艾滋病疫苗研究面臨的挑戰和進展*

張 喬，陳國兵，牛海濤，羅鈞洪，梁曉峰，高 峰△

（暨南大學1分子醫學病毒研究所，2基礎醫學與公共衛生學院微生物與免疫學系老年免疫學研究所，3實驗動物管理中心，4基礎醫學與公共衛生學院系統生物醫學系，5基礎醫學與公共衛生學院公共衛生與預防醫學系，廣東廣州510632）

艾 滋 病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由人免疫缺陷病毒（human immunodeficien‐cy virus，HIV）攻擊機體免疫系統所引發的一類傳染性疾病。HIV-1通過特異性感染CD4+T淋巴細胞進而摧毀機體的免疫功能，最終誘導多種并發癥的出現，例如結核、肺炎、細菌感染以及血液系統腫瘤等［1］。最新WHO統計數據顯示，截止2019底，全球約有3 800萬HIV-1感染者，其中包括180萬兒童；2019年新發感染者170萬，死于艾滋導致的并發癥人數達到69萬人［2］。更為嚴峻的是，聯合國艾滋病規劃署制定的2020年90/90/90目標（90%HIV-1感染者得到確診，90%確診病人得到治療，90%治療病人的病毒血癥得到控制）也宣告失敗，預示攻克艾滋病仍任重道遠。

盡管與艾滋病大流行的斗爭即將邁入第40個年頭，但是目前人類仍無法完全治愈艾滋病。在抗HIV病毒藥物領域，科學家們取得了巨大成就，抗逆轉錄病毒雞尾酒療法（combination antiretroviral ther‐apy，cART）的出現成功將艾滋病轉變為一種長期可控性疾病，顯著提高了患者的生存率［3］。然而患者需終身服藥所伴隨一系列的副作用如神經性病變、胰腺炎或骨質疏松等顯著影響了患者生活質量和壽命［4-6］。此外，經濟發展不平衡也增加了艾滋病治療的困難。在重災區南非，死于艾滋病的人數占全國總死亡人數的28%，而歐洲則低于0.1%［7］。面對艾滋病大流行，國際已形成廣泛共識：有效的預防性艾滋病疫苗是終結艾滋病流行的最有效手段。

2009年，艾滋病疫苗III期臨床試驗（RV144）結果顯示該疫苗具有一定程度的預防效果，這是科學家第一次在臨床試驗中發現可檢測到的保護效果［8］。盡管保護效率只有31%，但是也給艾滋病疫苗研究領域帶來了鼓舞和希望。然而遺憾的是，研究人員最近在南非開展的III期臨床重復試驗（HVTN 702）數據顯示，相較于對照組，疫苗接種組沒有保護效果［9］。盡管前期的I、II期臨床試驗結果顯示疫苗誘導了細胞和體液免疫反應，但是III期試驗失敗提示疫苗誘導廣譜中和抗體（broadly neutralizing anti‐body，bnAb）的重要性。多次III期臨床試驗的相繼失敗促使疫苗學家逐步加強疫苗與免疫學的理論研究并在研究bnAb以及抗體進化機制中取得了重大進展。bnAb能有效中和多種異源性HIV-1毒株，具有高效的抗病毒效果，目前誘導bnAb已成為下一代HIV-1疫苗設計的核心問題。但是，現階段在所有實驗動物和人類中尚沒有任何一種疫苗能夠成功誘導針對難以中和的多種異源性HIV-1 tier-2毒株的bnAb。因此，通過免疫原來誘導bnAb已成為目前艾滋病疫苗研發的核心科學問題與挑戰。本文總結了現今HIV-1疫苗研究面臨的困境以及新的研究進展，期望為HIV疫苗的后續研究提供新的思路。

1 缺乏理想的動物模型

臨床前動物模型評價是疫苗研究重要環節之一。目前，HIV-1病毒無法在動物內復制，導致HIV-1候選疫苗缺乏理想的動物評價模型。猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）在感染、傳播和潛伏期方面與HIV-1病毒非常相似，通過將HIV-1膜蛋白基因（env）取代SIV基因組中的相應env，研究人員成功建立了嵌合病毒（simian/human immunodeficiency virus，SHIV）感染非人靈長類（nonhuman primates，NHP）動物模型。SHIV感染模型在HIV-1疫苗保護評價、誘導bnAb及其進化研究中得到了廣泛應用。然而，SHIV感染方式、劑量以及時間參數都可顯著影響疫苗評價結果［10］。

