BRD4蛋白作為惡性膠質瘤治療靶點的研究進展*

聞乃妍，劉恬恬，付 雙，杜艷偉，黃衛東

（長春中醫藥大學，吉林長春130117）

近年來研究表明，腦膠質瘤中廣泛存在表觀遺傳學異常現象。與基因突變不同，表觀遺傳學是可逆的，它可以調控膠質瘤細胞致瘤和非致瘤狀態間的轉換。組蛋白乙酰化是一種重要的表觀遺傳學修飾方式。組蛋白乙酰化閱讀器——布羅莫結構域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）作為膠質瘤治療靶點，為恢復膠質瘤細胞正常的表觀遺傳學狀態，更有效地治療惡性膠質瘤提供了新的研究角度［1-3］。目前研究表明，下調BRD4基因或采用BRD4選擇性抑制劑JQ1，能夠有效地抑制膠質母細胞瘤干細胞（glioblastoma stem cells，GSCs）增殖，促進細胞凋亡，但作用效果有一定的局限性，這提示不能被JQ1抑制的膠質瘤細胞存在其它途徑維持異常的自我更新，因此BRD4抑制劑與其它藥物聯用治療腦膠質瘤可能具有廣闊的前景。本文主要總結BRD4蛋白的生物學功能及對腦膠質瘤發生發展的影響，總結和介紹BRD4抑制劑的發展現狀及發展趨勢，為找尋更有效的膠質瘤治療方法提供理論基礎。

1 腦膠質瘤概述

腦膠質瘤是成人最常見的原發性腦腫瘤之一，占惡性腦腫瘤70%以上。2007年世界衛生組織分類標準中根據組織學和惡性程度將膠質瘤分為4級［4］：I級和II級為低級別膠質瘤（low-grade glioma，LGG），預后較好，主要為年輕患者，對治療敏感性強；III級和IV級屬于高級別膠質瘤（high-grade glioma，HGG），尤其是IV級多形性膠質母細胞瘤（glioblasto‐ma multiforme，GBM），惡性度最高，中位生存期僅能達到9～12個月，5年生存率不超過5%［5］。GBM可分為原發性和繼發性兩種，原發性占絕大多數比例，繼發性較少見，臨床表中男性患GBM的發病率明顯高于女性。GBM具有浸潤性、侵襲性、遷移性等多種生物學特征，局部侵襲性能夠侵襲到腦實質、蛛網膜下腔、血管周圍腔和白質束；浸潤性可以浸潤到距離原發腫瘤1～2 cm處［6］；GSCs可沿腦白質進行遷移，即便進行手術切除，仍然會伴有很高的復發率［7］。目前針對于惡性膠質瘤的標準治療方法是最大安全范圍手術切除腫瘤組織配合放化療，雖然有一定療效但是患者中位生存期小于2年，因此亟需找尋更有效地治療腦膠質瘤的方法［1，8］。

2 BRD4蛋白的生物學功能

BET（bromodomain and extra-terminal domain）家族是一類包含布羅莫結構域的蛋白，包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT四種亞型，BRD4是其中被研究得最多最深入的一個亞型［9］。BRD4蛋白具有組蛋白乙酰化閱讀器功能，能夠選擇性地與組蛋白尾部的乙酰化賴氨酸殘基相結合，通過布羅莫結構域募集轉錄調節因子與乙酰化組蛋白相結合，從而調節一系列重要的生物過程，例如基因轉錄調節、染色質重塑、DNA損傷和修復等［10］。

在結構上，BRD4蛋白有兩個保守的串聯布羅莫結構域BD1和BD2，以及一個ET結構域。BD1和BD2可與組蛋白和（或）轉錄因子上的乙酰化賴氨酸殘基結合。BRD4的ET結構域主要通過與染色質調控因子（精氨酸脫甲基酶JMJD6和賴氨酸甲基轉移酶NSD3）相互作用而發揮轉錄調節作用。此外，ET結構域還與ATP依賴性染色質重構復合物SWI/SNF和克羅莫結構域解旋酶DNA結合蛋白4（chromodo‐main helicase DNA binding protein 4，CHD4）相互作用，表明BRD4具有改變染色質結構的作用［9］。

