多發性硬化中microRNA-155對中樞神經系統細胞的影響①

張棟亮 唐玉蘭 （廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，南寧530021）

microRNAs（miRNAs）是一種長度約20～24個核苷酸小的非編碼RNA分子，可結合靶標蛋白mRNA序列的3′URT，通過mRNA翻譯抑制或降解在轉錄后發揮調控基因表達的作用，影響著細胞發育、分化、增殖、代謝和凋亡等生物學過程。近年來，miR‐NAs在炎癥性疾病中作為生物標志物、調節因子和潛在治療靶點的研究越來越多，其作為某些趨化因子、細胞因子等炎癥相關介質的重要轉錄調控因子，影響著炎癥性疾病的發生、發展及治療等方面，其中microRNA-155（miR-155）通過調控外周免疫細胞和中樞神經系統駐留細胞的增殖、活化、極化、遷移等在神經炎癥過程中發揮重要作用［1］。

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種自身免疫介導的中樞神經系統（central nervous system，CNS）慢性炎性脫髓鞘疾病，其發病機制復雜，涉及外周、中樞免疫系統和包括免疫細胞、神經元、神經膠質細胞、血腦屏障細胞等在內的各類型細胞間復雜的相互作用，最終導致大腦和脊髓發生局灶性炎性脫髓鞘、軸突損傷和彌漫性神經退行性病變［2-3］。自JUNK‐ER及LESCHER等［4-5］發現miR-155在MS患者、MS動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental au‐toimmuneencephalomyelitis，EAE）小鼠及EAE狨猴活躍的白質病灶中的表達較對照組顯著升高以來，越來越多的研究證實了miR-155在MS中的重要作用。O′CONNELL等［6］也發現了miR-155-/-小鼠對EAE的誘導具有高度抗性，由此可見病灶中上調的miR-155對MS/EAE的發生發展在總體上可能起到了促進的作用，而在單個細胞層面上探究miR-155有助于加深了解miR-155對MS/EAE在總體上的這種促進作用。本文就miR-155的異常表達對神經膠質細胞、血腦屏障細胞等中樞神經系統細胞在不同功能狀態下的調控作用進行回顧，從而探討miR-155在MS發病過程中的作用并借此提出新的治療觀點。

1 miR-155與星形膠質細胞

1.1 星形膠質細胞的生物學功能 星形膠質細胞由于神經營養因子的產生及其在調節細胞外谷氨酸和鉀濃度方面發揮關鍵作用，在傳統上被認為具有營養作用，且激活的星形膠質細胞分泌的炎癥介質對機體抵抗病原體至關重要，但持續活化的星形膠質細胞分泌過多的促炎細胞因子，這與神經炎癥和神經退行性病變相關［7］。因此，星形膠質細胞依據其不同的活化表型（A1型和A2型）發揮雙重功能，這與巨噬細胞極化的功能表型頗為相似。星形膠質細胞已被證實是與MS病變發展密切相關的細胞，在炎癥后期可形成膠質瘢痕，但目前研究發現星形膠質細胞在MS疾病進展過程的早期及活躍期也發揮著重要作用［8］。

