雷公藤甲素聯合硫酸軟骨素脂質體對關節炎大鼠的治療作用

郭睿博，孔 亮，張 璐，蔡馥伊，李學濤

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種與關節相關的自身免疫性疾病，在中醫上屬于“弊證”，它以關節軟骨糜爛和損傷、滑膜細胞增生和骨破壞為特征，該病的主要臨床特征為侵蝕性、對稱性的關節炎，其中雙手、腕、膝、踝和足關節的受累最為常見[1]。RA的病因十分復雜，主要包括遺傳、吸煙、微生物感染、激素刺激、寒冷刺激及飲食等[2]。RA發展的確切病理機制仍不清楚，炎性細胞因子如白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在RA的免疫發病機制中起著核心作用，炎癥因子的增加可誘導炎癥細胞浸潤和滑膜細胞增殖，導致發炎的滑膜浸潤到鄰近關節軟骨和骨，從而引起軟骨和骨骼的破壞[3]。目前廣泛用于RA的藥物有非甾體類抗炎藥(NSAIDs)、減病抗風濕藥(DMARDs)及糖皮質激素(GCs)等，但是這些藥物生物利用度較差，需要高劑量和頻繁的使用，因此產生了一些嚴重的副作用，如免疫缺陷、胃腸紊亂和體液紊亂等[4]。隨著中藥治療RA的研究不斷取得突破，中醫藥治療RA的療效顯著，副作用少，受到越來越多的關注。

雷公藤甲素(triptolide, TP)又稱雷公藤內酯醇，是一種從雷公藤中分離出來的有效的免疫抑制化合物，雷公藤甲素具有多種生物活性，如抗炎、抗增殖、免疫抑制和抗腫瘤等，被用于治療RA、免疫復合物腎炎、系統性紅斑狼瘡和器官組織移植等炎癥性和自身免疫性疾病[5-6]。然而，TP的溶解度較差，全身性毒副作用嚴重，藥代動力學半衰期短，導致其抗RA作用尚未在臨床上得到充分發揮[7-8]。

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)是葡糖胺聚糖一個亞族，是一種不分枝的、多分散的、復雜的大分子化合物。CS能顯著抑制水腫、滑膜炎和關節軟骨破壞，有利于修復關節損傷，再生軟骨細胞，增加關節滑液量, 具有減輕關節炎患者疼痛和增加活動能力的作用。它能抑制軟骨基質降解，對受損的軟骨有保護作用[9-10]。因此，為了降低TP毒性、更好發揮其療效及增加其骨保護的作用，本研究將TP與CS共同包封于脂質體中，探究其對CIA的治療作用。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠48只，雌雄各半，體質量(140-180)g，購于遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001。大鼠飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，恒溫(22-24)℃，濕度55%-60%。本研究中所有實驗方案均得到動物倫理委員會批準下進行動物研究。

1.2 藥材、藥品與試劑TP(成都普菲德生物技術有限公司，批號20051508，純度98.94%)；CS(大連美侖生物技術有限公司，批號D1128A，純度95.4%)；卵磷脂、膽固醇(美國Avanti Polar Lipids公司)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)(日本NOF公司)；雞Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司，批號：SLBT1422、SLBT1714、SLBV4134)；IL-1β、TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒(北京索萊寶生物有限公司，批號：20200817、20200901、20200704)；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 主要儀器JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；XS105型十萬分之一天平(Mettler Toledo)；Ti-S型熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；RM2235型石蠟切片機(德國萊卡公司)；HBS-1096A型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)。

2 方法

2.1 脂質體的制備采用薄膜分散-硫酸銨梯度法，用甲醇將TP、卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000振搖并超聲溶解，旋轉蒸發儀除去有機溶劑，形成薄膜后用硫酸銨溶液進行水化，用探頭超聲儀間歇超聲后，0.22 μm的微孔濾膜3次，制得雷公藤甲素脂質體(TP-Lips)。將該脂質體密封于透析膜袋中，使用PBS作為透析介質，之后與CS混合，水浴振搖24 h，制得雷公藤甲素聯合硫酸軟骨素脂質體(TP-CS-Lips)。制得的脂質體性質穩定，可用于后續的研究。