最初，發現BRD4具有基因轉錄調節作用是由于BRD4可以與正性轉錄延伸因子b（positive transcrip‐tion elongation factor b，P-TEFb）復合體和調節因子構成的蛋白復合物相結合［11］。P-TEFb復合體是一個由細胞周期蛋白依賴性激酶9（cyclin-dependent ki‐nase 9，CDK9）及其調節亞基cyclin T1、T2或K構成的異二聚體，通過磷酸化RNA聚合酶II（RNA poly‐merase II，Pol II）延長復合物來激活Pol II［12］。BRD4有2個結構域可以與P-TEFb相互作用，分別是C末端結構域（C-terminal domain，CTD）和BD2結構域。CTD與cyclin T1和CDK9相互作用；BD2結構域能夠識別cyclin T1的乙酰化區域。7SK核內小RNA與HEXIM1蛋白形成核糖核蛋白復合物，該復合物可以隔離P-TEFb并使其功能失活，BRD4阻止P-TEFb與7SK/HEXIM復合體結合，從而保持P-TEFb的活性。因此，BRD4是乙酰化組蛋白和基因轉錄之間相互作用的重要條件［13］。此外，BRD4能夠募集JMJD6到增強子使H4R3me1和H4R3me2去甲基化。增強子與BRD4/JMJD6/P-TEFb復合物相結合促進啟動子區域Pol II的釋放，促進轉錄延長［9］。

BRD4是一種在哺乳動物組織中廣泛表達的核蛋白，最初被認為是一種控制細胞周期的蛋白［14］。BRD4通過與乙酰化組蛋白（H3Lys14和H4Lys5/8/12）及非組蛋白結合，調節DNA復制和基因轉錄，從而影響細胞周期［15］。在G0/G1期轉化過程中，細胞通過有絲分裂刺激誘導BRD4表達。當細胞進入M期階段，BRD4與染色體相互作用，標記那些在G1期轉錄的基因，以確保細胞周期正常進展。微量注射BRD4抗體到HeLa細胞核中可完全抑制細胞的有絲分裂，表明BRD4在細胞周期中也發揮重要作用。在膠質瘤細胞及GSCs中沉默BRD4表達或利用BRD4抑制劑能夠有效抑制細胞活力和增殖能力，通過抑制p21、cyclin D1等細胞周期相關蛋白的表達誘導細胞大量停滯在G1期，S期比例減小。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）HOTAIR對膠質瘤細胞增殖具有重要作用，BRD4能夠與HOTAIR啟動子相結合，調節lncRNA的表達，表明BRD4可以通過調控lncRNA的表達促進GSCs增殖［16-18］。

除了調控基因轉錄和細胞周期，BRD4在DNA損傷檢查點的激活調控方面也發揮著重要作用。BRD4通過募集凝集素II染色質重構復合物到乙酰化組蛋白上，從而發揮內源性DNA損傷應答信號抑制劑的作用。BRD4缺失導致染色質結構松弛，γH2AX噪點增多，而當BRD4表達增強會降低γH2AX表達水平，減弱DNA損傷信號對電離輻射的應答［19］。Wen等［18］發現，siBRD4或JQ1能引起GSCs中γH2AX表達水平升高，DNA損傷加重。

GSCs被認為是導致腦膠質瘤術后高復發率、對放療抵抗和化療耐藥的主要原因［20-21］。通過轉錄組測序發現，對JQ1敏感的GBM細胞中OLIG2的表達水平上調明顯；OLIG2是proneural亞型GBM的標志物，異常表達的OLIG2與其他神經發育轉錄因子相互作用可誘導GBM細胞多能性分化，提示JQ1對GSCs表型穩定產生重要影響［22-23］。其它研究表明，敲除BRD4能夠減弱GSCs的干性，使乙醛脫氫酶1活性下降，干性調節因子表達下調，神經球成球能力減弱。此外，抑制miR-142-5-p或重新激活Wnt/βcatenin信號通路可逆轉沉默BRD4對GSCs干性的抑制作用，表明BRD4/miR-142-5-p/Wnt/β-catenin可能是膠質瘤細胞中負責維持干細胞特性的信號通路，這可能成為一個具有前途的表觀遺傳學治療腦膠質瘤的方法［15］。Wen等［18］的研究表明，siBRD4或JQ1可降低GSCs神經球的成球能力，抑制GSCs自我更新；JQ1還可有效抑制GSCs標志物nestin的表達水平，提示BRD4對于GSCs維持干性具有重要作用。

