基于KDSR基因探究花旗澤仁改善HepG2細胞胰島素抵抗機制研究

陳思琦，李佳欣，葛鵬玲

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多病因的代謝性疾病，其特征是由于胰島素釋放紊亂、胰島素作用失調或兩者兼而有之造成的慢性高血糖[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病的90%以上，目前認為T2DM的主要發病機制為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，IR貫穿了2型糖尿病發生發展的全過程[2-3]，同時也是高血壓、冠心病、動脈硬化、肥胖等多種疾病共同聯系的病理基礎。神經酰胺(ceramides，Cer)是鞘脂(sphingolipid，SPL)的重要中間代謝產物，對鞘脂類的生物合成具有重要意義[4]。近年來研究表明[5]，神經酰胺代謝異常參與胰島素抵抗等疾病的病理生理過程，神經酰胺可通過抑制Akt 磷酸化從而影響胰島素信號通路，進而導致胰島素抵抗的發生。

在前期研究中，我們發現IR細胞中KDSR(3-ketodihy-drosphingosine reductase，3-酮二氫鞘氨醇還原酶)基因表達上調，且通過調控神經酰胺/PKCζ/Akt/Foxo1信號通路而引發IR。花旗澤仁是治療2型糖尿病胰島素抵抗療效確切的臨床經驗方，包括西洋參、澤瀉、薏苡仁三味中藥，本課題組前期已證實花旗澤仁具有明顯的改善胰島素抵抗的作用，本文以前期研究為基礎，從KDSR基因角度探討花旗澤仁改善IR的作用機制。

1 材料

1.1 HepG2細胞系HepG2人肝癌細胞株(FH0067)，購于上海中醫藥大學，保存于黑龍江中醫藥大學方劑學重點實驗室。

1.2 試劑西洋參(批號：120997)、澤瀉(批號：020001421)和薏苡仁(批號：17052009)購于河北潤和醫藥有限公司，羅格列酮(批號：122320-73-4)購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；KDSR過表達質粒由通用生物系統有限公司提供；β-actin由英國Abcam公司提供；KDSR抗體、PKCζ抗體、p-PKCζ抗體、Akt2抗體、p-Akt2抗體、Foxo1抗體、p-Foxo1抗體由美國CST公司提供；神經酰胺C14(d18 ∶1/14 ∶0)標準品、神經酰胺C16(d18 ∶1/16 ∶0)標準品、神經酰胺C17標準品、神經酰胺C18 ∶1(d18 ∶1/18 ∶1(9Z))標準品、神經酰胺C18(d18 ∶1/18 ∶0)標準品、神經酰胺C20(d18 ∶1/20 ∶0)標準品、神經酰胺C24 ∶1(d18 ∶1/24 ∶1(15Z))標準品、神經酰胺C24(d18 ∶1/24 ∶0)標準品由美國Avanti Polar Lipids公司提供；GOD-POD檢測試劑盒購于北京雷根生物有限公司。

1.3 儀器超凈工作臺(北京瀘凈凈化設備廠)；恒溫CO2培養箱(美國Thermo Fisher公司)；生物安全柜SCB-1360(北京東聯儀器制造公司)；電泳儀(美國BIO-RAD公司)；紫外分光光度計(島津有限公司)；半干轉膜儀(美國BIO-RAD公司)；酶標儀(日本Olympus公司)；IX70倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ISO134083凍干機(美國Agilent公司)；安捷倫1290超高效液相色譜(美國Agilent公司)；安捷倫6460三重四級桿串聯質譜(美國Agilent公司)；正壓裝置(美國Waters公司)；渦旋儀器(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 HepG2細胞的培養500 mL高糖培養基(DEME)中加入10%胎牛血清(FBS)，以及1%青霉素-鏈霉素混合液，搖勻，4 ℃保存備用。從-192 ℃的液氮罐中取出細胞，迅速放入37 ℃水浴鍋中快速搖晃復蘇。加入2 mL混合好的DMEM培養基，以37 ℃，5% CO2的條件培養備用。