2.2 動物分組與造模將雞Ⅱ型膠原溶于新鮮配置的的乙酸溶液中，在4 ℃攪拌過夜。次日于冰上將膠原溶液加入到弗氏完全佐劑中，要逐滴加入、攪拌約2 h，將其乳化完全，用作初次免疫；繼發免疫劑的制備方法同上，只需將膠原溶液加入弗氏不完全佐劑即可。隨機挑選8只大鼠作為對照組(Control)，其余40只大鼠，在每只大鼠尾根部皮下注射100 μL初次免疫劑，7 d后，繼續注射繼發免疫劑加強免疫[11]。將造模成功的大鼠隨機分為5組，分別為模型組(Model)、TP組、TP-CS組、TP-Lips組及TP-CS-Lips組。

2.3 給藥方法TP組、TP-CS組、TP-Lips組及TP-CS-Lips組分別腹腔注射之前制備的TP、TP-CS、TP-Lips及TP-CS-Lips(TP：30 μg·kg-1,CS：100 mg·kg-1)，Control組和Model組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，治療周期為28 d。

2.4 體質量稱定分別于0 d(給藥前)和7、14、21及28 d相同時間段對各組大鼠進行體質量的稱定。

2.5 關節炎指數評價分別于0(給藥前)和7、14、21及28 d相同時間段對各組大鼠關節進行關節炎指數評分。評分依據為：關節無腫脹計0 分；關節輕微腫脹計1分；關節中度紅腫計2分；關節嚴重腫脹計3分；關節嚴重腫脹并出現功能障礙計4分。

2.6 胸腺指數與脾指數的測定將大鼠處死后，完整剝離胸腺與脾臟，用電子天平稱重，計算胸腺指數與脾指數。

2.7 HE染色將大鼠處死后，完整分離大鼠關節膝關節軟骨組織，將其放置脫鈣液中脫鈣，用4 %多聚甲醛進行固定、乙醇脫水、二甲苯透明、放入石蠟中進行包埋，然后切片、脫蠟，進行染色，于顯微鏡下觀察。

2.8 炎癥因子的測定大鼠連續治療28 d后，摘取眼球取血，3 000 r·min-1離心5 min后取上清，于-20 ℃條件保存。用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6的表達水平，樣品處理和實驗操作按說明書進行。

3 結果

3.1 各組藥物對大鼠體質量的影響如Tab 1所示，0-28 d，Control組大鼠的體質量顯著上升；Model組大鼠的體質量雖也呈上升趨勢，但是上升緩慢，與Control相比體質量降低，體質量差異具有統計學意義(P<0.05)；在治療28 d后，TP-Lips組大鼠相比Model組體質量明顯上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；在治療21 d后，TP-CS-Lips組相比Model組體重顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；而TP組、TP-CS組與Model組相比體質量沒有上升，反而有些許下降，差異無統計學意義。

3.2 各組藥物對大鼠關節炎指數評分的影響如Tab 2所示，與Control組相比，Model組大鼠關節炎指數上升明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療14 d后，TP-Lips組、TP-CS-Lips組與Model組相比，關節炎指數下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；在治療28 d后，TP-CS組大鼠與Model組相比，其關節炎指數下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，TP組與Model組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

Tab 1 The body weight of rats in groups with different treatment

Tab 2 The arthritis score of rats in groups with different treatment

Tab 3 The thymus and spleen index of rats in groups with different treatment n=8)

3.3 各組藥物對大鼠胸腺與脾指數的影響與Control組相比，Model組胸腺指數、脾指數上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；與Model組相比TP-Lips組、TP-CS-Lips組胸腺指數、脾指數下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；而TP組、TP-CS組與Model組相比，差異無統計學意義。

3.4 各組藥物對大鼠軟骨病理損傷的影響大鼠關節軟骨HE染色如Fig 1所示，Control組軟骨表面平整光滑，細胞排列均勻整齊、軟骨陷窩清晰可見，細胞核清晰可見，軟骨基質深染、著色均勻，潮線清晰完整；而Model組軟骨表面不光整且出現了增生，部分軟骨陷窩消失，部分細胞核壞死，軟骨基質淺染且著色不均，潮線模糊；各治療組相比于Model組，癥狀有所改善，其中TP-CS-Lips組對大鼠滑膜改善作用最顯著。

