microRNA對缺血性腦卒中血腦屏障影響的研究進展

范曉迪,李 然,李 澎

(中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所中藥藥理北京市重點實驗室,北京 100091)

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)具有極高的發病率、致殘率和復發率，嚴重地威脅著人類生命健康。越來越多的證據表明，血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)通透性升高是IS發病過程的關鍵環節[1]。BBB是存在于大腦血液循環與神經組織之間的特殊屏障結構，它由腦血管內皮細胞、基膜周細胞及星形膠質細胞尾足組成，是維持腦組織內環境穩定、調節腦組織營養與代謝、維持中樞神經系統正常微環境穩態的結構基礎[1]。完整的BBB對于大腦功能的維持至關重要，是當今整個醫學界矚目的治療缺血性腦卒中的關鍵靶標。

MicroRNA(miRNA)是一類長約20個核苷酸序列的內源表達的非編碼短單鏈RNA，它通過對mRNA的降解或瞬時翻譯抑制來負調控靶基因的表達。目前已證明某些特定miRNA是調控IS血腦屏障損傷的重要因子，針對它們進行調控，可能對減少腦缺血引起的BBB損傷和神經血管單元(neurovascular units, NVU)功能障礙，以及改善卒中預后具有重要意義[1-2]。

本文總結了有關miRNA在腦缺血BBB損傷中的作用的最新研究進展，強調miRNA對腦缺血BBB具有極為關鍵的調節作用；這些最新的研究發現，可以為基于BBB完整性保持的IS治療策略提供重要的借鑒與參考。

1 miRNA對腦微血管內皮的調節作用

內皮細胞是腦微血管的主要組成部分，生理狀態下對維持BBB的完整性和腦微環境穩態起主要作用[2]。腦缺血后腦內皮細胞功能失常導致BBB通透性升高，甚至崩解，從而導致炎癥的發生，進一步損傷神經細胞，乃至成倍擴大缺血性腦損傷[1-2]。因此，腦微血管內皮成為抑制IS的重要治療靶點[3]。miRNA在腦血管內皮中高度表達，并對血管內皮細胞功能具有關鍵的調節作用[3]。

1.1 miRNA與血管內皮細胞連接復合體BBB內皮細胞交界處的連接復合體由緊密連接(tight junctions，TJs)、黏附連接(adherens junctions，AJs)和縫隙連接(GAP junctions，GJs)組成，連接復合體組件或功能的破壞直接影響BBB通透性。TJs主要包括閉合蛋白(claudins)、咬合蛋白(occludin)、胞質附著蛋白(zonula occludens，ZO)和連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)。AJs主要由鈣黏著蛋白(cadherins)和連環素(catenins)組成。在IS中，腦血管內皮TJs往往首先受到影響，miRNA可以通過直接或間接調控TJ蛋白表達，進而影響BBB通透性。

研究證明，miR-155是內皮形態發生的潛在調節劑。在氧葡萄糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)誘導的人原代腦微血管內皮細胞(human primary brain microvascular endothelial cells，HBMECs)損傷中，抑制miR-155，導致claudin-1和ZO-1蛋白表達升高，而將claudin-1 cDNA轉染到OGD損傷的HBMECs中，發現claudin-1表達增加，并促進內皮細胞膜上ZO-1穩定，證明miR-155抑制所引發的內皮屏障功能改善是由其直接靶蛋白claudin-1所介導的[4]。最新研究發現，在小鼠腦缺血模型中，選擇性敲低血管內皮細胞miR-15a/16-1，可增強claudin-5的mRNA和蛋白表達豐度；在培養的小鼠腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)中，證實miR-15a/16-1簇直接結合到claudin-5的3'非翻譯區(3'UTR)，同時干擾阻斷miR-15a/16-1的表達，減少了OGD誘導的claudin-5 mRNA和蛋白表達的下調并緩解內皮屏障功能障礙，表明下調血管內皮miR-15a/16-1的表達可以抑制IS中BBB損傷[5]。

miR-210負調節新生兒大腦BBB的完整性，與其3'UTR互補的潛在靶基因為occludin和β-catenin[6]。在低氧損傷小鼠BMECs和人腦微血管內皮細胞系(human brain microvascular endothelial cell line，hCMEC/D3)中，查明claudin-1，連接黏附分子3(JAM3)和緊密連接相關蛋白1(TJAP1)是miR-212/132調控BBB作用的直接靶標[7]。

miR-143已被證明可以作為臨床上早期診斷IS的標志物[8]。既往研究證實，下調miR-143可以保護BBB，在此基礎上，又發現沉默miR-143不僅能夠促進短暫性腦缺血(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)小鼠和OGD損傷的bEnd.3細胞的內皮緊密連接蛋白(claudin-5、occludin、ZO-1)的表達，同時抑制二者間充質細胞標志物(collagenⅠ、collagenⅡ、α-SM)的表達水平，進而抑制內皮-間充質轉變(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)的生物過程，減少BBB損傷[9]。

