組學技術在干燥綜合征研究中的應用與思考①

喻曉雯 王琴 嚴詩楷 吳斌（中醫藥防治自身免疫疾病重慶市重點實驗室，重慶400021）

干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）是一種復雜的異質性自身免疫性疾病，口干、眼干是其最常見的臨床表現，其發病機制不明，患病率約0.01%~0.60%［1］。SS早期由于缺乏典型的臨床表現，超過一半的患者出現漏診或誤診，平均確診時間為3.9年［2-3］。到目前為止主要是對癥治療為主，以緩解臨床癥狀，但很難改變SS的自然過程［4］。因此SS的發病機制、診斷和治療均面臨諸多困惑，迫切需要尋求新的技術來提高對SS的認識。組學技術因其自動化、高通量、高靈敏度和可重復的特點，廣泛應用于SS的早期診斷、疾病分類和治療反應等［5-6］。本文將對近年來組學技術在SS的應用綜述如下。

1 轉錄組學

原 發 性 干 燥 綜 合 征（primary Sj?gren's syn?drome，pSS）的發病是多因素的，B細胞活化在pSS的致病機制中發揮重要作用。IMGENBERG［7］團隊對12例pSS患者和20例健康對照（healthy controls，HCs）純化的CD19+B細胞進行RNA全轉錄組測序，發現pSS患者的Ⅰ型和Ⅱ型干擾素（IFN）誘導的基因、趨化因子及其受體表達上調，而細胞因子信號傳導的抑制因子下調，提示pSS的B細胞呈免疫激活特征。

miRNA是基因表達的重要調控方式，HILLEN等［8］采用OpenArray定量PCR技術對30例pSS患者和16例HCs的外周血漿細胞樣樹突細胞（pDC）的758種miRNA進行檢測，發現并驗證了10種差異表達miRNA，其中miR-29a和miR-29c是促細胞凋亡因子，提示pSS的miRNA的下調與pDC存活率增加有關。

唾液腺自身免疫炎癥也與SS發病機制相關，研究者通過RT-PCR比較了36例SS患者和25例對照的唾液腺組織、導管上皮細胞（SGEC），發現SS的導管上皮細胞的PPARγ表達和轉錄活性持續性降低。由于PPARγ具有重要的抗炎活性，提示SS導管上皮細胞的抗炎功能降低。此外，PPARγ激動劑在體外對SS-SGEC細胞系有良好的治療作用，提示PPARγ激動劑可應用于SS的臨床治療［9］。綜上所述，轉錄組主要應用于SS發病機制的研究，但還不深入，尤其在基因表達調控方面。SS的轉錄組研究見表1。

表1 SS的轉錄組研究Tab.1 Transcriptomics study of SS

2 蛋白組學

2.1 差異蛋白與疾病診斷SS可累及淚腺，影響蛋白的分泌，LI等［10］通過LC-MS/MS對8例SS、干眼癥和HCs的淚液進行蛋白質組分析，發現SS特異表達的蛋白有防御素α1、簇蛋白和乳鐵蛋白。AQRA?WID等［11］通 過LC-MS檢 測27例pSS患 者 和32例HCs的淚液蛋白譜，發現pSS的DNA裂解酶APEX1、硫氧還蛋白依賴性過氧化物酶還原酶PRDX、CPNE1、烏頭酸水合酶ACO2和LIM結構域蛋白7上調最明顯。淚液的差異蛋白常用于SS的診斷，如TOMOSUGI等［12］應用SELDI-TOF-MS分析了23例pSS、8例 繼發 性 干燥 綜合 征（secondary Sj?gren's syndrome，sSS）、14例干眼癥、22例其他眼病、21例HCs淚液蛋白質譜，發現7種下調蛋白和3種上調蛋白可作為SS的診斷標志物，靈敏度為87%，特異度為100%。