HIV-1在自然傳播過程中主要通過性接觸暴露黏膜表面進而發生感染。但由于血液中存在大量具有感染性的病毒顆粒，經血傳播具有更高的傳染性。目前，臨床前動物評價主要采用黏膜和靜脈注射方式，而前者應用更加廣泛。單次高劑量（single highdose，SHD）感染在研究早期得到了廣泛應用，但是其存在明顯缺陷。盡管SHD能達到接近100%感染率，但是過高的病毒滴度減弱了疫苗誘導的免疫保護作用，進而顯著低估候選疫苗的保護效價［11-12］。另外，SHD與HIV-1正常感染過程也相差甚遠。正常情況下，性接觸導致的HIV-1感染率較低，陽性男性患者精液的病毒平均數約為每毫升11 000個拷貝，而在動物模型中，即使低劑量病毒（TCID50小于250），其每毫升拷貝數也超過1百萬，遠遠大于正常感染過程中的病毒滴度［13-14］。因此SHD不能很好地模擬HIV-1病毒正常傳播過程。低劑量重復（re‐peated low-dose，RLD）感染由于能較好模擬HIV-1病毒自然感染過程已經成為臨床前動物評價的標準方法。RLD通過低劑量重復感染使未免疫對照組所有或大部分猴建立感染，可更好地再現人類HIV-1粘膜感染的過程與特征。因而在有限的動物數量情況下，RLD模型能較敏感地評價疫苗的保護效果。模擬研究顯示，RLD模型只需要50只猴（每組25只）就可以達到足夠的統計能力檢測到候選疫苗的50%保護效果，這大大增加后續臨床試驗成功的可能性［15］。

病毒感染滴度和頻率是影響RLD模型評價的關鍵因素。不同研究團隊使用的病毒感染滴度存在很大偏差，有效TCID50值可能相差10倍以上，可能的解釋是不同的傳代次數和體外擴增方法影響了病毒的感染力［14，16］。因此，在試驗前確定準確的病毒感染滴度對試驗成敗至關重要。目前大部分研究采用每周一次的感染頻率來建立感染模型，未免疫猴的初次感染率一般在20%～40%范圍內，采用該感染方式可以較好地評價候選疫苗的保護效價。研究顯示單劑量接種導致的SIV感染一般發生在5～14 d內［17］。如果采用兩周一次的感染頻率感染猴，分別在第6、10和14天檢測動物的血清轉化指標，結果顯示74%的陽性轉化發生在10 d之后［17］。這些實驗結果表明每周1次的感染頻率可能會過高估計免疫的保護作用，采用兩周1次的感染頻率以及更頻繁的指標檢測可取得更準確的評價效果。盡管RLD模型可較好地評價疫苗保護效果，但是仍存在一些限制性因素導致其評價效果很難在人類臨床試驗中完全再現：（1）模型采用的SHIV不能完全模擬HIV-1病毒感染過程；（2）不同SHIV毒株間的感染和致病能力差別很大，因此選用不同的SHIV毒株可對疫苗評價產生非常大的影響；（3）該模型的初次感染率仍顯著高于HIV-1的自然感染率，接種采用的低劑量病毒滴度也遠高于感染者陰道分泌物或精液中的病毒含量。然而，如果通過進一步減小病毒滴度來降低感染率的話，將會顯著延長研究時間，大大增加研究費用。眾多影響因素導致的不確定性迫使人們通過提高動物樣本數來獲得具有顯著差異的統計能力，期望能更有效地評價疫苗的保護效果。

2 HIV-1包膜蛋白自身不足以誘導廣譜中和抗體

HIV-1具有高度的基因序列多樣性，導致其預防性疫苗必須具有廣譜的免疫保護能力。在慢性HIV-1感染者中，約有10%左右的感染者會自然產生bnAb，通常在感染2～4年后才會出現，僅在兒童體內偶有感染1年內即產生bnAb的報道［18-19］。新的研究證據也表明，感染者體內的中和抗體需要經過長期的體細胞高頻突變（somatic hypermutation，SHM）積累，才能獲得廣譜性和中和強度。分析進化過程中抗體序列顯示抗體中和強度和廣度與SHM的積累成正相關，表明長期的SHM積累對HIV-1中和抗體廣譜性的獲得是必要的［20-21］。由于HIV-1包膜蛋白（Env）固有的弱免疫原性以及抗體進化等限制性因素，現有免疫策略仍無法誘導針對HIV-1的bnAb的產生。