2.2 胰島素抵抗模型的建立根據本課題組前期對HepG2細胞胰島素抵抗(IR)模型建立條件的模索，利用高糖高胰島素處理HepG2細胞，誘導其產生胰島素抵抗。向配制好的高糖培養基中加入10-10mol·L-1胰島素，混勻，培養HepG2細胞48 h，使其發展成IR模型，胰島素作用時間、濃度及模型的穩定性在本課題組前期工作中已驗證。

2.3 花旗澤仁凍干粉的制備取花旗澤仁各中藥西洋參15 g、澤瀉15 g、薏苡仁30 g，浸泡12 h，第一次加12倍水煎煮，水沸后文火煎煮60 min；第二次加8倍水煎煮，水沸后繼續用文火煎煮45 min，第三次加6倍水，水沸后文火煎煮30 min，合并三次水煎液，過濾后水浴濃縮至每毫升含生藥量1 g，采用冷凍干燥機真空冷凍干燥而成。4 ℃保存，使用前水浴加溫至37 ℃。

2.4 花旗澤仁的給藥劑量本課題組前期對花旗澤仁在HepG2胰島素抵抗細胞模型上的給藥劑量及作用時間進行摸索，得出花旗澤仁最佳給藥濃度為1/9 g·L-1，作用時間為24 h。

2.5 陽性對照藥羅格列酮的準備實驗前稱取羅格列酮粉末，加蒸餾水配制成所需濃度0.04 g·L-1的溶液。4 ℃保存，使用前取出，達到常溫后使用。

2.6 KDSR過表達質粒的合成與轉染由通用生物系統(安徽)有限公司針對人KDSR基因，根據人工構建的方式在目的基因上游加入調控元件，合成特異性KDSR基因過表達質粒(KDSR-OE)，以腺病毒包裹，冷凍保存，同時制備未包裹過表達質粒的腺病毒(NC)。

2.7 超高效液相色譜-質譜聯用技術

2.7.1母液的配置 分別精密稱取神經酰胺C14、C16、C17、C18 ∶1、C18、C20、C24 ∶1、C24標準品適量，并用異丙醇定容至1 g·L-1，所有母液均貯存在-20 ℃條件下備用。

2.7.2工作溶液的配制 將上述標準品溶液采用10%甲醇稀釋得到上述標準品溶液的濃度：C14、C24 ∶1和C24為6.25 mg·L-1；C16和C18 ∶1為 3.125 mg·L-1；C18和C20為12.5 mg·L-1。內標(C17)由蛋白沉淀劑配置而成，濃度為 100 μg·L-1。

2.7.3標準曲線和質控樣本溶液的配制 利用上述工作溶液與0.5×PBS 溶液(模擬基質)配制標準曲線溶液，標準曲線溶液為七個等級，各個物質的標準曲線濃度范圍在本課題組前期實驗中已完成測定。質控樣本在分析前新鮮配制，分為低、中、高三個等級，每個等級分別對應標準曲線的第2、4、6濃度點。

2.7.4色譜與質譜條件 有機相和水相中同時加入0.2%的甲酸以保證洗脫系統中pH值恒定。神經酰胺C17作為內標：流動相為含有0.2%甲酸的甲醇和0.2%甲酸的水相，流速為0.3 mL·min-1，柱溫設置在30 ℃。所選質譜柱為 waters Xbrige BEH C18(2.1×50 mm,2.5 μm)。分別精密稱取神經酰胺C14，C16，C17，C18 ∶1，C18，C20，C24 ∶1，C24標準品適量，并用異丙醇定容至 1 g·L-1，所有母液均貯存在-20 ℃條件下備用。

液相洗脫梯度如Tab 1所示。

Tab 1 Liquid phase conditions of HPLC-MS/MS

采用電噴霧離子化源，干燥氣溫度為350 ℃，鞘流氣溫度為325 ℃，采用多反應監測(MRM)模式對待分析化合物進行監測。具體MS參數如Tab 2所示。

Tab 2 Mass spectrum conditions

2.7.5樣品處理 將研究樣品(100 μL)轉移到EP管中。向每個管中添加蛋白質沉淀溶液(400 μL)，蛋白沉淀劑為異丙醇-氯仿(9 ∶1)，渦旋振蕩3 min，以3 000×g離心10 min，然后將250 μL上清液轉移到干凈的進樣小瓶中，并進行LC-MS/MS分析。本研究采用0.5×PBS的作為空白樣品作為對照，排除基質的干擾。