3 BRD4抑制劑進入前期臨床試驗的進展

2010年Filippakopoulos等［24］發現了第一個具有甲基三唑并二氮雜?類骨架結構的選擇性BRD4抑制劑——JQ1。之后的幾年里越來越多的BET抑制劑被發現。目前雖然還沒有BET抑制劑獲得FDA的批準，但是有幾種藥物已處于臨床試驗階段（表1）。

表1 BET抑制劑的臨床試驗Table 1.Clinical trials with BETinhibitors（https：//www.clinicaltrials.gov/）

目前，針對BET抑制劑耐受性和毒副作用的研究還不夠全面。I期藥物存在一定的劑量限制性毒性（dose-limiting toxicity，DLT），表現為頭痛、嘔吐、腹瀉、疲勞、厭食、味覺障礙、血小板減少等。DLT較小的藥物有MK-8628/OTX-015、CPI-0610、RO6870810/TEN-010和GSK525762。文獻表明，在OTX015的Ib期試驗中，47例晚期實體腫瘤患者中僅有7例出現部分不良反應，相較于其它BET抑制劑，OTX015的毒副作用反應較少［25］。在給藥劑量方面，最初許多關于用藥劑量的研究表明藥物連續劑量應為每天1次。然而，由于藥物毒性等多種原因，對于一些藥物根據腫瘤類型制定了替代方案，推薦進行間歇性給藥。以OTX015為例，實體瘤給藥劑量為每日80 mg，造血系統惡性腫瘤推薦間歇性給藥，每日80 mg，給藥2周，停藥1周。絕大多數的BET抑制劑是口服的，只有RO6870810是一種用于皮下注射的化合物［13］。目前，進入臨床前期試驗用于治療腦膠質瘤的BET抑制劑只有MK-8628（NCT02296476），BET抑制劑對腦膠質瘤的治療作用有待進一步的研究。

4 BRD4抑制劑在腦膠質瘤治療中的作用

4.1 JQ1和I-BET Fiskus等［26］發現，JQ1和I-BET具有相似的化學結構和靶向抑制模式。這2種抑制劑都可以與BET蛋白的布羅莫結構域競爭性地結合乙酰化肽，從而導致細胞暴露于這些化合物的時候，BET蛋白從染色質上被置換下來，影響BET蛋白發揮正常功能［24，27］。JQ1是一種基于噻吩二氮平的小分子，在低納摩爾范圍內對BET亞家族表現出良好的抑制作用。JQ1的晶體結構尤其與BRD4的BD1結構域具有良好的結構互補性，因此JQ1對BRD4蛋白的效果特別明顯。此外，JQ1具有良好的血腦屏障通透性（AUCbrain/AUCplasma=98%），這為應用于治療腦膠質瘤提供了可能［28］。

JQ1在不同遺傳背景的膠質瘤細胞中具有廣泛的活性，對不同遺傳背景的膠質瘤細胞均可有效地抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，誘導細胞產生細胞周期阻滯。膠質瘤的一些關鍵信號通路如c-Myc、Akt、p53或Rb通路等對JQ1都表現出很高的敏感性［29-30］。除了傳統的藥物治療以外，近年來還出現了非電離光動力療法（photodynamic therapy，PDT）治療腦膠質瘤的案例，PDT與傳統的膠質瘤細胞治療相比具有更明顯抗腫瘤優勢。JQ1可以抑制iNOS表達，提高PDT細胞毒性，抑制iNOS/NO對PDT的抵抗作用，從而有效提高抗腫瘤效果；經PDT后，JQ1可以抑制U87細胞中BRD4與NF-κB p65之間的相互作用，這表明JQ1能夠極大地提高PDT治療腦膠質瘤或其他惡性腫瘤的臨床效果；這是在體外實驗中展現出非常好的療效，但還需進一步開展體內實驗來深入驗證［31］。JQ1和I-BET除了抑制膠質瘤細胞增殖外，在促進細胞分化方面也具有一定的潛能。惡性膠質瘤細胞能夠依賴特有的表觀遺傳途徑抑制自身的分化，從而維持異常的自我更新［32］。在彌漫性內生性腦橋膠質瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）中，JQ1在有效抑制DIPG細胞增殖的同時能夠有效促進腫瘤細胞終末神經元分化［33］。I-BET151有效抑制膠質瘤細胞增殖的同時可以有效促進鼠源膠質祖細胞分化為少突膠質細胞［34］。關于BRD4抑制劑在膠質瘤分化方面的作用還很少，有待進一步研究。