HIV-1的Env由gp120和gp41兩部分構成，存在于病毒表面的包膜蛋白由3個單體通過非共價鍵形成三聚體結構；gp120位于包膜外側主要負責結合細胞受體，而gp41負責將整個膜結構錨定在病毒膜表面，負責病毒和細胞融合。目前的Env三聚體免疫原尚無法有效誘導中和抗體反應，主要原因在于其固有的弱免疫原性無法誘導較高的抗體中和免疫反應。采用相同條件免疫HIV-1 gp120與狂犬病病毒G蛋白時，HIV-1 gp120誘導的IgG和IgA水平低于G蛋白［22］。對比乙肝表面抗原疫苗，盡管gp120在狒狒體內誘導了相似水平的抗體反應，但是其抗體濃度下降率明顯快于乙肝抗原，原因可能是gp120誘導了較少數量的長效漿細胞［23］。以上數據表明，相較于其它病毒性抗原，gp120具有較弱的免疫原性從而無法誘導持續的抗體反應。隨著結構生物學的發展，高分辨率Env空間結構的解析促進了HIV-1免疫原的結構優化。通過結構修飾，人們制備了更加穩定的類似天然Env的三聚體（例如SOSIP和UFO）［24-25］。冷凍電鏡分析顯示SOSIP.664具有和病毒顆粒Env高度類似的空間構象，目前已作為HIV-1免疫原設計的主要結構前體被廣泛使用。由于提高了三聚體在體內的穩定性以及抗原表位展示，SOSIP.664具有更好的免疫原性。在多種動物如兔子、豚鼠以及猴模型中，SOSIP.664三聚體結構首次誘導了同源Tier 2病毒中和反應，但是對異源病毒的中和反應仍在很少的情況下被觀察到［24，26-27］。

導致HIV-1 Env弱免疫原性的原因目前仍不清楚。大量證據顯示Env的高度糖基化修飾是一個重要因素。對比來看，流感病毒血凝素單體大約含有3個聚糖分子，呼吸道合胞病毒融合蛋白有5～6個聚糖分子，而HIV-1 Env單體含有近30個聚糖分子，遠遠高于許多其它病原膜蛋白［28］。由于糖基不能有效地被機體免疫系統識別，具有免疫耐受性，因此高度糖基化的Env無法有效激活機體的免疫反應。中和抗體的進化成熟需要經過抗體基因高變區（V）的高頻突變積累產生各種B細胞克隆，這個過程需要輔助性T細胞Th2激活體液免疫來實現。輔助性T細胞通過受體特異性識別抗原呈遞細胞上的輔助性T細胞表位（Thelper cell epitope，THCE）從而促進Th1或Th2的激活，而位于抗原水解位點附近的聚糖分子通過形成空間位阻阻止蛋白酶的水解，影響抗原表位的釋放，最終抑制體液免疫的激活［29-30］。細胞內廣泛分布各種糖分子結合蛋白凝集素，研究發現甘露糖結合凝集素高親和性結合SOSIP膜蛋白聚糖表位，減弱Env的免疫原性，抑制了中和抗體的產生［31］。

HIV-1膜蛋白分子gp120介導的免疫逃逸也影響Env免疫原性，gp120基因的高頻突變可逃逸免疫壓力。即便當氨基酸的改變不顯著影響gp120的正常生理功能時，也可促進HIV-1對中和抗體產生逃逸［32］。機體通過激活天然免疫促進適應性免疫保護，疫苗佐劑的增強效應主要利用該過程來實現。漿細胞樣樹突狀細胞胞內的TLR9受體識別寡聚脫氧核苷酸CpG，促進了I型干擾素和促炎癥因子的表達，最終導致B細胞的活化。該過程中，gp120通過與樹突狀細胞表面的CD4以及甘露糖凝集素受體結合下調相關促炎癥因子的表達，抑制B細胞的激活，可影響TLR9受體激動劑類佐劑在HIV-1疫苗中的應用［33］。值得注意的是，在免疫初期，疫苗注射位點的gp120局部濃度很高，與CD4受體相互作用的增強可能進一步加劇對B細胞活化的抑制。研究顯示，抑制gp120與CD4受體的親和力可提高DS-SOS‐IP.4mut抗原的免疫原性［34］。Gp120的W427S突變體可抑制gp120與CD4受體的結合，采用野生型和W427S突變體分別免疫小鼠后發現，野生型免疫原誘導了更高水平的非特異性輔助性濾泡T細胞、漿細胞以及血清IgG抗體，相較之下，突變體免疫原可誘導更高水平的特異性體液和細胞免疫反應［35］。