1.2 miR-155對星形膠質細胞的調控 在MS病變早期，反應性星形膠質細胞攝取髓鞘碎片，誘導核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和絲裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）信號通路的傳導，促進細胞間趨化因子（CCL3、CCL5、CCL20、CXCL10等）的分泌，以上趨化因子的分泌可能誘導了外周T淋巴細胞及巨噬細胞向CNS遷移及浸潤，加重了疾病的炎癥反應及髓鞘的脫失［9］。當然，這些免疫細胞向CNS遷移和血腦屏 障（blood brain barrier，BBB）的 通 透 性 有 關 。JUNKER等［4］通過激光捕獲顯微解剖（laser capture microdissection，LCM）技術從活躍的MS病灶收集到的星形膠質細胞中發現了miR-155表達水平較對照組顯著上調。miR-155的表達上調與影響BBB通透性的基質金屬蛋白酶3（Matrix metalloproteinases 3，MMP3）在星形膠質細胞中的表達升高相關，KO‐ROTKOV等［10］在體外細胞培養中發現轉染miR-155抑制劑后可以削弱MMP3在IL-1β刺激的星形膠質細胞中的表達，miR-155可能通過活化MAPKs通路下游的激活轉錄因子AP-1和NF-κB介導了MMP3的表達。TARASSISHIN等［7］在研究中還發現了抑制miR-155在星形膠質細胞中的表達可下調IL-1/IFN-γ誘導的TNF-α、IL-6和IL-8等促炎細胞因子的表達，miR-155通過靶向抑制細胞因子信號抑制物1（cytokine signal suppressor 1，SOCS1）的轉錄從而發揮炎癥誘導的作用。這表明miR-155參與調控炎型A1星形膠質細胞的活化及其細胞因子的表達，對MS病灶中炎癥環境下的星形膠質細胞的功能變化具有很好的參考意義。類似地，miR-155通過靶向抑制SOCS1的表達來調控星形膠質細胞的活化并影響神經炎癥的進展也見于阿爾茨海默病（alzheim‐er disease，AD）和帕金森病（parkinson′s disease，PD）等神經退行性疾病［11-12］。此外，具有誘導神經元及少突膠質細胞死亡功能的A1星形膠質細胞在MS、AD、PD等疾病的大腦樣品組織中被高度發現，盡管MS的發病機制和AD、PD等疾病各有不同，miR-155通過影響星形膠質細胞的活化和相應細胞因子的分泌來調控以上疾病炎癥，這與神經退變的病程進展是有著相似之處的［13］。當然，miR-155對MS等疾病病程的影響還通過調控其他神經膠質細胞的功能狀態來實現。

2 miR-155與小膠質細胞

2.1 小膠質細胞的生物學功能 小膠質細胞，即大腦的巨噬細胞，是組成大腦固有免疫系統的駐留細胞之一，可持續監測其周圍環境，以發現感染或穩態擾動事件的跡象。在CNS功能正常期間，小膠質細胞發揮著維持細胞突觸和髓鞘穩態的功能。神經元、星形膠質細胞、血腦屏障細胞和T淋巴細胞等對小膠質細胞的差異激活是神經炎癥的調節樞紐，活化后的小膠質細胞表現出增殖的跡象，其遷移、吞噬和抗原提呈能力得到了提高，并且分泌過多的炎癥介質［14］。因此，小膠質細胞不僅是CNS穩態的守護者，也是CNS疾病發生、發展的參與者。

2.2 小膠質細胞在MS發病機制中的作用 在MS及其動物模型EAE病灶中，活化的小膠質細胞內含有髓鞘碎片和軸突殘體，MHCⅠ類、Ⅱ類分子和共刺激分子表達升高，并分泌大量的炎癥介質和神經毒性介質。而且在EAE中，CD40+小膠質細胞可以招募CD40L+CD4+T淋巴細胞進入病灶，CD11C+呈樹突狀細胞樣的小膠質細胞有助于將抗原提呈至CD8+T淋巴細胞。此外，活化的小膠質細胞通過分泌TNF-α調控T淋巴細胞向致病性的Th1淋巴細胞和Th17淋巴細胞分化，且小膠質細胞分泌的部分炎癥介質，包括Ⅰ型IFN和IL-18，以及表達上調的CD45、MHCⅠ類、Ⅱ類分子和共刺激分子，刺激了Th1和Th17淋巴細胞亞群的增殖［2］。GOLDMANN等［15］研究還發現，在EAE小鼠中小膠質細胞的消耗或小膠質細胞特異性基因TGF-β活化酶1的下調可以緩解脫髓鞘的進展，減輕疾病的嚴重程度。由此可見，調控小膠質細胞的活化和增殖以減輕髓鞘和軸突的損傷可能是MS潛在的一種治療方案。

