巨噬細胞回輸治療炎癥相關疾病的研究進展①

盧羿同 王 亮 馬鵬飛 白 健 秦鴻雁

（空軍軍醫大學基礎醫學院醫學遺傳與發育生物學教研室，西安710032）

近年來，基于免疫調節功能的細胞療法已被美國食品藥品監督管理局批準上市，包括應用于癌癥治療的免疫激活嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細胞治療，以及應用于炎癥性腸炎和嚴重肢體缺血治療的間充質干細胞（mesenchy‐mal stromal cells，MSCs）治療［1-4］。巨噬細胞是人體重要的天然免疫細胞，從巨噬細胞被發現后的100多年里，人們對其的研究就一直熱情不減［5-6］。巨噬細胞對疾病的治療最早可以追溯到FIDLER博士的研究工作，早在1974年，他利用預激活的小鼠腹腔巨噬細胞進行回輸，觀察到其對B16細胞肺轉移具有顯著抑制作用［7］。之后，國內外學者包括本課題組紛紛開啟了自體巨噬細胞回輸治療組織損傷、退行性病變、器官纖維化及腫瘤等多種疾病的基礎和臨床研究［8-11］。然而，由于巨噬細胞具有活化、起源和功能的異質性，探討不同巨噬細胞亞群在疾病中的作用是將其有效用于疾病治療的前提［12］。因而課題組結合巨噬細胞異質性的研究，綜述了目前國內外利用不同類型巨噬細胞治療炎癥相關疾病的研究進展。

1 巨噬細胞發育和起源異質性

對于巨噬細胞（macrophages，Mφ）起源的探索，最早可追溯到1968年VAN FURTH等［13］提出的單核巨噬系統（mononuclear phagocyte system，MPS），該系統最初包括組織定居Mφ、循環的單核細胞和Mφ，后來也包括樹突狀細胞（dendritic cell，DC）。然而，隨著細胞命運圖譜研究的深入及譜系示蹤技術的出現，研究者們對組織定居Mφ的起源有了新的發現，其中最重要的兩個發現是大部分的組織定居Mφ起源于胚胎時期，且在整個生命周期中具有自我更新能力［14］。研究顯示，Mφ的發育分為3個連續的造血波，第1波即原始造血從E7.0天開始，在胚胎卵黃囊血島中產生紅細胞、巨核細胞和Mφ祖細胞。隨后Mφ祖細胞會在腦內產生Mφ前體，進而分化為小膠質細胞。第2波即暫時定向造血，發生在卵黃囊的造血內皮細胞中，在E8.25天時形成血管系統，并產生紅細胞髓樣祖細胞（erythro-myeloid progenitors，EMPs），這些祖細胞將產生第一個胚胎單核細胞。隨后，胚胎單核細胞會滲透到除大腦外的每一個組織，并分化成大多數組織的定居Mφ［15-17］。第3波開始于E10.5天，在主動脈-性腺-中腎區胚胎固有造血內皮處產生造血干細胞（hemato‐poietic stem cells，HSC）。E10.5天后，HSC也會出現于臍動脈和卵黃動脈以及胎盤和卵黃囊。EMPs、淋巴髓系祖細胞和HSC隨即進入胎肝，使其成為主要的造血器官，直到妊娠晚期［18］。在圍產期，HSC也能產生胚胎單核細胞，生成少量的定居Mφ。成體造血是從骨髓中開始，僅少量的組織定居Mφ在出生后由骨髓單核細胞分化而來，如腸道組織定居Mφ等。

目前公認的是，大多數組織定居巨噬細胞是來自暫時定向造血波時卵黃囊中出現的EMPs。在Mφ發育過程中，至少有兩條調控EMPs分化的信號通路。第一種是不依賴c-Myb表達的卵黃囊Mφ，也稱為原始巨噬細胞，它繞過了經典的單核細胞中間體，最終在腦內產生小膠質細胞并迅速被血腦屏障隔離［19］。第二種依賴c-Myb表達，一旦EMPs在胎肝中出現，就開始產生胚胎單核細胞。EMPs來源的胚胎單核細胞迅速進入其他組織，分化成成體組織定居Mφ［20］。

2 Mφ活化和功能異質性

正常生理功能下，Mφ具有吞噬和抗原提呈能力。然而，在局部組織炎性微環境的刺激下會呈現出不同的極化狀態，并具有相應的基因表達譜［21］。目前根據其表面受體和功能特征，Mφ被分為兩種極化類型，即經典活化的M1型Mφ和替代活化的M2型Mφ。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）被用來誘導M1型Mφ極化。M1型Mφ通過釋放大量促炎因子，如白介素12（interleukin-12，IL-12）、IFN-γ、腫瘤壞死因子α（tu‐mor necrosis factor-α，TNF-α）等，促進Ⅰ型輔助T（type 1 T helper，Th1）細胞免疫應答，發揮組織破壞和抗腫瘤功能。M1型Mφ的極化由JAK-STAT、NF-κB和TLR4信號和轉錄因子IRF5/IRF8介導。相對于M1型Mφ，M2型Mφ則由IL-4誘導，通過上調甘露糖受體的表達，釋放免疫調節因子IL-10、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，參與Th2細胞免疫應答，促進腫瘤生長和擴散［22］。而腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）在許多惡性腫瘤中表現為M2樣Mφ表型，與腫瘤患者的不良預后相關。研究表明，STAT6和IRF4均可介導M2型Mφ的極化［23］。