唾液腺也是SS常累及的靶器官，既往研究發現pSS唾液的β-2-微球蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白j輕鏈、免疫球蛋白k輕鏈、聚合Ig受體、溶菌酶C、胱抑素C和表皮脂肪酸結合蛋白顯著增加，而淀粉酶、α-淀粉酶前體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶減少、碳酸酐酶Ⅵ減少或缺失［13-15］。唾液差異蛋白也嘗試用于疾病的診斷中。如GALLO等［16］通過SELDI-TOF-MS分析了pSS、非SS干燥患者和HCs的唾液樣品，發現GCDFP-15/PIP蛋白能夠區分pSS患者和HCs，靈敏度為96%，特異度為70%。又如DELALEU等［17］通過基于187-plex捕獲抗體的研究發現SS患者的唾液蛋白變化顯著，如4-plex和6-plex生物標志物標簽（IL-4、IL-5和簇蛋白），可準確預測94%的病例。此外該團隊還通過唾液腺的焦點評分、生發中心有無和唾液腺功能受損情況，對pSS患者進行分組，發現22個與唾液分泌減少相關蛋白，4-plex標簽能準確預測大于80%的病例的唾液腺功能［18］。LI等［19］通過MALDI-TOF-MS對35例pSS、50例疾病對照和26例HCs的血清進行差異蛋白篩選，建立pSS的診斷模型并進行驗證，該模型的靈敏度高達95.5%，特異度為88%。上述研究均獲得了差異蛋白或標志物，但差異較大，可能與標本類型、實驗分組、實驗技術和分析方法等不同有關。

在鑒別診斷方面，臺灣的一項研究使用LC-MS/MS技術對RA、pSS、RA-sSS和HCs的血清進行分析，結果發現抗瓜氨酸化ITIH3542-556肽IgM能很好地區分RA與pSS、pSS與RA-sSS［20］。此外BODEWES等［21］通 過SOMAscan掃 描 技 術 分 析22名 疲 勞 和23名非疲勞pSS患者的血清差異蛋白，發現神經活性突觸體相關蛋白25、α-烯醇酶、泛素羧基末端水解酶同工酶L1、促炎介質IL36a和補體因子能鑒別疲勞和非疲勞的患者。

2.2 發病機制唾液差異蛋白與發病機制密切相關。STEA等［22］報道了pSS患者唾液含有高水平的翻譯后修飾的La/SSB自身抗原和肌動蛋白，僅能微弱地識別pSS的天然形式蛋白，提示自身蛋白質的理化性質改變可能打破了免疫耐受而發病。GAL?LO等［16］發 現pSS的GCDFP-15/PIP的表 達 顯 著降低，這與蛋白質產量的減少有關。且GCDFP-15/PIP的mRNA和唾液蛋白與MSG活檢病灶評分和患者的唾液流速相關，提示GCDFP-15/PIP唾液減少可能反映了pSS淋巴細胞介導的腺泡損傷，而AQP5-GCDFP-15/PIP axis的損傷可能在pSS腺體功能障礙中起作用。HALL等［23］采用ITRAQ技術分析了15例pSS患者、15例口干對照和14例HCs的樣本，發現β2-微球蛋白（血漿）上調與碳酸酐酶Ⅵ（唾液）和BPIFB2（血漿）下調。且pSS患者血漿和唾液中的大量唾液糖蛋白有更大程度的N糖基化，表明pSS與唾液糖蛋白的糖基化增加有關。這些研究從不同側面探討了pSS的發病機制，但還任重道遠。

疲勞是SS的常見癥狀，其發病機制未知。LARSSEN等［24］采用無標記鳥槍法蛋白質組學方法分析10例重度疲勞和10例輕度疲勞pSS患者的腦脊液蛋白質組。結果鑒定了載脂蛋白A4、血紅素結合蛋白、色素上皮衍生因子、分泌粒蛋白-1、分泌粒蛋白-3、硒結合蛋白1和補體因子B等差異蛋白，提示疲勞與先天免疫，細胞應激防御和/或中樞神經系統功能等有關。

上述研究發現許多蛋白可作為SS的候選生物標志物，具體見表1。在這些研究中獲得證實的差異蛋白有β-2-微球蛋白和碳酸酐酶Ⅵ［13-15］。前者是MHCⅠ類抗原的輕鏈分子，與SS的唾液腺炎癥有關［15］；后者與唾液碳酸氫鹽和氫離子轉化為二氧化碳和水相關，對維持唾液pH穩態至關重要［17］。盡管這些研究有較大差異，但總體而言，SS唾液蛋白譜的特征是炎癥和免疫應答相關蛋白表達增加，腺泡蛋白減少，分泌蛋白丟失，還有一些與氧化應激損傷有關的蛋白，這可能是由于腺泡細胞的損傷和功能障礙引起的。

