞適應性免疫應答［19］。細胞外補體結合蛋白（Ecb）可與C3b結合，在細胞表面通過與補體因子H（FH）和C3b形成復合物，利用FH的調節活性導致C3b失活，干擾旁路激活途徑［20］。Ecb也可干擾中性粒細胞通過補體受體1（CR1）識別C3b，破壞吞噬作用［21］。葡萄球菌趨化抑制蛋白（CHIPS）可有效干擾C5a和甲酰化肽，不僅可增強S.aureus的抗吞噬功能，還可干擾中性粒細胞遷移［22］。葡萄球菌補體抑制物（SCIN）是S.aureus靶向補體系統的最有效成分，可直接與C3轉化酶結合抑制所有補體激活途徑［23］。

3 S.aureus可逃避吞噬細胞

吞噬細胞吞噬入侵病原體后，通過次氯酸（HClO）和活性氧（ROS）等物質破壞被吞噬的病原體。模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）可識別病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），如酵母聚糖、脂多糖和肽聚糖等，觸發一系列信號分子，使吞噬細胞吞噬病原體，產生殺菌物質，并激活炎癥反應對抗入侵病原體［24］。巨噬細胞和中性粒細胞是先天免疫系統識別病原體后被募集至感染部位的主要吞噬細胞，是有效清除S.aureus所必需的細胞，但S.aureus通過直接攻擊吞噬細胞、調節識別信號產生、阻止趨化信號抵抗其吞噬能力。

感染期間，先天性免疫產生多種趨化因子，如CXCL1、CXCL2、CXCL7和CXCL8［25］。CXCR2是表達于中性粒細胞表面的主要趨化受體，可識別上述4種趨化因子。但S.aureus分泌的半胱氨酸蛋白酶A（ScpA）可破壞CXCR2受體，通過裂解CXCR2 N末端導致其無法發揮功能［26］。吞噬細胞還表達其他趨化受體，如C5a受體（C5aR1和C5L2）和甲酰肽受體（FPR1、FPR2和FPR3）。甲 酰 肽 樣 受 體-1（FPRL1）與FPR1密切相關，可與多種配體結合發揮作用，而FPRL1抑制蛋白（FLIPr）對FPRL1具有高親和力抑制作用，對FPR1和FPR2也具有一定抑制作用，但程度較輕。S.aureus可產生與FLIPr具有73%同源性的FLIPr樣（FLIPr-like）蛋白，也可抑制FPRL1、FPR1和FPR2，FLIPr和FLIPr-like蛋白孵育中性粒細胞導致FPR激動劑fMLF和MMK-1趨化活性完全喪失［27］。此外，FLIPr和FLIPr-like蛋白還可通過抑制Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類IgG受體（FcγR）破壞抗體介導的調理吞噬作用［28］。最近研究表明，葡萄球菌超抗原樣13（SSL13）可以人類特有方式靶向FPR2受體，證明S.aureus在感染過程中對甲酰基肽受體的廣泛靶向性［29］。TLR2可通過結合肽聚糖相關脂蛋白使吞噬細胞識別S.aureus，在抗S.aureus免疫中起關鍵作用；S.aureus通過葡萄球菌超抗原樣3（SSL3）靶向結合TLR2，抑制由TLR2介導的中性粒細胞殺傷功能［30］。除SSL3外，S.aureus還通過由酚溶性調節蛋白（PSMs）介導的脫落細菌脂蛋白間接作用于TLR2影響其功能［31］。吞噬細胞在從血液遷移至組織過程中，表達P-選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1），進而與選擇素結合并滾動黏附進入組織［25］。S.aureus通過分泌葡萄球菌腸毒素樣毒素X（SELX）與糖基化PSGL-1結合破壞遷移，阻止選擇識別和滾動黏附［32］。另一種毒力因子——葡萄球菌超抗原樣5（SSL5）以相同方式靶向結合PSGL-1干擾吞噬細胞募集。此外，SSL5還可與幾種重要的趨化受體N端結合，從而阻止C3a-、C5a-、CXCL1-和IL-8介導的吞噬細胞激活［33］。靶向AMPs和補體系統的幾種毒力因子（如SAK、CHIPS和SCIN）可通過使C3轉化酶失活而阻斷免疫球蛋白結合，并抑制趨化性受體信號傳導，從而干擾吞噬細胞募集和激活。吞噬細胞吞噬細菌后產生多種化合物破壞病原體，中性粒細胞絲氨酸蛋白酶（NSPs），包括彈性蛋白酶、組織蛋白酶G和蛋白酶3，在清除感染和控制炎癥中發揮重要作用。NSPs通過中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）在細胞外殺死細菌，或被釋放至細胞外環境直接殺死病原體、降解細菌毒力因子［34］。感染過程中，S.aureus通過產生3種細胞外黏附蛋白（Eap、EapH1和EapH2）非共價封閉催化裂隙并阻斷酶活性，Eap在納摩爾范圍內即可表現出抑制活性，并在體內促進S.aureus感染［35］。此外，S.aureus還可產生多種具有裂解活性的雙組分成孔毒素，這些毒素識別細胞表面趨化因子受體，一種成分與趨化因子受體結合，募集第二種成分，導致細胞膜形成孔道，致使細胞溶解損傷吞噬細胞功能［36］。如NK細胞作為固有免疫系統主要效應細胞之一，可快速識別并清除病原體，S.aureus可分泌LukED特異性識別CCR5以溶解NK細胞、樹突狀細胞（DC）等免疫細胞，破壞機體免疫應答［37］。

