新冠肺炎并發細胞因子風暴的臨床前藥效評價方法研究進展

丁會芹，秦 歡，王建剛，劉 飛，陳雪紅，韓彥弢

(1.青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071；2.康立泰藥業有限公司，山東 青島 266112；3.山東省藥學科學院，山東 濟南 250101)

2019年12月份以來，由新型冠狀病毒-2(SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19，簡稱新冠肺炎)已在全球200多個國家、地區迅速傳播，截至2020年12月全世界已累計確診約6 700萬人，導致2.3%的死亡率[1]。基于活檢和尸檢的研究表明，COVID-19的病理特征表現為嚴重的肺部炎癥、支氣管肺泡損傷和淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤。除了冠狀病毒對呼吸上皮細胞和血管內皮細胞的直接損傷外，這些癥狀還基于過度的炎癥反應。越來越多的證據表明，在SARS-CoV-2感染患者中，過度和異常的宿主細胞因子風暴是導致強烈免疫病理和致命疾病的關鍵因素[2]。

細胞因子風暴是指一種不受控制的過度炎癥反應，局部開始并通過體循環在體內進一步擴散，其形成機制與免疫系統的失調有關。當免疫系統對SARS-CoV-2產生有效的適應性反應時，病毒可被清除，即輕度COVID-19患者可實現自愈。然而，當人類機體不能產生適當的適應性免疫反應時，病毒的持續存在以及隨之而來的固有免疫機制的延長和放大，使免疫反應功能失調，從而導致細胞因子風暴的高炎癥狀態[3]。《柳葉刀》發表的一篇回顧性研究中以武漢大學中南醫院41名COVID-19患者為研究對象，發現危重型患者血漿中IL-2、IL-7、IL-10、G-CSF、IP10、MCP-1、TNF-α等均明顯升高，證明了SARS-CoV-2感染病人，特別是垂死的病人，血漿中炎癥相關細胞因子的濃度顯著增加[4]。綜上，SARS-CoV-2感染導致了嚴重的細胞因子風暴，細胞因子風暴的治療是搶救危重病人的重要環節。

目前還沒有針對SARS-CoV-2誘發的細胞因子風暴的特效藥。但由于疫情的迫切，已有一些藥物被緊急批準用于COVID-19并發細胞因子風暴的治療[5]。如IL-6受體拮抗劑Tocilizumab、JAK抑制劑Baricitinib、糖皮質激素等。但這些藥物均為基于以往的應用經驗與作用機制，被緊急批準用于新冠肺炎中抗細胞因子風暴的治療，而缺乏足夠的臨床前藥效學評價、安全性評價等數據。作為重要的致死因素，細胞因子風暴的臨床前研究必不可少，相關的體內外實驗也是今后開發新藥的必經之路。目前，治療細胞因子風暴的臨床前藥效學研究沒有統一的標準，缺乏指導依據。本文作者在查閱近年來文獻報道后，綜述了細胞因子風暴治療藥物的臨床前體內外實驗，旨在對細胞因子風暴的實驗設計方法予以參考指導。

1 抗細胞因子風暴藥物動物藥效學評價模型的建立與選擇

1.1 小鼠模型

1.1.1病毒誘導的細胞因子風暴模型 病毒誘導模型是研究COVID-19最直接、有效的選擇，但病毒研究存在一定的危險性，尤其SARS-CoV-2病毒傳染性強，對于實驗室等級與人員資格都要求極高，所以一定程度上限制了這種模型的選擇。目前直接使用SARS-CoV-2感染引起的細胞因子風暴的小鼠體內研究報道較少，因此需參考其他病毒的建模操作方法。為了研究溶瘤病毒治療引起的細胞因子風暴不良反應機制，任淑琪[6]建立了單純孢疹病毒I型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)或其基因改造病毒誘導的細胞因子風暴模型。相似的，在研究流感病毒感染期間的細胞因子風暴時，Walsh等[7]利用小鼠肺炎病毒(PVM)菌株經鼻感染；Chen等[8]用小鼠適應株A/PR8病毒經鼻感染。參考上述方法，病毒誘導細胞因子風暴的模型建立方法可通過小鼠滴鼻注入SARS-CoV-2病毒誘導細胞因子風暴模型，或采用以上病毒誘導細胞因子風暴的成熟模型開展研究。