連接復合體是涉及各種關鍵細胞過程的結構蛋白組，已證明內皮連接完整性涉及多種疾病，在連接蛋白表達所有調節機制中，miRNA已成為其結構和功能特性特別有希望的靶標。以上miR-155、miR-210、miR-212/132、miR-143對連接蛋白表達及BBB完整性產生負性調控，提示抑制負性miRNA可能成為保護BBB完整性的治療方法。

1.2 miRNA與內皮炎癥腦缺血后的炎癥涉及復雜的病理進展，起始于大腦常駐細胞的活化，循環白細胞如中性粒細胞，淋巴細胞和單核細胞的浸潤以及免疫細胞釋放促炎性介質。炎癥既是BBB破壞的一個重要的病理因素，也是BBB破壞的病理后果；其中血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和內皮細胞-白細胞黏附分子(E-selectin)是中風后誘導炎癥的主要內皮黏附分子。

實驗證明，miRNA-126-3p/-5p過表達后，VCAM-1和E-選擇素水平顯著降低，從而減弱白細胞浸潤、炎性因子分泌，以及升高ZO-1和occludin蛋白的表達，最終減少BBB破壞和腦梗死體積[10]。這表明，miRNA是微血管內皮細胞炎癥基因誘導表達的主要調節因子。

在tMCAO和OGD損傷后，內皮中的miR-98表達水平顯著降低，而miR-98的過表達減少了小鼠的梗塞面積，抑制中風后促炎性Ly6CHI白細胞向大腦組織的浸潤，并降低了病變區域M1(活化)小膠質細胞的數量。通過體內熒光標記的葡聚糖滲透實驗和體外跨內皮電阻(transendothelial electrical resistance，TEER)實驗，證明了上調miR-98的表達改善了BBB的通透性[11]。

let-7g*是let-7家族的一種變體。最初發現lethal-7(let-7)基因可控制秀麗隱桿線蟲的細胞分裂和分化，并且是人類中最早的已知microRNA之一。現有研究表明，let-7在細胞分裂、分化，腫瘤形成和腫瘤抑制等生物過程中均發揮重要作用；同時，let-7家族參與神經退行性疾病的發生，并與調節炎癥密切相關[12]。

在體內及體外腦缺血損傷模型中發現，過表達let-7g*能夠抑制中風BBB的通透性升高，減弱腦組織炎癥，限制CD3+CD4+T細胞和Ly6G+中性粒細胞的腦浸潤，減少小膠質細胞活化和神經元死亡。這些結果證實了let-7g*的過表達具有神經保護作用[13]。

通過對MCAO小鼠腦缺血組織中提取的微囊泡進行檢測發現，miR-27a在微囊泡中的表達異常升高；股靜脈注射微囊泡后，MCAO小鼠腦梗死體積增大，BBB緊密連接蛋白損失加重，伴隨Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)、核轉錄因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和p38蛋白表達上調, 進而誘導下游炎癥因子的釋放，提示微囊泡miR-27a 與缺血腦組織BBB損傷和炎癥信號通路TLR4、NF-κB和p38的激活密切相關[14]。

在缺血性腦卒中中，miRNA對腦微血管內皮屏障功能、BBB完整性以及炎癥反應，均發揮著重要調控作用；這些新的發現，揭示了miRNA參與IS腦內皮損傷的新機制，提示通過miRNA可以調節神經炎癥反應、修復受損BBB、重新建立正常腦血管功能，表明miRNA在IS中具有廣闊的治療前景。

1.3 miRNA與內皮細胞凋亡腦缺血會導致BMECs的功能損傷，而這一損傷繼續發展的終極形式就是細胞的死亡。血管內皮細胞的死亡，直接導致腦微血管完整結構的缺失，而且是不可逆的，對IS的預后帶來尤其嚴重的不良影響。有相當部分的BMECs是通過凋亡的方式死亡的。

研究表明miR-15a-5p和SNHG16與人BMECs的增殖和凋亡存在關聯。miR-15a-5p通過靶向Bcl-2，抑制其表達，誘導OGD/R內皮細胞凋亡，從而促進I/R損傷[15]。

miR-199b-3p對BMECs 細胞活力、細胞周期以及細胞凋亡都具有重要影響。建立MCAO/R小鼠模型，發現miR-199b-3p在腦組織中表達降低，同時MAPK/ERK/EGR1軸激活、BMECs的凋亡增加；而用miR-199b-3p模擬物和U0126(MAPK/ERK/EGR1軸抑制劑)轉染的BMEC細胞活力增強，在S期停滯的細胞增多，并且凋亡受到抑制。這表明，上調miR-199b-3p可以通過阻斷MAPK/ERK/EGR1軸來抑制BMEC的凋亡，從而改善小鼠缺血性中風的損傷[16]。