2.3 miR-155對小膠質細胞的調控 miR-155在小膠質細胞的活化、增殖、炎癥等方面獲得了較為廣泛的研究。FREILICH等［16］在對原代培養的小鼠小膠質細胞進行M1樣和M2樣表型誘導后，對具有促炎特性的M1樣表型小膠質細胞的miRNA進行了微陣列表達譜分析和生物信息學分析發現miR-155是表達上調最顯著的miRNA之一。MOORE等［17］通過LCM技術從腦實質中捕獲到CD68+小膠質細胞并進行miRNAs分析，發現miR-155在MS病人小膠質細胞中的表達較對照組明顯上調，并且體外培養的小膠質細胞轉染了miR-155模擬物后，CCR7、CD80和CD86等細胞表面分子表達增加，miR-155的靶向基因SOCS1表達下調，并進一步導致TNF-α、IL-6等炎癥介質合成增多。miR-155的表達升高也在紅藻氨酸刺激的小膠質細胞中被發現，而在小膠質細胞培養基中加入miR-155拮抗劑共培養后，促炎細胞因子IL-1β和IL-6的表達被削弱，同時紅藻氨酸誘導的小膠質細胞的活化形態在很大程度上被逆轉［18］。TNF-α、IL-6、IL-1β和CCR7、CD80、CD86分別是M1型小膠質細胞相關的細胞因子和細胞表面分子，以上研究在一定程度上表明miR-155參與了小膠質細胞的活化并調控其活化的方向，使小膠質細胞在特定的病變階段發揮相應的功能。

鑒于miR-155在小膠質細胞活化過程中發揮的重要作用，通過靶向調控miR-155的表達來影響小膠質細胞的活化狀態從而觀察疾病變化的研究越來越多。miR-155-/-PD模型小鼠由于miR-155的缺失，α-突觸核蛋白誘導的促炎反應和神經退行性病變減弱［19］。創傷性腦損傷模型小鼠給予腦室內注射miR-155拮抗劑后，腦損傷誘導的促炎基因表達下調，皮層損傷的病灶范圍縮小，小鼠的認知功能、運動能力等得到相應恢復［20］。總之，研究表明miR-155作為CNS炎癥性疾病的重要調控因子，影響小膠質細胞的多種功能，包括激活、增殖、炎癥及細胞間的相互作用等，通過靶向miR-155調控小膠質細胞極化的方法在CNS相關疾病的治療計劃中起著不可忽視的作用，這也為MS的治療揭示了一個新的方向。

3 miR-155與少突膠質細胞

3.1 少突膠質細胞的生物學功能 少突膠質細胞是由神經干細胞分化而來，其發育過程經歷神經祖細胞、少突膠質細胞祖細胞、少突膠質細胞前體細胞、幼稚少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞幾個時期［21］。成熟的少突膠質細胞對軸突進行包裹并提供營養支持，同時釋放的乳酸被軸突攝取并用于線粒體ATP合成，而且少突膠質細胞間的縫隙連接結構有利于保持BBB完整性，并對CNS內髓鞘和軸突的發育和維持發揮重要作用［22-23］。

3.2 少突膠質細胞在MS發病機制中的作用 少突膠質細胞由于其復雜的分化程序和獨特的代謝生理，是CNS中最易受到病理損傷的細胞之一。在MS復雜的病理過程中，少突膠質細胞發生功能障礙及細胞死亡并引發脫髓鞘和神經退行性病變。CNS發生急性脫髓鞘后，少突膠質前體細胞增殖、遷移到病灶后分化為成熟少突膠質細胞，合成新的髓鞘［24］。但是其合成總體上是低效的，可能是由于MS病灶處軸突再髓鞘化形成的髓鞘較正常短、薄，同時，隨著年齡的增加及MS病程的延長，髓鞘再生的速度也在逐漸下降［25］。此外，在MS中少突膠質前體細胞向病灶處遷移、招募受損及低分化率等表現，共同導致了脫髓鞘和軸突變性過程的持續進行［22］。因此，促進少突膠質前體細胞招募、分化的能力，提升受損軸突再生髓鞘的有效性是保護軸突、逆轉神經功能障礙和預防MS進展性疾病的有價值的研究途徑。