此外，Mahajan等[9]在研究單核/巨噬細胞對細胞因子風暴綜合征發育的直接貢獻以及參與其激活的信號通路時，利用了淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)誘導細胞因子風暴。研究人員給予穿孔素敲除(Prf-/-)小鼠腹腔注射LCMV。穿孔素缺乏小鼠意味著T細胞對病毒的細胞毒性反應缺陷，所以在感染LCMV后，LCMV激發強烈的CD8+T細胞反應，但T細胞缺陷導致T細胞積累和巨噬細胞活化，從而發展一個有害的過程。這項研究并不針對任何病毒感染，只是單純模擬細胞因子風暴進行機制研究，所以研究者選擇了安全風險較低的LCMV病毒模擬病毒誘發的細胞因子風暴模型。

1.1.2LPS誘導的細胞因子風暴模型 脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是公認的炎癥刺激劑，能夠誘導體內促炎因子分泌，同時也是急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的常用造模方法。其造模依據是作為病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)模擬病毒入侵。PAMPs是對于病原微生物表面的一種獨特的分子結構的命名，而在人體先天免疫系統的細胞上有識別PAMP的模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)，PRRs對一些病毒、細菌表面的PAMPs進行識別后可激活免疫系統保護[10]。因此LPS模擬SARS-CoV-2 RNA入侵細胞的病理機制，被固有免疫系統識別，激活免疫細胞，在免疫失控時爆發細胞因子風暴。

Su等在尋找潛在的抗COVID-19細胞因子風暴劑時，便利用LPS誘導了小鼠細胞因子風暴模型。小鼠單次腹腔注射LPS即可在血清和支氣管肺泡灌洗液中檢測到炎性細胞因子水平顯著提高，當把LPS劑量提高到致死劑量，可用于檢測藥物對小鼠生存時間曲線的影響[11]。在《Nature》上發表的一篇關于CAR-T療法所致細胞因子風暴不良反應的研究中，研究者對BALB/C小鼠腹腔注射LPS以模擬細胞因子風暴的發生[12]。趙晟[13]則提出，LPS的造模方法是模擬細菌感染的過程，他的研究中同樣使用腹腔注射的方法給與BALB/C小鼠LPS。文獻中一般選擇大腸桿菌0111 ∶B4來源的LPS。

1.1.3TLR激動劑誘導的細胞因子風暴模型 與LPS誘導細胞因子風暴模型的原理相似，LPS因被認為是一種PAMPs而用于誘導動物模型，那么Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)則是免疫細胞和包括神經元在內的非免疫細胞表達的主要PRRs之一，如上所述可對入侵機體的病毒、細菌等進行識別，從而激活免疫系統，在細胞因子風暴的產生中起著至關重要的作用。動物模型中使用能過度激活免疫系統的TLRs激動劑，便可使炎性細胞因子大量分泌，造成細胞因子風暴。

Mahajan等[9]基于一些細胞因子風暴綜合征患者持續激活TLR信號的臨床證據而建立了CpG-1826誘導的小鼠模型，CpG-1826是一種TLR9激動劑，通過反復向野生型小鼠注射CpG，導致炎性細胞因子分泌水平顯著提高。這種模型不會導致致命性，細胞因子風暴樣的臨床特征不能通過T細胞的減少所阻止。在Weaver等[14]的研究中使用了相同的造模方法，他們的研究目的是確定在細胞因子風暴的小鼠模型中，共生微生物區系如何調節TLR驅動的系統免疫反應。

1.1.4SAgs誘導的細胞因子風暴模型 超抗原(SAgs)是由金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌產生的一類強效外毒素，是T細胞的強大激活劑。SAgs可不經過任何處理直接與多肽結合槽外的主要組織相容性復合體Ⅱ(MHC Ⅱ)類分子結合。隨后，它們直接與選定的T細胞受體可變區(Vβ或Vα)家族和T細胞上的CD28相互作用，使T細胞受體(TCR)和CD28交聯，從而使40%-60%的CD4+和CD8+T細胞活化。活化T細胞迅速產生大量的促炎細胞因子，導致細胞因子風暴。SAgs還可通過類似的機制激活自然殺傷T細胞(NKT)和粘膜相關不變T細胞(MAITs)等先天T細胞產生細胞因子，從而加重CRS的嚴重程度[15]。