2.3 臨床評估疾病活動指數（EULAR SS disease activity index，ESSDAI）是SS常用的病情評估指標。NISHIKAWA等［25］分析了30例pSS患者和30名HCs血清的差異蛋白與ESSDAI之間的相關性，結果發現CXCL1、TNF-R2、CD48、B-細胞激活因子（BAFF）和PD-L2可作為疾病活動度評估的候選指標，提示應用生物標志物評估病情存在可行性。另外匹魯卡品可促進唾液分泌，PELUSO等［26］通過LC-MS分析了匹魯卡品對9名pSS患者，9名sSS患者和10名HCs的62種唾液蛋白的影響，結果發現pSS患者60%的唾液蛋白檢測不到或顯著降低，匹魯卡品可恢復部分蛋白的分泌，腮腺蛋白、α-防御素1和β-防御素2對匹魯卡品的反應最好。提示蛋白組技術可以應用于治療評估。SS的蛋白組研究見表2。

3 表觀基因組學

3.1 表觀遺傳修飾與SS發病機制相關表觀遺傳修飾（如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等）已成為自身免疫疾病發病的重要誘因［28］。如THABET等［29］觀察到pSS唾液腺上皮細胞DNA甲基化程度降低，提示其與唾液腺功能障礙的關聯。KONSTA等［30］發現唾液腺上皮腺泡中的DNA甲基化缺陷與SSB基因表達，抗SSB/LA抗體產生和淋巴細胞浸潤有關。B細胞浸潤唾液腺是上皮細胞低甲基化的原因之一，用B細胞耗盡劑治療可恢復DNA甲基化，從而控制炎癥和自身免疫有關基因的表 達［29-31］。又 如IMGENBERG等［32］發 現pSS的CD19+B細胞中IFN調節基因的顯著低甲基化，包括MX1、IFI44L和PARP9基因。CHARRAS等［33］在pSS的SGEC中亦發現了IFN調節基因的低甲基化，表明IFN誘導基因的表觀遺傳調控pSS的發病。KARA?GIANNI等［31］總結了一系列與SS風險相關的甲基化基因座，如主要組織相容性復合物/人類白細胞抗原區、干擾素調節因子5、BLK、信號轉導子和轉錄激活因子4、白介素12A、TNFAIP3相互作用蛋白1和CXC基序趨化因子受體5，表明表觀遺傳學改變與SS的發病機制有關。

3.2 DNA甲基化改變與pSS患者的疲勞相關慢性疲勞是pSS患者的一個典型特征，但其機制不明。NORHEIM等［34］調查了高與低疲勞pSS患者的全血的差異DNA甲基化，共鑒定了251個差異甲基化的CpG位點，發現非編碼RNA在高疲勞狀態下的低甲基化，證實DNA甲基化與疲勞間的關聯。SS的表觀基因組研究見表3。

表3 SS的表觀基因組研究Tab.3 Epigenomics study of SS

4 微生物組學

4.1 SS患者的口腔微生物組特征存在爭議人類微生物群落由100萬億個細菌、原生動物、真菌和病毒組成。通過能量提取、代謝調節、抵御致病菌、調節免疫等對健康產生至關重要的作用［35］。早在2003年就開展了唾液微生物研究，如ALMSTAH等［36］觀察到SS的唾液中念珠菌和變形鏈球菌的增加，而具核梭桿菌則被耗盡。DEPAIVA等［37］發現了高水平的乳酸菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌和纖毛菌，而梭桿菌減少。SIDDIQUI等［38］發現pSS患者唾液中厚壁菌門明顯升高，而互養菌門和螺旋體門顯著減少。SHARMA等［39］的研究證實pSS患者唾液的微生物組多樣性無顯著變化，但pSS中雙歧桿菌、小桿菌和乳酸菌明顯增多，而纖毛菌明顯缺失。這些研究提示SS口腔菌群組成存在顯著差異，SS患者有較高水平的厚壁菌門和變形菌門細菌，而梭桿菌門細菌則明顯減少或缺失。

然而，MEULEN等［40］發現SS頰黏膜標本的微生物菌群雖不同于HCs，但與非SS干燥患者并沒有差別，表明SS患者頰黏膜微生物組是由唾液分泌減少和疾病特異性因素共同決定的。另有研究證實pSS唾液微生物群、口腔健康狀況及唾液流量與非SS干燥患者相似，提示唾液微生物群的變化似乎不是由pSS本身決定的［41］。顯然唾液微生物的變化特征還需進一步論證。

