姜黃素通過降低壓力超負荷心肌肥厚大鼠循環微顆粒水平改善內皮功能發揮心臟保護作用

崔欣欣，白曉潔，王起越，李俊虎，曹茜倩，林媛媛，封啟龍

(1.山西醫科大學基礎醫學院生理學系，細胞生理學教育部重點實驗室，細胞生理學山西省重點實驗室，山西 太原 030001;2.太原市衛生學校臨床教研室，山西 太原 030012;3.山西醫科大學第三醫院 山西白求恩醫院心血管內科，山西 太原 030032)

病理性心肌肥厚是由高血壓、心律失常等多種原因引起的心臟組織結構的異常改變，如未給予及時有效的干預將最終發展為不可逆轉的心力衰竭[1]。然而，目前對心肌肥厚尚缺乏有效干預措施，許多臨床使用的藥物也僅限于在一定程度上緩解癥狀，因此，如何對心肌肥厚進行有效干預，仍是臨床亟需解決的熱點問題。天然化合物姜黃素(curcumin)對多種心血管疾病如動脈粥樣硬化、心律失常、心力衰竭等均表現出顯著的心血管保護效應，對心肌肥厚也具有一定的心臟保護作用，但其對循環微顆粒的影響尚未完全闡明[2-5]。近年來，許多研究發現，細胞微顆粒(microparticles，MPs)在多種心血管疾病的發生發展過程中具有重要作用[6]。MPs是細胞受刺激后從細胞表面脫落的直徑0.1-1 μm的細胞外囊泡，其內容物所包含的mRNA、蛋白質、微小核糖核酸等物質在細胞間信息傳遞過程中具有非常重要的作用[7]。MPs在健康人循環血液中就有少量存在，在病理狀態下如心肌肥厚、冠狀動脈疾病、腫瘤等疾病中含量則明顯升高。目前認為，MPs具有促進凝血反應、血栓形成、炎癥反應、上調血管張力、促進血管生成等多種作用，并參與了多種疾病的發生發展[8]，但其在心肌肥厚大鼠體內的改變及其確切作用尚不清楚。

本實驗利用腹主動脈縮窄術(abdominal aortic constriction，AAC)建立心肌肥厚大鼠模型，用姜黃素干預4周后觀察其對大鼠心臟功能的影響，同時檢測了各組大鼠循環血液中的微顆粒水平。探討姜黃素的心臟保護作用是否與微顆粒有關，進一步觀察了MPs對體外培養內皮細胞活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物和細胞株 SPF級健康SD ♂大鼠，體質量為(180-200)g，購于山西醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(晉)2015-0001；人臍靜脈內皮細胞株(HUVEC)購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2試劑 姜黃素購自上海易恩化學技術有限公司；DMEM低糖細胞培養基購于Hyclone公司；BCA蛋白質定量試劑盒、CCK-8試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清購自CellMax公司。

1.1.3器械 臺式低速離心機(SC-3612)購自安徽中佳科學儀器有限公司；高速離心機購自德國Eppendorf公司；超級恒溫水浴箱、BL-420F生物機能實驗系統購自成都泰盟科技有限公司；M模式超聲系統(Vivid 7)購于美國GE Healthcare公司；酶標儀(SMP6)購自美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1模型制備及動物分組 采用腹主動脈縮窄術建立壓力超負荷心肌肥厚大鼠模型。大鼠麻醉備皮后，沿腹正中線切開皮膚，鈍性分離皮下肌層，在腎動脈分叉處上方約1 cm游離腹主動脈，用4-0結扎線同時結扎墊扎針和腹主動脈，抽出墊扎針，抗菌處理后關閉腹腔。Sham組大鼠(n=10),只穿線不結扎，其余步驟相同。16周后超聲心動圖評價手術大鼠心功能，達到心肌肥厚標準的大鼠隨機分為AAC組(n=10，每日給予等量生理鹽水灌胃處理，持續4周)；姜黃素組(n=10，每日按100 mg·kg-1劑量給予姜黃素灌胃，持續四周)。每組10只大鼠中隨機抽取6只進行超聲和血壓檢測，4只用于左心室血流動力學檢測。動物發生死亡則補足至10只。