2.7.6方法專屬性 分別配制空白溶液、標準品溶液、待測樣品，同“樣品處理”方法操作后，進樣分析，對比空白溶液、含有混合對照品的腸菌液和待測樣品色譜圖。觀察待測組分和內標物的出峰位置。

2.7.7標準曲線的制備 在本研究中，標準曲線包括7個水平，標準曲線樣本經過樣本前處理方法處理分析后，以待分析化合物的質譜相應值與對應內標的質譜響應值的比值為因變量，以待測化合物的濃度為自變量進行分析。標準曲線在本課題組前期工作中已完成測定。

2.7.8精密度和準確度的測定 取3個濃度的QC樣本，經過樣本前處理后進樣分析，并連續3 d平行配制，進樣后通過標準曲線計算濃度。計算每日(日內)和3 d(日間)樣本的測定結果精密度，以變異系數(CV)表示，應小于15%；準確度通過真實值和標示量的差異進行計算，以相對誤差表示(RE)，應小于±15%。

2.7.9提取回收率和基質效應 配制低、中、高濃度的質控樣本，經過既定的前處理方法進行處理，經過進樣分析得到待測化合物的響應值為A；取空白0.5×PBS樣本進行前處理，加入標準品水溶液制備和QC樣本濃度一致的溶液，進樣分析，得到待測化合物的響應值B；取標準品水溶液，制備和QC樣本濃度相同的溶液，進樣分析，得到待測化合物的響應值C，A與B的比值即為提取回收率，B與C的比值為基質效應。

2.7.10樣品檢測 分別取各組樣品，按“2.7.5樣品處理”方法制備供試品溶液，依照上述方法進行檢測，記錄各色譜峰面積，代入標準曲線，計算樣品各成分的含量。

2.8 實時熒光定量PCR傾倒培養液，加入PBS溶液洗滌細胞，滴加Trizol溶液反復吹打，室溫放置5 min；離心取上層清液并轉移至離心管，加入氯仿溶液，渦旋振蕩，常溫放置5 min；12 000×g離心15 min。將上層透明水相取出滴加異丙醇混勻，室溫靜置；離心去上清液，加入70%乙醇渦旋混勻，離心棄上清，室溫下干燥10 min；滴入失活水溶解，-80 ℃低溫存放。根據試劑盒說明書所述步驟進行試驗。

2.9 蛋白印跡法洗滌細胞后加入細胞裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL蛋白酶抑制劑+10 μL磷酸酶抑制劑)使細胞充分裂解；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min；配制分離膠及濃縮膠，用微量進樣器加待測樣品及Maker；以電壓80 V開始電泳；電泳結束后，取出凝膠放入轉膜液中，將準備好的PVDF膜先放入甲醇中30 s，后轉移到轉膜液中，恒流轉膜45-50 min；放入裝有適量的5%牛奶封閉液的平皿中封閉1 h；洗膜3次；分別將一抗，即KDSR抗體、PKCζ抗體、p-PKCζ抗體、Akt2抗體、p-Akt2抗體、Foxo1抗體以及p-Foxo1抗體用TBST稀釋比例為1 ∶1 000，將PVDF膜放入一抗中4 ℃過夜；洗膜3次；將二抗用TBST稀釋比例為1 ∶5 000，將PVDF膜放入二抗中37 ℃，孵育1 h；洗膜3次；顯影拍照。

2.10 葡萄糖檢測試劑盒配置好GOD-POD工作液，將標準品按梯度依次稀釋到2.5，1.25，0.625，0.3 125，0.15 625 mmol/L。取上述各組處理后的細胞適量(>106)，離心保留細胞沉淀，加入200 μL 1% Triton X-100冰上裂解30 min。設立空白組，標準組和樣品組，統一加入300 μL GOD-POD工作液，空白孔加入dd H2O，標準組分別加入上一步配置好的標準品，樣品組加入需測定的樣品，充分混勻，37 ℃孵育15 min。用酶標儀測定505 nm處的吸光度(OD值)，以空白孔調零，讀取標準組，樣品組的吸光度，根據標準組繪制標準曲線，根據標準曲線計算樣品組的樣品濃度，再根據葡萄糖含量換算公式計算葡萄糖含量。