4 S.aureus可逃避適應性免疫應答

適應性免疫應答——體液免疫應答和細胞免疫應答是宿主抵御微生物入侵的重要武器。S.aureus逃避體液免疫應答的一個重要機制是通過SpA激活B細胞多克隆。SpA包含5個免疫球蛋白結合結構域，可結合IgG和IgM的Fcγ結構域及VH3家族的Fab部分，其中，SpA結合Fcγ主要阻止對S.aureus的調理吞噬作用，而結合Fab主要導致B細胞活化和克隆擴增。Fab結合可對B細胞產生超抗原作用，誘導人體內30%B細胞和小鼠體內約10%B細胞多克隆活化，從而限制宿主對其他S.aureus毒力因子的應答［38］。此外，研究表明，SpA與小鼠B細胞結合可導致B細胞受體及共受體CD19和CD21下調，抑制細胞增殖，導致細胞凋亡［39］。S.aureus還可作為兼性細胞內病原菌逃避體液免疫反應，如抵抗中性粒細胞的殺傷作用并在細胞內生長，或以小菌落變異體（SCVs）形式存在于上皮細胞，SCVs的持續存在使S.aureus引發促進疾病發生并反復感染宿主［40］。此外，對S.aureus產生的某些抗體反應可增強其毒性，如抗PVL抗體可增加小鼠皮膚膿腫及細菌負荷，抑制人中性粒細胞對S.aureus的殺傷作用［41］。

除干擾宿主抗體防御外，S.aureus還采用多種策略破壞T細胞防御。S.aureus可表達23種血清特異性超抗原（SAgs），如中毒性休克綜合征毒素1（TSST-1）、葡萄球菌腸毒素B（SEB）和葡萄球菌腸毒素C（SEC）等［42］。SAgs可避開常規MHC分子限制的抗原提呈，通過結合T細胞受體的特定Vβ鏈激活T細胞，釋放非特異性細胞因子，使免疫反應向Th1極化。SAgs刺激后，大量T細胞擴增導致IL-2局部消耗，從而抑制保護性T細胞應答［43］。此外，S.aureus肽聚糖（PGN）可下調SAgs誘導的趨化因子（如CX?CL10）表達，防止T細胞募集。S.aureus還可分泌1種MHCⅡ類分子模擬蛋白（Map），是一種可驅動T細胞向Th2表型分化、誘使T細胞溶解或凋亡的毒素［44］。調節性T細胞（Treg）是免疫系統改善感染引發過度炎癥相關損傷的重要機制，可預防自身免疫并對其他免疫細胞群體發揮有效抑制作用［45］。由于Treg的免疫抑制特性，多種病原體已進化出利用該細胞群體抑制保護性免疫應答的逃避策略［46］。如S.aureus的腸毒素A（SEA）可誘導FOXP3表達和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）表達，促使T細胞向Treg轉化以抑制保護性免疫應答［47］。酚溶性調節蛋白（PSMs）可DC TLR2配體識別能力，降低DC活化T細胞的能力，抑制Th1分化并特異性誘導Treg產生［48］。S.aureus還可破壞Th17細胞發育，而Th17細胞對人類抵抗S.aureus感染至關重要［49］。S.aureus可通過其細胞壁肽聚糖乙酰化抑制抗原呈遞細胞表達Th17-極化細胞因子，有效阻斷溶菌酶介導的肽聚糖降解和模式識別分子模式釋放，通過抑制Th17細胞記憶反應再次感染相同宿主［50-52］。