3.3 miR-155對少突膠質細胞的調控 CANTONE等［26］利用生物信息學和Meta分析對少突膠質細胞系分化的復雜過程進行研究推測出miR-155是少突膠質細胞系分化的關鍵調控因子之一，并進行了驗證，miR-155作為前饋環路（Sox10→miR-338/miR-155★Tcf7L2）核心因子之一可通過抑制轉錄生長因子7類似物2（transcription factor 7 like 2，Tcf7L2）的翻譯，進而導致少突膠質細胞系分化缺陷或不完整。這與Tcf7L2作為典型Wnt信號通路調控少突膠質細胞分化的關鍵核內成分一致，也表明miR-155是少突膠質細胞分化成熟及再髓鞘化的潛在調控靶點之一［27］。HAN等［28］人在神經毒劑CPZ誘導的小鼠脫髓鞘模型中發現miR-155-5p和miR-20a-5p等240個miRNAs的表達發生了顯著變化，而且Smad2和Smad3的表達和磷酸化顯著降低，脫髓鞘時Smad4和Id1表達下調，具有抑制軸突再生及修復的NOGO受體表達顯著上調。因此，以上結果表明在脫髓鞘過程中上調的miR-155-5p和miR 20a-5p可能通過靶向抑制Smad信號級聯而誘導軸突上NOGO受體的表達，進而誘導脫髓鞘的持續發生。此外，上調的miR-155還可通過靶向下調少突膠質細胞膜表面CD47分子的表達，從而減弱巨噬細胞/小膠質細胞對軸突的吞噬抑制［4］。綜上，過表達的miR-155在脫髓鞘及軸突修復過程中扮演著有害的角色。不過有趣的是，miR-155在病程的某個階段似乎還具有促進受損軸突再髓鞘化的作用，JIANG等［29］研究發現miR-155在CNS的Notch信號通路中發揮著重要作用，過表達miR-155可下調Notch1的表達，而Notch1是影響少突膠質前體細胞分化的信號通路之一并與受損或低效的再髓鞘化形成機制相關，二者間是否存在相關性有待進一步深入研究［30］。目前MS或EAE病灶分離出少突膠質細胞并對miR-155的表達水平尚未報道，miR-155對少突膠質細胞的影響更多的是如前文所述，主要還是通過調控星形膠質細胞、小膠質細胞及外周免疫細胞的功能狀態在髓鞘破壞及再合成過程的不同階段來發揮作用。

4 miR-155與BBB

4.1 BBB的生物學功能 BBB是微血管內皮細胞與外周細胞、星形膠質細胞、神經元和細胞外基質等密切接觸而形成的血管系統網絡，多數影響CNS穩態的代謝變化都是通過這個調控網絡發生的。BBB通過其屏障細胞間復雜的相互作用來限制并防止外源性物質、代謝毒物和免疫細胞等進入CNS，發揮維護CNS穩態的作用。

4.2 BBB在MS發病機制中的作用 BBB功能的減弱是MS早期病理變化之一，在活躍的MS病變中，通過各種細胞黏附分子、整合素、細胞因子和趨化因子的調控下，大量白細胞經免疫激活的BBB遷移至腦實質，進而導致不可逆的脫髓鞘、組織損傷和軸突功能障礙［3］。雖然BBB功能障礙的機制尚未完全清楚，但在MS中白細胞或大腦駐留細胞活化后釋放的促炎細胞因子如TNF-α及IFN-γ等，在體外實驗中已被證實可以改變構成BBB的內皮細胞的生理功能，使它們的通透性增加，并影響緊密連接蛋白的表達［31-32］。因此，明確MS中引起BBB功能障礙的分子調控網絡中的關鍵因子，并通過一定的干預措施來促進BBB功能恢復從而減輕大腦免疫損傷和恢復腦內穩態，是研究MS發生發展機制及治療策略的切入點之一。