增強抗原免疫原性將有助于誘導更強的抗體反應。將破傷風疫苗的T細胞表位肽段整合到含有HIV-1 Env免疫原的類病毒顆粒中，免疫小鼠后發現，含有THCE的類病毒顆粒激活了更強的T細胞反應，顯著提高了針對Env的IgG1抗體表達水平［36］。由于破傷風疫苗在人群中廣泛接種，相應的記憶性T細胞可能會進一步加強該類病毒顆粒的免疫反應。利用納米顆粒的多價結合也可有效提高抗原在體內的呈遞效率，進而激活更強的B細胞反應，因此該材料在疫苗領域得到了廣泛應用［37-39］。呼吸道合胞病毒的納米抗原將中和抗體水平提高了10倍以上［37］。將不同流感病毒株來源的HA受體結合位點整合形成的馬賽克疫苗，顯著提高了抗體的中和廣度［38］。但是，HIV-1 Env制備的納米顆粒僅能將中和抗體滴度提高3倍左右，較其它病毒相差甚遠，原因可能是Env聚糖分子的位阻效應和與凝集素的廣泛結合［39］。疫苗佐劑可以顯著增加疫苗的免疫原性，但是目前應用最廣泛的鋁佐劑可破壞HIV-1 Env的結構完整性，可能是其不能誘導bnAb的主要原因之一［40］。盡管如此，在SHIV感染猴模型中，一種新型的脂質體鋁佐劑ALFA的保護效價達到90%，而鋁佐劑對照組沒有保護效果［41］。目前多種不同形式的鋁佐劑和HIV-1疫苗組合正處于臨床評價階段，除此之外，突變型大腸桿菌耐熱毒素、AS01b、ALF43等多種佐劑也處于臨床評價階段［42-43］。

免疫原緩釋作為一種有吸引力的免疫方式在HIV疫苗研究中逐漸受到重視［44］。相較于傳統的間斷性免疫方式，它更接近于自然感染中的抗原提呈過程，可能引起更強的免疫反應，提高抗原的免疫原性。在小鼠體內，采用非機械性滲透泵持續緩釋抗原兩周，重復3次后檢測發現，相較于少數間斷注射，緩釋免疫顯著提高了輔助性濾泡T細胞TFH和生發中心B細胞的數量，而IgG抗體水平提高15倍［45］。同一研究小組進一步在猴模型中采用兩種緩釋模型驗證了該免疫方式的增強效應［46］。與小鼠模型類似，抗原緩釋顯著增強了生發中心TFH和B細胞響應動力學，同源Tier 2病毒中和抗體水平提高20倍以上。更為重要的是，通過對Env特異性B細胞進行二代測序發現，緩釋誘導了更多種類的Env特異性B細胞進而導致中和抗體的多樣性。然而出乎意料的是，與對照組相比，二者的體細胞SHM相似。通過抗原示蹤技術發現，緩釋顯著延長了抗原在淋巴系統的滯留時間，表明抗原的更多中和表位被有效呈遞，提高了中和抗體的多樣性［46］。