Kale等[16]在HLA-DR3轉基因小鼠中建立了葡萄球菌B型腸毒素(SEB)作為超抗原誘導的細胞因子風暴模型，該模型與人類細胞因子風暴綜合征非常相似，以揭示細胞因子風暴的免疫發病機制。在這項研究中，使用HLA-DR3轉基因小鼠代替野生型小鼠的原因是細菌SAgs與人MHC(稱為HLA)Ⅱ類分子的結合比與小鼠MHC Ⅱ類分子的結合更有效，所以認為在HLA Ⅱ類轉基因小鼠中能誘導出與人類更類似的急性細胞因子風暴綜合征。

1.2 恒河猴模型恒河猴在基因和生理上與人類相似，在生物醫學研究中能夠提供更有力的實驗證據。Hoang等[17]研究了Baricitinib對感染SARS-CoV-2的恒河猴的氣道炎癥和中性粒細胞招募的治療效果。SARS-CoV-2 接種到Vero E6細胞上傳代產生感染性病毒，印度恒河猴通過鼻內和氣管內兩種途徑感染SARS-CoV-2建立動物模型。《Science》的一篇報道同樣以鼻和氣管兩種感染方式對9只(3組不同劑量)恒河猴接種了SARS-CoV-2[18]。同樣來源于《Science》的一篇報道，6只成年中國恒河猴在氣管內接種50%組織培養感染劑量的SARS-CoV-2，以研究初次暴露SARS-CoV-2的患者是否有再次感染的風險[19]。

2 抗細胞因子風暴藥物體外藥效學評價體系

細胞因子風暴的發生與體內免疫失調密切相關，當SARS-CoV-2入侵機體后，引發主要由巨噬細胞介導的先天免疫反應，巨噬細胞也會釋放IFN和其他促炎因子，繼而在適應性免疫中，在MHC Ⅱ的作用下將抗原細胞提呈給CD4+和CD8+T細胞，促使CD4+T淋巴細胞分化成致病性Th1細胞，分泌大量炎性細胞因子，最終導致細胞因子風暴的爆發[20]。簡言之，免疫細胞收到刺激時打破平衡狀態，形成細胞因子風暴。所以在細胞實驗中，通常選擇免疫細胞作為研究對象。常用的免疫細胞有巨噬細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、外周單個核細胞等。

2.1 巨噬細胞巨噬細胞(macrophages)源自單核細胞，在先天免疫反應中發揮重要作用，并將先天免疫反應和獲得性免疫反應聯系起來，幾乎所有的疾病都涉及巨噬細胞功能的加強或抑制，所以它們也是主要的治療目標[21]。

巨噬細胞系常選擇RAW264.7細胞，源自BALB/c小鼠的Abelson白血病病毒轉化細胞，是炎性疾病研究中常用的細胞系。RAW264.7細胞可以在LPS、Th1型細胞因子或TLR激動劑等因子的作用下向M1型極化，產生促炎因子，模擬細胞因子風暴的發生過程。Ma等[22]在體外培養的RAW264.7細胞中加入H9N2-Neu病毒或LPS誘導，模擬體外病毒或細菌感染誘導的細胞因子風暴的發生。Arai等[23]在RAW264.7中加入LPS誘導炎性細胞因子的分泌，以此探究抗膿毒癥引起的細胞因子風暴的治療靶點。

另外，還可從小鼠中提取原代巨噬細胞用于體外探究實驗，腹腔、脾和骨髓是原代巨噬細胞的常見來源。腹膜提取的原代巨噬細胞是炎性疾病研究中的常用細胞，腹膜腔內存在多種免疫細胞類型，其中巨噬細胞占0.35，僅需向腹膜腔注射冰凍細胞培養液后抽取腹腔液即可獲取腹腔巨噬細胞，分離方法簡單。Staedtke等[12]在探索CAR-T治療引起細胞因子風暴發生的機制時，利用了腹膜提取的小鼠原代巨噬細胞進行體外實驗；Su等[11]也同樣選擇用LPS刺激腹膜提取的巨噬細胞，探究候選藥物抑制炎性細胞因子釋放的機制。脾作為免疫的主要器官，含有大量的免疫細胞，這些細胞很容易以單細胞懸浮液的形式存在，但脾中分離得到的巨噬細胞產率較低，需要通過磁珠分離等技術進行純化或增加小鼠數量以獲得大量的巨噬細胞，因此脾巨噬細胞在相關實驗中應用較少。相較于前兩種來源，骨髓是當需要獲取大量純化巨噬細胞時的更佳選擇。骨髓來源巨噬細胞被Mahajan等[9]用于論證細胞因子綜合征中Plcγ2/Tmem178軸的調節作用，另一方面，Karki等[24]在研究COVID-19細胞因子風暴時，用各種細胞因子共同誘導骨髓來源巨噬細胞，從而了解SARS-CoV-2感染過程中釋放的促炎細胞因子誘導細胞死亡的能力。