1.2.2超聲心動圖檢測心功能 10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，待肌肉松弛后行心前區備皮進行超聲心動圖檢測。觀察指標包括左室舒張末期內徑(LVIDd)、左室收縮末期內徑(LVIDs)、射血分數(EF)、短軸縮短率(FS)以及左室后壁厚度(LVPWd)。

1.2.3心率及血流動力學檢測 25%烏拉坦(4 mL·kg-1)麻醉大鼠，將其仰臥位固定于手術臺上，四肢連接上心電圖導聯線記錄心率(HR)變化；頸部備皮后沿頸正中線切開皮膚，鈍性分離皮下肌層，暴露右頸總動脈，穿線結扎遠心端，動脈夾夾閉近心端，穿線備用，使用眼科剪在右頸總動脈中上1/3處剪一小口，插入充滿含肝素生理鹽水的動脈插管，固定并結扎，待出現血壓波穩定10 min后記錄大鼠平均動脈壓(MAP);緩緩推動插管至左心室，記錄以下血流動力學指標：左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室內壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.4血漿樣本制備及提取微顆粒 參考文獻[9]，從左側頸總動脈收集血液于含3.8%枸櫞酸鈉采血管中，1 550×g離心20 min取上層乏血小板血漿(platelet-free plasma，PFP)，將PFP 15 000×g再離心45 min,棄上清，PBS液吹打沉淀得MPs懸液，-80 ℃保存備用。

1.2.5循環MPs蛋白含量檢測 嚴格按照BCA試劑盒說明配制標準品與工作液，取各組MPs加入工作液，每個樣品設置6個復孔，37 ℃孵育30 min，酶標儀檢測吸光度，按標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.6循環MPs對內皮細胞存活率的影響 取人臍靜脈內皮細胞株(HUVEC)，以2.5×104的密度鋪96孔板，貼壁后將Sham組、AAC組和姜黃素組微顆粒以100 m g·L-1的濃度加入培養基，Control組加入等量PBS，孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，1 h后，酶標儀檢測吸光度，按公式計算存活率。

2 結果

2.1 一般狀況和存活率實驗周期內，與Sham組相比，AAC組大鼠毛發干燥發黃、飲食、飲水量及活動度下降，姜黃素組大鼠的上述表現明顯改善。Sham組與姜黃素組大鼠無死亡，存活率為100%，AAC組大鼠在給藥開始后d 6和d 25各死亡1只，存活率為80%(Fig 1)。

2.2 超聲心動圖心功能測定與Sham組相比，AAC組LVIDd從(5.05±0.24)mm升高到(7.44±0.52)mm(P<0.01)，LVIDs從(2.01±0.22)mm升高到(4.02±0.47)mm(P<0.01)、LVPWd從(2.17±0.10)mm升高到(2.66±0.16)mm(P<0.05)，EF從93.00%±1.35%下降至80.00%±4.49%(P<0.05)、FS從60.50%±2.53%下降至46.38%±4.90%(P<0.05)，表明造模成功。使用姜黃素(圖中簡稱Cur)后，上述指標均有明顯改善，其中LVIDd、LVIDs和LVPWd分別下降至(6.09±0.22)mm(P<0.05)、(2.38±0.17)mm(P<0.01)、(2.20±0.10)mm(P<0.05)；EF以及FS分別升高至92.88%±0.95%(P<0.01)，61%±1.80%(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 1 Kaplan-Meier survival curves for rats with pressure overload-induced hypertrophy

2.3 動脈壓與心率術后20周，與Sham組相比，AAC組大鼠MAP較Sham組升高明顯(139.84±6.76)vs(88.89±12.42)mmHg，(P<0.01)，姜黃素治療后，MAP明顯降低(117.08±5.57)mmHg，(P<0.05)(Fig 3B、C)。AAC組大鼠HR增加(401±26vs233±8)，(P<0.01)，如Fig 3A所示，使用姜黃素后，心率有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)(Fig 3D)。

Fig 2 Assessment of global cardiac function using echocardiography in rats with pressure overload-induced hypertrophy 4 wks after treatment

Fig 3 Measurement of heart rate and blood pressure in rats with pressure-overload hypertrophy

Fig 4 Results of hemodynamics after treatment in rats with pressure overload-induced hypertrophy