3 HIV-1包膜蛋白保守表位可促進廣譜中和抗體的進化成熟

HIV-1病毒序列的多樣性要求其疫苗具有廣譜免疫保護能力。近年來，研究人員相繼從感染者體內分離到許多bnAb并鑒定了與之作用的抗原保守表位，主要包括CD4結合區（CD4 binding site，CD4bs），V1V2，V3C3，gp41膜近端外膜區和gp120-gp41結合區［47］。利用HIV-1重組gp120抗原RSC3，通過單個B細胞分選，研究人員從HIV-1患者體內篩選出針對gp120 CD4bs的單抗VRC01，其廣譜中和能力高達91%［48］。目前來看，靶向CD4bs的bnAb分離頻率較高，原因可能是病毒需要充分暴露保守的CD4bs促進與靶細胞的結合，進而有效地遞呈該表位，并誘導特異性bnAb的產生。比較來自于14名艾滋患者的16個CD4bs特異性bnAb發現，盡管這些抗體的堿基序列存在巨大差異，但是其空間結構基本相似［49］，這也解釋了為什么它們都具有特異性識別CD4bs表位的能力。盡管它們之間具有高度的序列差異性，它們間的功能相似性表明它們通過不同的進化途徑獲得結合CD4bs表位的能力，最終能夠廣譜地中和大多數病毒株。

近來研究發現抗HIV-1 bnAb的產生需要一個長期進化成熟過程，生物信息學和單細胞測序技術的發展使得我們有機會探索它們的進化成熟過程。通過測序比較艾滋患者不同時期來源的血清B細胞發現，中和抗體廣譜性的獲得要求SHM的大量積累。當遭遇抗原后，B細胞通過SHM極大提高B細胞種類的多樣性，理論上可以達到1012不同種類，而龐大的B細胞庫保證了與TFH的有效識別和bnAb克隆篩選。CH103在2.5年時間內積累了17%的SHM從而獲得了中和55%病毒的能力［20］，而CH235則在6年時間內積累了25.6%的SHM從而獲得了中和90%病毒的能力［21］。由此可見，SHM的積累對bnAb的產生至關重要。

由于SHM的產生是隨機事件，那么中和抗體是如何逐漸提高針對特定保守表位的中和能力呢？患者體內的HIV-1病毒通過不斷突變來獲得逃逸機體免疫壓力的能力。事實上，從患者體內分離的bnAb并不能有效地中和患者體內當時存在的病毒，也不能降低患者體內的病毒滴度和緩解疾病進展，這表明bnAb的突變并不是以提高中和抗體的廣譜性為目的［50］，但是病毒突變導致的多樣性在促進中和抗體廣譜性中起著重要作用［20，51，52］。有研究還顯示，超級感染導致的病毒多樣性與病毒重組可顯著提高抗體的中和廣度［53-54］。為了獲得中和廣度，中和抗體需要攻擊Env結構上的保守表位，那些靶向其它非保守表位的抗體盡管可以不斷進化，但是并不會獲得廣譜的中和能力，這也解釋了為何從病人分離得到bnAb的概率偏低。不同時期的CH235抗體和Env共晶體結構顯示，早期進化的CH235可以識別CD4的核心以及外圍區域，但是隨著抗體的不斷進化，抗體識別膜蛋白上的表位逐漸縮小，最終進化的CH235僅主要識別高度保守的、所有HIV-1毒株共有的CD4bs而不再受CD4b s外圍變異區域的影響，從而能夠結合并中和大多數病毒，獲得中和HIV-1的廣譜性［21］。病毒通過刪除V2區在第160位點聚糖修飾位點進一步暴露了CD4bs，從而促進CD4bs中和抗體的成熟［55］。另外，延長抗原在淋巴系統的滯留時間，促使抗原保守表位被更有效呈遞，最終可增加中和抗體的多樣性［46］。以上數據表明，抗原表位的充分暴露對bnAb產生至關重要。但是目前機體免疫系統如何“存檔”已獲得的表位信息，并進一步完善表位信息的分子機制仍有待進一步研究，例如存檔信息是否提高TFH與特異性B細胞的結合。綜上所述，盡管病毒突變與B細胞SHM屬于隨機事件，但是包膜蛋白上的高度保守表位仍然可在特定條件下誘導廣譜中和抗體的進化成熟。