干擾miR-143-3p表達，能夠促進OGD大鼠BMECs的增殖、周期轉化，并抑制凋亡。這一結果表明，下調miR-143-3p對于IS具有保護作用，它可能是腦卒中干預治療的又一個潛在的靶點[17]。

細胞死亡是當今極為活躍的一大研究領域，各種舊的觀點、認識被不斷打破，新的進展層出不窮。迄今為止，已有自噬性死亡、程序性壞死、焦亡及鐵死亡等一系列新的死亡形式被發現。這些死亡形式與IS腦微血管內皮細胞損傷有什么關系？而miRNA又在其中發揮了什么作用? 這些都還沒有得到充分的研究，因此，在這方面是大有可為的。相關的深入研究，對于進一步闡釋miRNA在缺血性腦損傷內皮功能障礙、BBB破壞中的作用是非常有意義的。

2 miRNA與周細胞

血管內皮細胞被周細胞覆蓋并共同由基膜包繞，周細胞是BBB的重要組成部分，它從相鄰細胞中接收、協調和處理信號，以產生不同的神經血管功能，包括微血管血流動力學的調節、BBB滲透性、毒性代謝物清除及血管生成[18]。在缺血損傷急性期，周細胞的缺失導致內皮與星形膠質細胞尾足連接斷裂、BBB破壞和腦水腫[18]。

周細胞在大腦中表達鞘氨醇-1-磷酸受體(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR2)和N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)。螢光素酶測定法確定miR-149-5p可以直接與S1PR2基因的3′UTR結合，在tMCAO大鼠和體外BBB模型中證明，miR-149-5p過表達顯著抑制周細胞的遷移和周細胞中N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)的表達，并改善BBB通透性；同時miR-149-5p對周細胞的保護作用被S1PR2沉默所逆轉，證實了miR149-5p調節局部缺血誘導BBB通透性通過靶向S1PR2而實現[19]。

此外，在高糖和缺血的條件下，周細胞還可以攝取血管內皮細胞分泌的miR-503，從而減少毛細血管的覆蓋范圍，增加毛細血管通透性[20]。由于miRNA在周細胞中的研究仍處于起步階段，因此需要在該領域進行更多更深入的研究以探索表觀遺傳調控，從而為IS治療提供有希望的靶標。

3 miRNA與星形膠質細胞尾足

星形膠質細胞尾足作為重要成分參與形成血腦屏障。缺血性腦損傷后，BBB完整性受到破壞，滲透壓的改變驅使水液進入星形膠質細胞，導致星形膠質細胞腫脹，功能障礙，最終死亡。

研究表明，水通道蛋白(aquaporin-4，AQP4)的上調與該過程密切相關，AQP4被認為是腦缺血后誘發血管性水腫的關鍵調節劑[21]。目前已知有兩個miRNA，即miR-320a[22]和miR-130a[23]可以作為AQP4的調節劑，其中miR-130a可以與AQP4 M1啟動子結合以抑制其轉錄，miR-130被鑒定為AQP4 M1亞型的強轉錄阻遏物。雙熒光素酶報告系統證實，AQP4也是miR-29b的下游靶標，通過對胚胎神經元與星形膠質細胞比較發現，miR-29家族在星形膠質細胞中富集，且表達強于神經元[24]。在腦缺血小鼠中，miR-29b的過表達可靶向降低AQP4的表達，進而減少BBB損傷、腦水腫及梗死面積[24]。更有意義的是，在IS患者外周血及MCAO小鼠的血液及大腦中miR-29b的表達均顯著下調，miR-29b表達與患者中風后NIHSS得分和MCAO腦梗死體積呈負相關，預示miRNA-29b可能成為預測中風后預后的一種新型循環生物標記物[25]。

綜上，目前對于miRNA在IS血腦屏障調節作用研究中，主要針對各個組分，單一細胞，某個特異的miRNA，特異的靶向基因；由于腦組織結構的復雜性，BBB結構的多元性，需要進一步研究BBB各組分如腦微血管內皮和周細胞、星形膠質細胞之間的相互作用，或尋找交叉的miRNA，或發現共同作用的靶基因，以此探索miRNA調控IS中BBB的核心網絡。