2.4 血流動力學指標術后20周，AAC組大鼠LVSP較Sham組顯著下降(100.22±8.95vs159.51±2.56 mmHg，P<0.01)，+dp/dtmax(4.11±0.46vs8.40±0.31 mmHg/ms)和-dp/dtmax(3.39±0.37vs6.95±0.47 mmHg/ms)均明顯下降(P<0.01)，LVEDP明顯升高(4.55±1.05vs-11.63±1.90 mmHg，P<0.05)，心臟收縮和舒張功能出現障礙。姜黃素組大鼠的上述指標LVSP(142.02±5.30 mmHg，P<0.01)、LVEDP(-5.34±1.65 mmHg，P<0.05)、+dp/dtmax(6.56±0.63 mmHg/ms，P<0.01)以及-dp/dtmax(5.12±0.56 mmHg/ms，P<0.05)均得到明顯改善(Fig 4A-D)。

2.5 循環MPs蛋白含量測定利用BCA試劑盒進行循環血MPs蛋白含量測定。結果顯示，AAC組大鼠血液中混合微顆粒蛋白含量較Sham組明顯升高(371.43±5.62)vs(120.8±3.44)mg·L-1(P<0.01)，姜黃素干預后，微顆粒蛋白含量明顯降低(245.05±3.80)mg·L-1(P<0.01)(Fig 5)。

2.6 微顆粒對內皮細胞存活能力的影響將對照組的HUVEC存活率設為100%，細胞存活率的統計結果表明，與Sham組大鼠循環血MPs共孵育的HUVEC存活率為(98.88%±4.30%)，AAC組存活率明顯下降(80.18%±6.17%，P<0.05)，姜黃素組微顆粒共孵育的HUVEC的存活率明顯升高(93.61%±2.26%，P<0.05)(Fig 6)。

Fig 5 Results of different groups of protein concentration

Fig 6 Cell survival rate of HUVECs treated with rat circulating microparticles

3 討論

循環微顆粒與多種心血管等疾病的發生發展均具有密切關系。一方面，在冠狀動脈疾病、心力衰竭、高血壓、心律失常、動脈粥樣硬化、高血脂等多種疾病或病理情況下，均發現有血中微顆粒的明顯升高[10]，提示含量改變有可能作為臨床凝血異常、炎癥狀態和血管功能障礙的疾病標志物[11-12]。Mallat等[13]也報道有冠心病家族史健康個體的內皮MPs水平明顯高于無冠心病家族史的健康個體，急性冠脈綜合征患者的循環血液中存在高含量的促凝性內皮MPs，可能是冠狀動脈內血栓產生和存在的重要因素之一。另一方面，升高的MPs也主動參與了多種疾病的發生和發展進程[14-15]，且其升高程度往往與疾病嚴重程度呈正相關[16]。

前期本實驗室發現，大鼠心力衰竭后微顆粒水平明顯升高，且對內皮細胞遷移具有明顯抑制作用[17]。眾所周知，內皮細胞作為血管系統的重要成分，其功能的改變與心血管疾病的發生發展密切相關[18]。本實驗我們發現，心肌肥厚大鼠血液中微顆粒水平亦表現為明顯升高。那么，升高的微顆粒是否與心肌肥厚有關？通過體外實驗研究發現，MPs與HUVEC共孵育后，可明顯降低內皮細胞的存活率，提示MPs直接參與了血管內皮的損傷。

姜黃素是從姜黃中提取的一種黃色多酚類化合物，近年來，多項研究表明姜黃素具有顯著的心臟保護作用[2-5]。本研究利用縮窄腹主動脈建立大鼠慢性心肌肥厚模型，觀察了姜黃素對慢性心肌肥厚的影響。結果顯示，姜黃素可以明顯提高模型大鼠存活率，降低MAP，改善LVIDs、LVIDd和LVPWd，提高EF與FS，同時使LVSP升高、LVEDP降低，證實姜黃素具有明顯的心臟保護作用。進一步的研究發現，經姜黃素干預后，肥厚大鼠循環MPs水平明顯下降，且可顯著提高體外實驗中HUVEC的存活率。

綜上所述，姜黃素對壓力超負荷型心肌肥厚具有顯著的心臟保護效應，這一作用與姜黃素有效降低循環血中MPs水平，提高內皮存活率有關。關于MPs確切的有效成分，尚有待進一步的實驗研究證實。