3 回輸不同類型Mφ對炎癥相關疾病的治療

3.1 肝臟相關疾病治療在肝纖維化領域，Mφ根據疾病分期和Mφ極化類型發揮促纖維化或抗纖維化作用。THOMAS等［24］的研究表明回輸骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）對四氯化碳誘發的慢性肝纖維化具有治療作用。然而，由于Mφ在起源、極化和功能上具有復雜的異質性，我們有理由認為，Mφ的不同亞群對同種疾病可能發揮不同作用。因此，課題組進一步探討了不同極化類型的Mφ在小鼠肝纖維化細胞治療中的精準作用，發現與M0或M2型Mφ相比，回輸M1型BMDMs對肝纖維化治療效果最好。進一步的機制研究表明：回輸M1型Mφ減少了肝星形細胞的數量和活性，促進內源性Mφ向纖維化肝臟的募集，并產生基質金屬蛋白酶和肝生長因子促進膠原降解和肝細胞增殖。同時，M1型Mφ也增加了纖維化肝臟中自然殺傷細胞的數量，釋放了腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體，誘導肝星形細胞凋亡［10］。最近，MORONI等［25］對9例肝硬化晚期患者進行了自體Mφ回輸治療的首次臨床試驗，結果表明，所有受試者在一年內均存活且未進行肝移植，達到了安全性和可行性的初步結果。這項研究為肝硬化和其他纖維化疾病的Mφ治療提供了依據，也為進一步使用M1型Mφ治療提供了基礎。此外，其他研究也表明可利用更明確的亞群來挖掘Mφ的治療潛力。例如，MELIN等［26］報道移植肝臟定居MφKupffer細胞對對乙酰氨基酚誘發的急性肝損傷或肝臟缺血再灌注損傷具有治療作用。提示，終末分化的或不同來源的巨噬細胞均可能成為治療肝臟相關疾病的候選細胞。

3.2 肺臟相關疾病治療肺泡蛋白沉積癥是由肺泡Mφ表面GM-CSF受體信號缺陷引起的肺表面活性脂蛋白清除不良，進而導致患者低氧性呼吸衰竭［27］。肺泡Mφ由于可吞噬肺表面活性物質，降低肺泡張力、維持肺泡容量的穩定，在肺泡蛋白沉積癥中發揮重要調控作用，因而重塑Mφ功能成為治療肺泡蛋白沉積癥的新策略。SUZUKI等［28］利用GM-CSF受體（csf2rb基因）敲除小鼠建立肺泡蛋白沉積癥模型，發現將BMDMs移植到csf2rb-/-小鼠的肺中，不僅可有效治療小鼠的肺泡蛋白沉積癥，而且移植的BMDMs能在肺臟內增殖，在移植后1年仍可在肺臟中發現，并且沒有引起免疫排斥反應。進而，該團隊將慢病毒介導的csf2rb基因表達糾正后的csf2rb+/+BMDMs移植到csf2rb-/-小鼠體內，發現也可消除小鼠肺泡蛋白沉積。而且，移植后野生型和csf2rb基因糾正型的Mφ都失去了BMDMs的特征，獲得了肺泡Mφ的特征［29］。令人感興趣的是，LACHMANN等［30］的研究表明，給罹患肺泡蛋白沉積癥小鼠回輸骨髓前體細胞同樣能定植在肺泡，并且可獲得肺泡Mφ表型，發揮療效。這一發現與SU‐ZUKI等［28］的觀察結果相一致，即肺臟微環境在決定Mφ的表型和功能方面起至關重要的作用。且自體BMDMs回輸對遺傳性肺泡蛋白沉積癥患者具有潛在的治療作用。

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征是呼吸衰竭的主要原因，但目前尚無有效的藥物治療［31］。肺泡巨噬細胞在ALI的急性期、初始期、慢性期和緩解期均發揮重要作用，是潛在的治療靶點。LIU等［8］構建了分泌IL-4的Mφ，并通過肺臟Mφ移植治療ALI。結果表明，肺臟巨噬細胞移植后通過減輕ALI小鼠的肺部炎癥、減輕組織損傷、減少肺泡Mφ死亡、降低死亡率等改善了ALI。上述結果提示：不同極化類型的肺臟Mφ移植可治療ALI。