3 結果

3.1 花旗澤仁對KDSR基因及蛋白表達的影響

3.1.1花旗澤仁可降低KDSR mRNA的高表達 qRT-PCR實驗結果如Fig 1所示，與對照組相比，IR細胞中KDSR mRNA表達較高，與IR組相比，給予花旗澤仁后IR細胞中KDSR表達明顯下降，差異具有顯著性(P<0.01)；于正常HepG2細胞中過表達KDSR(KDSR-OE)后給予花旗澤仁，與KDSR-OE組相比，KDSR表達也存在一定程度的下降，差異具有顯著性(P<0.01)。綜上，花旗澤仁可降低KDSR基因的高表達。

Fig 1 Effect of Huaqizeren on KDSR mRNA expression

3.1.2花旗澤仁可降低KDSR 蛋白的高表達 結果如Fig 2(A、B)所示，與對照組相比，IR細胞中KDSR蛋白表達上調，與IR組相比，給予花旗澤仁后IR細胞中KDSR蛋白表達有所下降，差異具有顯著性(P<0.01)；轉染KDSR-OE的正常HepG2細胞中KDSR蛋白上調，給予花旗澤仁后KDSR蛋白表達量有所下降，差異具有顯著性(P<0.01)，故花旗澤仁可降低KDSR蛋白的高表達。

Fig 2 Effect of Huaqizeren on KDSR protein expression

3.2 花旗澤仁對細胞神經酰胺含量的影響利用HPLC-MS/MS技術檢測各組神經酰胺各單體及總神經酰胺含量，結果如Tab 3、Fig 3所示，與IR組相比，給藥花旗澤仁后細胞總神經酰胺含量明顯下降，且與空白組接近，差異具有顯著性(P<0.01)；而當KDSR-OE組給予花旗澤仁后，細胞神經酰胺含量也有一定程度下降，且差異具有顯著性(P<0.01)。故花旗澤仁可降低IR細胞中神經酰胺含量。

Tab 3 Contents of ceramide in different samples(μg·L-1)

Fig 3 Total ceramide content in cells of each group

3.3 花旗澤仁對神經酰胺通路PKCζ/Akt/Foxo1的影響Western blot結果顯示，如Fig 4、5、6(A、B)所示，與對照組相比，IR細胞中PKCζ磷酸化水平上調、Akt2磷酸化水平下降、Foxo1磷酸化水平上升，差異具有顯著性(P<0.01)；與IR組相比，給藥花旗澤仁后PKCζ磷酸化水平下降、Akt2磷酸化水平上升、Foxo1磷酸化水平下降，差異具有顯著性(P<0.01)；與對照組相比，正常HepG2細胞中轉染KDSR-OE后PKCζ磷酸化水平上調、Akt2磷酸化水平下降、Foxo1磷酸化水平上升，差異具有顯著性(P<0.01)；轉染KDSR-OE后給予花旗澤仁，PKCζ磷酸化水平下降、Akt2磷酸化水平上升、Foxo1磷酸化水平下降，差異具有顯著性(P<0.01)。故花旗澤仁可改善IR細胞中神經酰胺通路PKCζ/Akt/Foxo1過度激活的狀態。

Fig 4 Effect of Huaqizeren on PKC zeta phosphorylation level

Fig 5 Effect of Huaqizeren on AKT2 phosphorylation level

Fig 6 Effect of Huaqizeren on FoxO1 phosphorylation

3.4 花旗澤仁對細胞葡萄糖消耗的影響我們采用花旗澤仁濃度為1/9 g·L-1進行給藥，并以0.04 g·L-1羅格列酮作為陽性對照藥，檢測細胞葡萄糖含量。結果如Fig 7所示，與對照組相比，IR細胞中葡萄糖含量明顯升高，差異具有顯著性意義(P<0.01)；與IR組相比，給藥花旗澤仁后IR細胞葡萄糖含量明顯下降，且與空白組接近，差異具有顯著性意義(P<0.01)；根據本課題組前期研究所得結果可知，KDSR-OE可提高細胞葡萄糖含量至IR程度，而當KDSR-OE組給予花旗澤仁后，細胞葡萄糖含量也有一定程度下降，且差異具有顯著性意義(P<0.01)。故花旗澤仁可在一定程度上降低IR細胞中葡萄糖含量，改善細胞胰島素抵抗狀態。