4.2 SS患者的腸道微生物組特征近年研究者開始關注SS患者腸道微生物的變化，如DEPAIVA等［37］發現SS腸道微生物菌落特征，即糞桿菌、擬桿菌、副桿菌和普雷沃菌屬的減少以及埃希菌、志賀菌和鏈球菌屬的增加，提示SS的標志是由共生細菌減少和病原菌屬增加。然而，MEULEN等［42］比較pSS和SLE患者的糞便菌群組成，并未發現差異，均表現為細菌多樣性減少、有較低比率的厚壁菌門和較高比率擬桿菌門，提示pSS和SLE患者在腸道菌群組成上有相似的改變，使患者有別于一般人群。顯然SS腸道微生物菌落是否具有特異性還需要更深入研究來揭示。見表4。

表4 SS的微生物組研究Tab.4 Microbiomics study of SS

5 代謝組學

目前SS的代謝組學研究較少。BENGTSSON等［43］將代謝組學應用于SLE與pSS和系統性硬化的鑒別診斷。在SLE與pSS、SSc和HCs的比較中，觀察到高于67%的代謝譜差異。KAGEYAMA等［44］通過GC-MS分析 了12例pSS和21例HCs的唾液 的代謝物譜，發現pSS的41種代謝物降低和多樣性的丟失，甘氨酸、酪氨酸、尿酸和巖藻糖的減少可能與唾液腺破壞相關。主成分分析發現pSS患者的兩個亞群的唾液腺炎的患病率差異顯著，提示代謝物譜受到唾液腺炎的影響。

6 組學聯合研究

目前SS的組學聯合研究還處于初級階段，日本的一項研究對30例SS和30例HCs標本進行了表觀基因組、轉錄組和蛋白組聯合研究，整合分析發現SS基因標簽（SGS）失調存在于多組學層面，SGS主要涉及IFN標簽和ADAMs底物。此外，SGS與全基因組關聯研究和表達性狀基因座分析表明SS致病基因顯著重疊。結合分子標記和免疫表型特征發現細胞毒性CD8-T細胞與SGS有關［4］。

另一項研究通過微生物組（16S rRNA基因測序）和代謝組（LC-MS/MS）分析27例SLE，23例SS，11例原發性抗磷脂綜合征，26例未分化結締組織患者和27例HCs的糞便和血漿樣本，以確定疾病之間的共同特征。結果發現了29個微生物屬和41個代謝峰，在微生物組和代謝組模型中，HCs與全身性自身免疫性疾?。⊿ADS）能很好地區分，而未分化結締組織與其他疾病有很大程度的重疊。在所有的SADS中，促耐受菌減少，而致病菌屬增加。酰基肉堿家族成員和磷脂兩類發生了代謝改變，前者與富集普羅沃特氏菌群集正相關；后者與產生丁酸鹽的細菌負相關。這些發現表明SADS患者的腸道微生物區系和代謝功能之間存在很強的相互作用［45］。顯然多組學聯合研究有助于更系統性地認識SS的發病機制。

7 思考與展望

Omics研究旨在整合和分析代表生物流體或組織內特定生物學參數整體的大量數據，并使用高級計算分析來檢查與表型或疾病狀態的關系。自動化、高通量和高靈敏度的組學方法能捕獲成千上萬個變量，并證明疾病過程與多個變量的相互關系［46］。但組學研究有數據質量/完整性，可重復性和研究樣本量等的挑戰［47］。使用標準質量控制過程和度量來標準化實驗室內和實驗室間組學測量變化，并應用一致的統計校正方法和適當的計算工具可以解決這類技術問題，有利于不同研究間的整合，獲得價值更高的研究成果［48-50］。

目前組學研究取得一些可喜的成績，但面臨諸多的困惑。不同研究之間差異大，可比性差。如現有的組學研究篩選的標志物特異性較低，難以與其他自身免疫疾病相鑒別［51］。另外，SS的臨床表現有較大的異質性，如FLEISSIG等［52］發現SS的唾液蛋白組就存在兩組表達模式。未來應不斷規范樣本的采集、實驗技術、多中心和多組學研究平臺，結合網絡分析和機器學習等發現傳統方法無法識別的生物標志物，進而有助于對疾病的診斷、病情監測和發病機制的理解。