4 廣譜中和抗體的進化機制及其在新型疫苗設計中的意義

盡管已從HIV-1感染者體內分離到許多bnAb，但是目前所有的免疫原在動物模型以及人體內尚不能誘導bnAb產生。為了探索誘導bnAb產生的進化過程，研究者通過單細胞和高通量測序方法獲得bnAb成熟過程中產生的大量抗體基因序列，繪制抗體進化譜系，最終演繹bnAb的進化成熟過程。我們曾從一名非洲HIV-1 C亞型奠基病毒感染者（CH505）體內分離到CD4bs靶向的bnAb（CH103），通過中和抗體譜系分析，病毒進化分析和抗原-抗體共結晶等手段，首次描述了奠基病毒與bnAb共進化及其成熟過程，并在后續研究中進一步闡明了不同譜系B細胞之間的協同作用以及抗體從胚系到bnAb的成熟機制［20，21，52］。識別相同或其它表位bnAb的進化成熟機制也陸續得到闡釋，證實并擴展了病毒與bnAb的共進化機制［51，56］。分泌HIV-1廣譜中和抗體的B細胞在體內完成抗體基因重排并形成胚系共同進化祖先（unmutated common ancestor，UCA）后，需要在B細胞生發中心積累許多SHM來完成漫長的進化成熟過程。基于上述bnAb進化成熟機制的研究，目前提出了基于B細胞譜系的免疫原設計方案：首先從記憶B細胞中分離高效的bnAb；其次繪制其進化譜系推斷胚系共同祖先和進化中間抗體（interme‐diate antibodies，IA）；最后根據UCA和不同IA與相應病毒包膜蛋白進化過程中的突變體的親和力以及中和強度設計序貫免疫原，逐步誘導bnAb的產生。應用上述思路，研究人員在人源化小鼠體內成功誘導出可以中和tier-2毒株的bnAb［57］。如同自然感染，以序貫免疫方法有可能定向引導bnAb的進化成熟，縮短bnAb的產生時間。但是目前尚未在非人類靈長動物模型內得到驗證。采用靶向胚系B細胞抗原設計也取得了重要進展，該方案主要目的是通過優化設計免疫原誘導目的bnAb前體B細胞的激活。VRC01類型bnAb特異性結合CD4bs靶點，但是這類bnAb的UCA抗體并不能結合異源病毒的Env，因此異源病毒的Env無法激活相應的胚系B細胞。通過蛋白互作設計、文庫篩選與多靶點優化等手段，研究人員篩選得到優化的eOD-GT6免疫原。與野生型Env比較，eOD-GT6增加了8個突變位點。eOD-GT6與VRC01及其UCA和IA具有非常高的親和力，這可能有助于相應B細胞SHM朝向成熟的VRC01發展。實驗結果顯示eOD-GT6納米顆粒可成功激活表達VRC01及其前體的B細胞系［58］。最近，同一研究團隊設計的N332-GT2免疫原在小鼠體內成功誘導了相對廣譜的結合抗體［59］。目前為止，由于具有一定中和程度的廣譜中和抗體尚未能在這類人源化小鼠體內誘導出來，這一策略仍需進一步改進和完善。

5 結語

回顧艾滋病疫苗30多年的發展歷程，我們可以從中總結寶貴的經驗教訓。艾滋病疫苗研究主要經歷了應用與理論指導應用兩個重要時期。傳統經驗模的失敗促使疫苗學家開始關注疫苗誘導機體免疫保護的理論研究。美國國立衛生研究院疫苗研究中心（Vaccine Research Center，VRC）和艾滋病疫苗免疫中心（Center for HIV/AIDS Vaccine Immunology，CHAVI）的成立促進了艾滋病疫苗研究從應用到理論的重大轉向，許多資金投入到HIV-1病毒免疫學、病毒學和結構生物學研究中來，取得了一系列重大的研究成果，極大地推動了疫苗研究的發展。RV144臨床III期試驗得到的微弱保護結果和最近HVTN702臨床III期試驗的失敗進一步凸顯了誘導bnAb的重要性。近年來，一系列bnAb的分離以及抗體進化機制的闡明使得通過設計新型免疫原來誘導bnAb成為可能。可是目前基于抗體進化機制設計的靶向胚系B細胞抗原仍未能在非人類靈長動物模型內誘導bnAb，研發有效的艾滋病疫苗仍然任重路遠。另外，動物模型的局限性以及HIV Env異常的免疫原性也進一步增加了艾滋病疫苗挑戰。盡管面臨諸多挑戰，希望不斷積累的病毒學、免疫學以及結構生物學理論成果可以幫助人類成功地研制可以遏制HIV-1流行的艾滋病疫苗。