5 S.aureus毒素

S.aureus主要毒素可分為3類：成孔毒素（PFTs）、剝脫性毒素（ETs）和SAgs。成孔毒素可進一步分為4種類型：α-溶血素（Hla或α-毒素）、β-溶血素、白細胞毒素（leukotoxin）和酚溶性調節蛋白（PSMs）。Hla是一種對紅細胞具有高度向性的成孔毒素，可破壞細胞膜完整性，并與LukE、D和HlgAB相互作用為S.aureus提供宿主的血紅蛋白，促進其生長。Hla還可與金屬蛋白酶10（ADAM10）結合，裂解宿主內皮細胞和白細胞［53］。小鼠模型中，Hla可加重血管通透性和膿毒癥，這種通透性可能導致S.aureus從血液傳播至宿主組織。研究證明，Hla-ADAM10相互作用可在小鼠肥大細胞存在的情況下維持S.aureus存活，并破壞血小板功能和中性粒細胞信號［54-55］。β-溶血素對人角質形成細胞、多形核白細胞、單核細胞和T淋巴細胞具有細胞毒性，并抑制內皮細胞IL-8表達，有助于S.aureus逃逸和誘導生物被膜形成［56］。Leukotoxin由2種不同的蛋白組成，組裝形成β-桶孔。目前，已從與人類感染相關的S.aureus菌株中分離出4種雙組分白細胞毒素：殺白細胞毒素（PVL）、γ-溶血素（HlgA，HlgC，HlgB）、白細胞毒素ED（LukE、LukD）和白細胞毒素AB/GH（LukAB/LukGH）［57］。這些成孔毒素由分類為“S”和“F”的2種不同蛋白組成，S-組分通過與細胞受體結合賦予細胞類型特異性，F-組分二聚化誘導構象改變，插入β桶跨膜通道之前發生低聚形成預孔。這4種白細胞毒素可溶解白細胞系細胞，殺滅中性粒細胞，促進S.aureus在宿主內存活［58］。PSMs是一種直接靶向宿主細胞的小分子肽，具有多種功能，包括促進宿主細胞活化和細胞裂解，在微摩爾范圍內，PSMs具有明顯殺傷中性粒細胞能力［59］。剝脫性毒素（ETs）也稱表皮分解毒素，是S.aureus分泌的特異絲氨酸蛋白酶，通過識別并水解皮膚表層的細胞橋粒鈣黏蛋白誘導皮膚剝落和水皰形成［36］。目前，已知的主要ETs為剝脫性毒素A、B、C、D（ETA、ETB、ETC、ETD），其中，ETA和ETB與人類皮膚損傷最為相關。SAgs可觸發T細胞產生大量促炎細胞因子（IL-2、IFN-γ和TNF），從而引起高燒、皮疹、脫屑、嘔吐、腹瀉和低血壓等癥狀，并可導致多器官衰竭［60］。

6 小結

S.aureus可產生大量免疫逃逸分子，通過破壞補體系統、阻止吞噬細胞發揮功能、逃避適應性免疫及分泌多種毒力因子入侵宿主并在宿主內生長存活，僅通過開發新的抗生素無法完全解決這一問題。既往S.aureus疫苗研制的常規方法遵循引發特定抗體原則，但成功率較低。隨著研究發展，研究者越來越認識到細胞介導免疫對于改善疫苗免疫保護作用的重要性。但S.aureus已進化出復雜的策略逃避或抑制宿主免疫系統，其免疫逃避機制可能是免疫系統無法消除S.aureus的原因，對高效疫苗開發構成巨大障礙。S.aureus逃避機制的研究可增強研究者對S.aureus如何與宿主相互作用的基本理解，為S.aureus感染防治提供參考。