4.3 miR-155對BBB細胞的調控 已有研究證實了人血管內皮細胞在炎癥刺激下能上調miR-155的表達，抑制或過表達miR-155可分別降低或增加血管 內 皮 通 透 性 ，進 而 影 響BBB功 能［29，32-33］。MANKERTZ等［31］使用LCM技術分離白質的微血管，并研究miR-155在MS活動性病灶的神經血管單位水平上的表達是否發生改變。研究發現，與非神經系統疾病的對照組白質及MS患者正常白質組相比，活躍的、持續脫髓鞘的、炎癥性的MS病灶白質的神經血管單位中miR-155的表達水平顯著升高。此外，在動物實驗中發現miR-155-/-EAE小鼠與對照組EAE小鼠相比，示蹤劑FITC-dextran在BBB上的滲漏減少了50%，說明miR-155對BBB完整性的維持產生不利的影響。這種不利的影響可能源自以下幾個方面：首先，過表達的miR-155通過靶向mRNA序列的3′URT抑制內皮細胞間黏著斑組分（DOCK-1、SDCBP）和連接復合體組分（ANXA-2、CLDN-1）的翻譯造成的［32，34］。其次，過表達的miR-155還可以通過影響調控內皮細胞黏附分子VCAM1和ICAM1表達的基因，在一定程度上增強VCAM1和ICAM1的表達，同時miR-155還可能靶向抑制NF-κB激酶相互作用蛋白的抑制劑，導致轉錄因子NF-κB核轉位增加，促進VCAM1和ICAM1的表達，進而促進單核細胞和T細胞等炎癥細胞在血流剪切力作用下黏附內皮細胞［35］。最后，過表達的miR-155還可以靶向下調內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS）的表達及NO合成，而eNOS參與了EAE小鼠BBB的形成和維持，且給予外源性NO可減輕EAE臨床癥狀［29，36］。此外，除了內皮細胞自身過表達的miR-155增加了BBB的通透性之外，其他細胞合成的miR-155還有可能通過外泌體搭載進入內皮細胞并破壞緊密連接和內皮屏障的完整性［34］。構成血腦脊液屏障的脈絡叢上皮細胞被LPS刺激活化后，向腦脊液中釋放包含miR-155的外泌體，可進入腦實質并被星形膠質細胞和小膠質細胞攝取，從而誘導miR-155的靶向抑制與炎癥反應的激活［37］。在機體受到炎癥刺激后，大腦屏障細胞感應炎癥信號后分泌包含miR-155的外泌體，并通過作用于腦實質受體細胞將這種信息傳遞到CNS，鑒于這一過程在炎癥性疾病中的重要作用，抑制攜帶炎癥信號外泌體的合成等方法可能成為疾病治療新方案的依據。

5 小結與展望

目前miR-155在MS中的研究更多的是集中在外周免疫細胞，中樞神經系統細胞則相對較少，但仍有部分研究闡明了miR-155在MS發病機制中作用。MS/EAE病灶中上調的miR-155，一方面通過活化星形膠質細胞及小膠質細胞成為炎癥細胞在MS/EAE的炎癥損傷中發揮作用；另一方面可能通過抑制少突膠質細胞的分化使得受損軸突的再髓鞘化受阻，同時miR-155降低BBB通透性使得外周免疫細胞更易進入CNS對髓鞘造成持續損傷。由此可見，miR-155有望成為MS患者強有力的治療靶點，不過需要注意的是，miR-155由于有多個靶向基因位點，且在不同細胞中的作用存在差異性，其臨床上的應用價值應需從個體的總體效應進行綜合評價。

miR-155作為疾病的生物標志物及藥物療效監測指標的臨床研究越來越多，miR-155在MS診斷及分型方面的作用在研究報道中也漸漸得到肯定。隨著體內傳遞miRNAs模擬物及抑制劑的技術逐漸發展，且miRNAs藥物也已經進入相關疾病的臨床試驗，在未來，miR-155的靶向治療在MS的診治中或許會大放異彩。