2.2 外周血單個核細胞外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)包括淋巴細胞和單核細胞，是人體外周血循環中的重要免疫細胞，PBMC異常是多種炎癥性疾病的重要機制。由于在人體內具有數量多、易獲取等特點，PBMC不僅是眾多疾病發病機制研究的重要對象之一，其比例、數量、功能變化和因子表達等變化也常常被用于炎癥、腫瘤等多種疾病的早期診斷和病情監測中[25]。在一項尋找抗COVID-19引起的細胞因子風暴有效藥物的研究中，分離了健康志愿者的hPBMC細胞，采用LPS共孵育誘導PBMC細胞產生炎癥反應[11]。同樣是針對COVID-19的研究，Karki等[24]則是在健康小鼠全血中分離得到了PBMC細胞，感染SARS-CoV-2病毒模擬體外的COVID-19過程。

2.3 淋巴細胞淋巴細胞包括T細胞、B細胞和NK細胞，是特異性免疫反應的核心[26]。脾臟中含有大量的淋巴細胞，是機體重要的免疫器官之一。在動物實驗中，由于小鼠血液量少，從血中分離PBMC細胞并不容易，因此通常從小鼠脾臟中提取獲得大量的淋巴細胞，用于體外免疫實驗。趙晟從小鼠的脾臟中分離出總脾細胞，并進行密度梯度離心提取淋巴細胞，用LPS或TLR7激動劑R848誘導，進行抗細胞因子風暴藥物抑制免疫細胞因子的機制研究[13]。Kale等[16]則使用pan-T細胞陰性選擇試劑盒進一步分離純化得到脾T淋巴細胞，在SEB的誘導下檢測T細胞活化表型，以此驗證細胞因子風暴的發生程度。

3 抗細胞因子風暴藥物非臨床藥效評價指標和參數

細胞因子風暴最顯著的特征是大量促炎細胞因子水平急劇升高，同時，作為釋放這些細胞因子和趨化因子的來源，SARS-CoV-2誘導的先天免疫細胞和適應性免疫細胞的激活也不可忽視，它們直接或間接促進炎癥細胞因子的分泌。臨床上細胞因子風暴治療的指導方法就是抑制過多的免疫細胞活化和細胞因子產生。因此，藥效學評價時關注促炎細胞因子群和免疫細胞的活化是必要的。此外，研究表明，在重癥COVID-19患者中，全身促炎細胞因子增高與肺損傷、多器官功能衰竭及預后不良有直接關系，且不可控的細胞因子信號通路可導致多器官損傷[27]。所以在進行體內實驗時，觀察肺、肝、腎等主要臟器的病理表現也是非臨床藥效評價的有效手段。

3.1 炎性標志物細胞因子風暴中表達量升高的主要炎性細胞因子及其功能見Tab 1[28]。

炎癥標志物的檢測一般可通過ELISA、PCR、流式細胞術(FACS)等手段。

3.2 免疫細胞細胞因子風暴引起的ARDS是COVID-19危重病人的主要臨床癥狀，其根本發病原因是肺組織中過度活躍的免疫反應激活并募集大量免疫細胞。所以收集小鼠BALF檢測其中免疫細胞的水平是常用的手段。此外，脾作為主要的免疫器官，也存在大量的免疫細胞，同樣可取脾組織作為免疫細胞檢測的實驗對象。目前，常見的免疫細胞檢測指標主要有：巨噬細胞(CD11b+，F4/80+)、中性粒細胞(CD11b+，Ly6C-，Ly6G+)、單核細胞(CD11b+，Ly6C+，Ly6G-)、T淋巴細胞(CD4+，CD8+)和B細胞(B220+)。之前的研究已發現CD4+T細胞(包括Th1、Th2、Th17和Treg)對流感感染的免疫病理和病毒清除都有重要作用，尤其Th1和Th17主要分泌參與炎癥的細胞因子，對于細胞因子風暴的形成具有重要調節作用，所以大量報道中均對CD4+T細胞及其活化細胞進行FACS檢測分析[29]。