Fig 1 Effects of various formulations on pathological injury of rat cartilage

3.5 各組藥物對大鼠血清炎癥因子的影響如Tab 4所示，相比于Control組，Model組大鼠血清中的IL-1β、TNF-α及IL-6的水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；各治療組大鼠血清中的IL-1β、TNF-α及IL-6的水平相比于Model組均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，且TP-CS-Lips組IL-1β、TNF-α及IL-6的水平降低最為明顯。

Tab 4 The inflammatory cytokines in rat serum in groups with different treatment

4 討論

RA是一種自身免疫性疾病，表現為關節軟骨糜爛損傷、血管翳、滑膜炎癥和骨破壞。Ⅱ型膠原蛋白誘導的大鼠關節炎模型(CIA)在病理學上的表現與人類RA很類似，是目前公認的RA最佳模型[12]。本研究通過尾部注射雞Ⅱ型膠原弗氏佐劑以建立CIA大鼠模型。通過造模的大鼠與Control組相比食量減少，體重下降，精神萎靡，關節出現了嚴重的腫脹，嚴重影響了其活動能力。且Model組的大鼠胸腺指數、脾指數明顯增加；滑膜組織損傷嚴重；血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的水平提高，顯示CIA模型制備成功。

脂質體是一種將藥物包封于類生物膜的微小囊泡中，脂質體的制備簡便、生物利用度高，能夠顯著增加藥物的溶解度，并能降低藥物的毒性，具有靶向性、緩釋性特點，已被廣泛應用于RA的治療。Ren等[13]通過將地塞米松包載于脂質體中，發現地塞米松脂質體相比于游離地塞米松對CIA的治療作用大大增強。Gawne等[14]將糖皮質激素包封于脂質體中，發現給藥糖皮質激素脂質體比游離組在發炎的關節處的藥物攝取量高，治療效果優于游離組。TP可以抗炎、抗增殖、免疫抑制和抗腫瘤，但由于其溶解性差、毒副作用強，限制了它的臨床應用。Lu等通過大鼠給藥不同濃度TP，發現給藥后大鼠肝臟出現了嚴重的毒性，體重也下降[15]。為了降低TP的毒性，本研究中將TP包載于脂質體中，發現治療21 d后，TP-Lips組和TP-CS-Lips組大鼠相比于Model組，體重明顯上升。而TP組、TP-CS組大鼠體重相比于Model組雖然對關節炎有治療作用，但是體重卻下降，應是其毒性導致。

炎性細胞因子在RA的免疫發病機制中起著核心作用，它可以增加并誘導炎癥細胞浸潤和滑膜細胞增殖，導致發炎的滑膜浸潤到鄰近關節軟骨和骨，從而導致軟骨和骨骼的破壞。在RA患者體內TNF-α、IL-1β及IL-6大量存在[16]。TNF-α主要由巨噬細胞產生，是導致炎癥發生的關鍵炎癥因子之一，在RA患者血清中TNF-α水平顯著提高，它是導致滑膜炎癥和關節破壞的重要因素；IL-1β主要由巨噬細胞產生，它可以誘導血管內皮細胞粘附分子的表達、炎癥發生、軟骨細胞凋亡等。在許多病例中發現，血漿和滑膜液中IL-1β濃度增高；IL-6由多種細胞產生，如T細胞、B細胞、巨噬細胞、軟骨細胞、成纖維細胞等，IL-6通過作用于中性粒細胞，分泌活性氧中間體和蛋白水解酶，引起炎癥和關節破壞[17]。本研究中，TP-CS-Lips組的大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6的水平相比于Model組顯著降低。Ni R等通過熒光成像的方法，發現脂質體在CIA大鼠關節部位集聚，發揮了更好的療效[18]。本研究中，TP-Lips組和TP-CS-Lips組比TP組、TP-CS組治療效果更好，也說明TP包封在脂質體后更好的發揮了抗炎的作用。同時TP-CS-Lips組也降低了大鼠關節炎指數評分、胸腺指數和脾指數、改善了軟骨組織損傷。

綜上所述，TP-CS-Lips對CIA的治療作用明顯，且TP毒副作用被改善，使其充分發揮抗炎作用，同時又增加了CS的骨保護作用。TP-CS-Lips從抗炎和骨破壞兩方面同時入手，在臨床應用具有很大潛力。本研究為其進一步研究與開發提供了參考。