Fig 7 Effect of Huaqizeren on cell glucose content

4 討論

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的病理基礎和主要特征，也是高血壓、高脂血癥、冠心病等疾病的主要病因[7]。研究表明[8]，多種中藥及其有效成分通過減弱IR在治療2型糖尿病中發揮重要作用，已成為近年來防治IR的研究熱點。中藥復方花旗澤仁為臨床治療2型糖尿病IR的有效經驗方，其治療病癥明確，藥物療效確切，主要活性成分相對清楚。本方基于中醫藥整體觀念和辨證論治的理論，從2型糖尿病IR脾虛濕盛，濕熱內蘊的病理特點出發，以補氣養陰、清火生津之功的西洋參為君藥，滲濕健脾的薏苡仁為臣藥，利水滲濕、泄熱之澤瀉為佐藥，配伍組成花旗澤仁中藥復方，共奏補氣、健脾、生津、清熱、利濕之功。本課題基于中醫藥對IR的防治作用，探討花旗澤仁改善IR的作用機制。

本課題組前期已進行了花旗澤仁的成藥性研究，其中包括確定花旗澤仁(西洋參、澤瀉、薏苡仁)的最佳藥量配比；完成體內實驗的相關藥效學指標和體外實驗的相關藥效學指標[9]；確定花旗澤仁藥代動力學特征；明確腸道菌群對花旗澤仁的影響[10-11]；完成安全性早期評價實驗；在體內研究中我們發現，花旗澤仁可明顯降低胰島素抵抗大鼠的空腹血糖，使其胰島素敏感性升高；在體外研究中，我們也證實了花旗澤仁具有改善肝臟、脂肪、骨骼肌細胞胰島素抵抗的作用[12-14]，但其作用機制仍需進一步探究。

在前期的研究中我們發現，花旗澤仁對IR關鍵信號分子Akt的活性具有一定影響，而我們前期篩選的KDSR基因對Akt上游信號分子神經酰胺具有一定的調控作用，并通過神經酰胺下游PKCζ/Akt/Foxo1信號通路參與IR的發生。本課題組前期研究已證實，IR細胞中KDSR基因的表達水平升高、神經酰胺含量明顯提高、神經酰胺下游PKCζ/Akt/Foxo1信號通路活化程度異常，且細胞中葡萄糖含量較高，而抑制IR細胞中KDSR基因的表達可降低神經酰胺含量、減少PKCζ/Akt/Foxo1信號通路表達異常的狀態，同時細胞的葡萄糖含量有所下降；當正常HepG2細胞中KDSR基因過表達時，可使正常HepG2細胞中神經酰胺含量升高、PKCζ/Akt/Foxo1信號通路活化程度異常，同時也使正常HepG2細胞產生與IR細胞類似的葡萄糖含量升高的情況。這表明，KDSR基因的高表達通過提高神經酰胺含量并調節其下游PKCζ/Akt/Foxo1信號通路參與IR的發生，這可能是IR發生的機制之一。基于此結論，我們探究花旗澤仁是否通過調節KDSR基因的表達改善IR。

本部分實驗對IR細胞給藥花旗澤仁，同時對正常HepG2細胞進行KDSR基因過表達實驗，轉染KDSR過表達質粒(KDSR-OE)，并給予花旗澤仁處理，觀察這兩種細胞KDSR基因表達情況、神經酰胺含量、PKCζ/Akt/Foxo1信號通路活性及葡萄糖含量，深入探討花旗澤仁改善IR的作用機制。結果顯示，給藥花旗澤仁后，IR細胞及KDSR過表達細胞中KDSR的表達水平明顯下降，神經酰胺含量降低，且PKCζ/Akt/Foxo1信號通路表達異常的狀態有所改善，同時，給藥后兩種細胞中葡萄糖含量明顯下降。

綜上所述，花旗澤仁改善IR的作用機制之一可能是通過下調IR細胞中KDSR基因的表達，降低IR細胞內神經酰胺的含量，調節PKCζ/Akt/Foxo1信號通路的活化狀態，進而改善IR。