3.3 并發器官病變《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》中指出了新冠肺炎患者的各個重要器官的病理改變，其大多是細胞因子風暴所致，包括脾臟縮小，白髓萎縮，紅髓充血，脾臟內巨噬細胞增生并可見吞噬現象；肝細胞變性，灶性壞死伴中性粒細胞浸潤，肝血竇充血，微血栓形成；腎小球毛細血管充血，近端小管上皮變性，腎間質充血，可見微血栓形成等[30]。所以通過對細胞因子風暴中并發器官的組織染色，可以實現針對繼發病變治療作用的觀察，或達到證明藥物同時具有器官保護的藥效作用。

Kale等[16]在針對細胞因子風暴致死的機制研究中，對小鼠的肝、腎、肺和小腸均進行了HE染色實驗，觀察細胞因子風暴導致的各個器官的病理變化：肺部可見炎癥浸潤，圍繞著氣道和血管，充盈肺泡間隙，偶爾出現肺泡間隔模糊；腸結構嚴重扭曲，包括絨毛嚴重鈍化和(或)丟失，粘膜上皮糜爛至潰爛，壞死，以及明顯的中性粒細胞滲入固有層；腎臟和肝臟病理變化不明顯。趙晟[13]在Sunitinib抑制免疫細胞因子的藥效實驗中，驗證了Sunitinib對細胞因子風暴小鼠的器官保護作用，研究者剪取小鼠的肝臟與腎臟進行HE染色，細胞因子風暴小鼠的病理表現為肺泡隔和肺間質內有大量的炎性細胞存在，切片表現為肺泡隔增寬，肺間質內大量單核細胞浸潤；腎小球萎縮、腎小管腎小球出現充血的特征，具有明顯的炎性浸潤反應。

4 總結與展望

得益于2003年非典防控的經驗，我國的醫療防控團隊在此次救治COVID-19中有了一些能夠借鑒的救治方案，但隨著當年SARS病毒傳播的突然停止，針對SARS病毒的新藥、疫苗開發項目也隨之終止了，這也是目前救治COVID-19仍無有效藥物的關鍵原因所在。因此，針對重大流行病相關共性救治環節的新藥開發與儲備應是我國增強抵御突發重大公共衛生事件能力的重要策略之一[4]。

在“ClinicalTrials.gov”中檢索到目前正在進行COVID-19臨床實驗的研究多達168項，其中與治療細胞因子風暴相關的藥物研究近20項。由于細胞因子風暴的發病機制復雜并涉及免疫系統多個因素的作用，在受試藥物作用機制檢測以及體內藥效學研究方面難度較大。盡管病毒誘導的動物模型能更準確的模擬新冠肺炎并發細胞因子風暴的發病特點，但由于種屬相關性、病毒實驗危險性以及動物模型本身等限制性因素，直接對實驗動物注射病毒進行體內藥效學評價存在一定的局限性。而根據以往的研究發現，LPS、TLR激動劑及SAgs同樣能夠誘導實驗動物機體發生細胞因子風暴，這些動物模型為受試藥物的初步藥效學評價方法提供了更多選擇性。

中重度COVID-19患者致死的主要原因就是細胞因子風暴的發生與發展，開發能夠減輕細胞因子風暴的藥物刻不容緩。本文綜述的細胞因子風暴治療藥物的非臨床藥效學實驗方法有：在小鼠上建立病毒誘導、LPS誘導、TLR激動劑誘導及SAgs誘導的細胞因子風暴模型，此外，更貼近人的動物模型還可以選擇靈長類動物如恒河猴進行試驗。體外模型中可以選擇RAW264.7細胞系或小鼠提取的原代巨噬細胞、外周血單個核細胞、淋巴細胞等進行試驗，誘導方法一般也是使用LPS或TLR激動劑刺激細胞。藥效評價方法為采用ELISA、PCR或FACS等手段檢測炎性細胞因子的分泌水平，采用磁珠分選與FACS結合檢測相關免疫細胞的數量，取小鼠主要臟器行HE染色觀察病理變化。研究者可根據藥物預期的治療效果、作用機制等選擇適合的試驗方案。對于新冠并發細胞因子風暴癥狀治療藥物的臨床前藥效評價，應當在考慮受試藥物的作用特點與機制的基礎上利用現有的實驗方法，盡可能地提供非臨床有效性證據，同時，應當兼顧藥物的開發風險和醫學倫理要求，為臨床試驗提供支持和參考，降低藥物開發的無效性風險。

綜上，本文旨在為各類在研抗細胞因子風暴藥物的非臨床開發提供參考，同時，研究人員也將繼續探索新冠肺炎并發細胞因子風暴過程的相關機制，尋找潛在治療靶點，以進一步推動治療藥物的研發。