3.3 腎臟相關疾病治療腎臟的再生能力有限，而在慢性腎病中誘導腎修復的療法很少［32］。因此，細胞療法等干預措施正在廣泛發展，成為預防終末期腎衰竭的替代治療方式［33］。在許多慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）小鼠模型中，M2型Mφ具有抗炎和修復活性，被用于細胞治療。但研究結果卻并不一致［34-35］。DAVID教授的研究小組研究了在急性腎衰竭和CKD動物模型中輸入M2型Mφ的作用。該團隊利用阿霉素腎病小鼠模型證明，與IL-4/IL-13誘導的M2a型Mφ相比，靜脈回輸IL-10/TGF-β誘導的M2c型脾臟來源CD11b+細胞，可增強對腎臟結構和功能損傷的保護作用。在嚴重聯合免疫缺陷的阿霉素腎病小鼠模型中，回輸脾臟來源的M2a型Mφ與腎損傷的惡化有關。這些M2c型Mφ高表達B7-H4，而M2a型Mφ則不表達。因此，作者認為M2c型Mφ能發揮腎臟保護作用是由于表達了共同刺激分子B7-H4，進而抑制T細胞增殖并誘導調節性T細胞產生。同時，也證明輸入M2c型Mφ在疾病過程中并沒有改變自身的表型。相比之下，CAO等［34］和WANG等［35］研究表明，使用相同的小鼠模型，可能由于Mφ表型的改變，從骨髓中獲得的M2型BMDMs未能減少蛋白尿和維持腎功能。進一步研究表明，輸注M2型BMDMs可能在體內失去了抑制功能，而脾臟來源的M2型Mφ保持了其抑制功能。上述研究提示，在應用Mφ進行疾病治療時，其來源是一個需要考慮的關鍵問題。

此外，RAQUEL等［36］也研究了回輸單核/巨噬細胞對糖尿病腎病大鼠的治療作用。通過利用鏈脲佐菌素誘發糖尿病模型，4周后經頸靜脈回輸BMDMs后，作者發現，內源性給予糖尿病大鼠BMD‐Ms通過減少腎內TGF-β和聚集在腎小球內的精氨酸酶陽性Mφ，改善了Ⅰ型糖尿病大鼠模型的腎小球功能和形態。上述研究均表明：針對不同的腎臟疾病，選擇不同來源或極化的Mφ進行回輸具有不同的效果。

3.4 腫瘤相關治療早在1974年，FIDLER等［7］報道將黑色素瘤（B16）培養基激活的Mφ輸注到荷瘤小鼠體內可以減少腫瘤的肺轉移。1990年AN‐DREESEN等［37］首次報道了IFN-γ 激活的自體TAMs的體外獲得及再輸注的首次臨床試驗。其研究表明：體外共培養的Mφ能夠識別和殺傷腫瘤細胞，但利用轉移瘤模型卻不能產生殺傷腫瘤細胞效應。之后，隨著大規模血液單核細胞體外培養技術的成熟，來自癌癥患者的臨床試驗證明了注射IFN-γ或LPS激活的自體單核細胞分化的Mφ在治療上的可行性和安全性。人類Mφ過繼免疫治療的給藥方式可通過多種途徑實現：如經靜脈、腹腔、胸膜內或選擇性肝動脈灌注。通過回輸銦111標記Mφ進行體內分布研究時顯示，腹腔注射的Mφ可定位于腹腔腫瘤包塊處，而在經體循環回輸后則定位于肝臟、脾臟［38］。值得注意的是，在這些研究中，所有類型的Mφ靶向免疫治療僅在抑制腫瘤轉移方面有效，而很少觀察到腫瘤原發灶的消退，原因可能為回輸后的Mφ不能到達腫瘤原發灶內或被腫瘤微環境重新誘導為TAMs，不能發揮抗腫瘤作用。

由于回輸Mφ并未起到治療腫瘤的作用，研究者們提出了更多靶向TAMs的治療策略，包括：抑制Mφ在腫瘤中的募集和存活；TAMs功能再教育，即將M2樣TAMs再教育為M1樣的TAMs，發揮抗腫瘤作用；Mφ介導的抗體依賴的細胞毒殺傷效應；以及應用基因工程修飾Mφ，如CAR-Mφ靶向殺傷腫瘤等［39］。

4 展望

總之，上述研究均顯示：Mφ不僅在先天免疫中發揮重要作用，在急慢性炎癥和腫瘤的發生發展中也發揮至關重要的調控作用。利用Mφ回輸治療在肝纖維化、肺泡沉積癥、糖尿病腎病、腫瘤中的相關研究中均取得了一定的進展。然而，由于Mφ具有起源、活化和功能的異質性，因而，深入研究Mφ異質性在不同疾病中的作用和機制，是將來實現臨床靶向Mφ治療疾病的前提。而且我們有理由相信，在分子機制揭示的前提下，利用基因編輯技術體外改造Mφ可能是未來靶向Mφ治療疾病的重要途徑之一。把Mφ這一古老的細胞用多種手段改造武裝后，有望成為治療人類多種疾病的候選明星細胞。其也將成為繼干細胞療法、DC療法和CAR-T療法后的另一種強大的細胞治療技術，為治愈疾病提供新策略。