4 miRNA與MMPs

基質金屬蛋白酶9(MMP-9)，也稱為膠原酶B，是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)系列最重要的成員之一。正常腦組織中MMP-9低表達，在缺血性腦組織中MMP-9被過度激活，加重BBB泄漏、促進炎性反應及誘發神經細胞死亡[26]。MMP-9對BBB的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分及連接蛋白的降解起到關鍵作用，已被證明是BBB分解的關鍵效應物。缺血區的神經元、血管內皮細胞、膠質細胞及周細胞均可在炎癥刺激下分泌MMP-9，進而直接或間接破壞BBB，促進血管通透性，增加腦組織損傷[26]。

在大鼠大腦缺血/再灌注損傷模型和OGD/R處理的bEnd.3細胞中發現MMP-9表達上調，BBB通透性增高，miR-539模擬物可逆轉OGD/R誘導的腦微血管內皮細胞損傷；而在miR-539模擬物和pcDNA-MMP-9共轉染的細胞中，這種保護作用則被取消。這證明過表達的miR-539通過靶向阻斷MMP-9，抑制了BBB通透性的升高，達到腦保護的作用[27]。

小鼠側腦室注射外源性agomir-132后，過表達的miR-132通過抑制MMP-9 mRNA的表達，減少了VE-鈣粘蛋白(VE-cadherin)和β-catenin的降解來保護BBB完整性；表明miR-132/MMP-9軸可能是減輕缺血性腦卒中BBB損害的新型治療靶點[28]。

研究表明抑制MMP-9與組織纖溶酶原激活劑(the tissue plasminogen activator，tPA)聯合療法是有效的治療策略，通過使用靶向MMP-9的siRNA或shRNA，可減少因BBB破壞而導致危及生命的并發癥的發生。但是，MMPs抑制劑的后期給藥對中風患者具有負面影響，抑制了血管生成和神經再生。因此，應該更加確切地對MMPs的不同亞型及其對應的miRNA在不同時間段的作用進行研究，為精準調控MMPs、保護及修復BBB完整性提供依據[29]。

5 總結與展望

IS引發的腦微血管通透性增加和BBB破壞，導致腦水腫，乃至腦出血的發生。防止BBB破壞是中風干預中的重要治療策略。miRNA是通用的調節分子，幾乎影響BBB結構和功能的各個方面；miRNA參與調節病理過程，例如血管內皮細胞緊密結構的破壞、凋亡和炎癥，這些病理過程可能會加劇BBB功能障礙。對于腦卒中，雖然已經對循環miRNA的表達進行了研究，但miRNA在腦卒中后血腦屏障破壞中的具體功能仍然很大程度上未知[1-2]。深入探討miRNA調控BBB結構和功能的機制，可能有助于發現新的藥物靶標及開發基于miRNA的療法。

相對于單一藥物或單一基因靶點治療，miRNA的調控作用幾乎涵蓋了腦缺血的所有病理損傷形式。一些miRNA，如miR-149-5p，miR-539，miR-21和miR-130均表現出維持腦缺血血腦屏障完整性的作用，因此具有成為治療靶點的潛力。由于miRNAs種類和功能極其復雜，大多數專注于miRNA治療用途的研究仍處于動物實驗階段。在動物研究中，靜脈內注射miRNA agomir/mimic或miRNA hairpin inhibitor/antagomir是miRNA遞送的最常見方式。但是，受傷的大腦并不是這些特殊藥物的唯一靶標，因為miRNA inhibitor/antagomir也可能影響其他器官或系統。而且，一種miRNA可以作用于多種mRNA，從而調節一個基因網絡，同時一種mRNA也能夠受到多種miRNA的調控，因此，miRNA在臨床治療中的應用仍處在探索階段，在這方面，將需要更多的工作來填補臨床前研究與臨床研究之間的差距。

但根據miRNA涉及到的疾病譜和時間表達的特性，發現并選擇合適的miRNA作為腦缺血診斷和預后標志物是更切實可行的，與心肌梗塞不同，目前沒有血液檢測可診斷急性缺血性中風。miRNA由于其易于檢測且在血樣中具有良好的穩定性，已被研究人員建議作為缺血性卒中早期診斷的生物標志物[30]。一些miRNA，如前所述的miR-143、miRNA-15a/16-1、miRNAlet-7，以及miRNA-29b等已被鑒定為候選生物標志物，可在臨床試驗中發揮診斷作用。因此，在未來研究鑒定可預測腦缺血BBB損傷的miRNA是非常必要和可能的。

另外，由于miRNA調控多種補償途徑的能力，阻斷或增強單個miRNA可能會產生多方面的作用。因此，處于非生理濃度的miRNA可能具有未知的靶標，通過靶向正常細胞，影響穩態，可能導致不良反應，在應用于臨床治療之前，仔細全面地研究確定其mRNA靶標是必須的。