4.2 OTX015（MK-8628） OTX015（MK-8628）是一種新型的BRD2/3/4抑制劑，具有良好的通過血腦屏障的能力（腫瘤∶血漿=1∶10），其在腫瘤中的水平是正常組織的7至15倍，并與腫瘤組織優先結合。由于OTX015的親脂性，瘤周皮膚和肌肉組織OTX015蓄積較多［35］。OTX015對膠質瘤細胞的增殖和細胞周期進展起到了明顯的抑制作用，并且比JQ1效力更強［半數細胞生長抑制濃度（the concentration causing 50%cell growth inhibition，GI50）=183.0～223.1 nmol/Lvs618.1 nmol/L］。針對OTX015的臨床前藥理學研究為OTX015進入臨床治療膠質母細胞瘤提供了理論基礎。目前，對OTX015治療成年膠質母細胞瘤患者的劑量遞增研究（NCT02296476）正在進行［36］。

4.3 BRD4抑制劑與其他藥物聯合用藥的發展前景 膠質瘤具有很強的異質性，單一小分子藥物治療膠質瘤的效果有限，因此BRD4抑制劑與其他藥物聯合用藥為腦膠質瘤的治療開辟一個新途徑［34，37］。目前，已有幾種BET抑制劑與其它抑制劑聯合用藥處于臨床試驗階段（表2）。

表2 BET抑制劑在聯合治療中的臨床前研究Table 2.Preclinical studies of BETinhibitor in combination therapy（https：//www.clinicaltrials.gov/）

4.3.1 BRD4抑制劑與組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑聯合用藥 Fiskus等［26］的研究表明，在急性髓系白血病（acute myeloid leuke‐mia，AML）細胞中采用JQ1與HDAC廣譜抑制劑panobinostat聯合用藥具有協同作用。JQ1和panobi‐nostat協同作用顯著降低了神經母細胞瘤細胞中NMyc和Bcl-2的表達，有效抑制腫瘤發展［38］。同樣，在膠質瘤細胞中panobinostat和JQ1或OTX015聯合用藥對U87或U251細胞具有良好的協同作用，能夠有效抑制抑制細胞增殖，提高了caspase活性，有效誘導細胞凋亡，提高對細胞的毒性。此外，panobinostat與JQ1或OTX015聯合用藥對GBM相關致癌基因或通路的抑制作用增強，并且高度誘導GBM相關抑癌基因的表達增強［30］。抑制BRD和HDAC蛋白會抑制膠質母細胞瘤細胞糖酵解和氧化能量代謝，導致細胞內ATP產生和ATP總量的減少［39］。JQ1/OTX015和panobinostat都有良好的血腦屏障通透性，這為2種表觀遺傳學藥物的聯合應用提供了可能［40-41］。

近年來，有文獻提出了多元聯合治療的概念：HDAC抑制劑（如panobinostat和vorinostat）、BRD抑制劑（OTX015）和多激酶抑制劑（sorafenib）聯合用藥治療腦膠質瘤。HDAC抑制劑與BRD抑制劑聯合的基礎上加入sorafenib，有效抑制了U87-EGFRvIII模型和患者來源的異種移植小鼠模型腫瘤生長，延長了小鼠生存期［39］。三聯療法治療腦膠質瘤療效顯著，在一定程度上可以考慮作為惡性腫瘤的有效治療方法。

4.3.2 BRD4抑制劑與替莫唑胺（temozolomide，TMZ）聯合用藥 TMZ是一種口服的二代烷化劑咪唑四嗪類衍生物，易通過血腦屏障，是臨床治療惡性膠質瘤的標準一線化療藥物。TMZ主要通過攻擊腫瘤細胞DNA，使之產生烷基化損傷，進而形成DNA交聯，最終導致腫瘤細胞死亡。TMZ同步配合放化療雖然具有一定療效，但有效率不足50%，造成這一結果的主要原因與膠質瘤細胞對TMZ的耐藥密切相關［42-43］。基因富集分析發現，對JQ1敏感的GBM細胞主要富集在DNA修復機制相關通路上，因此對JQ1敏感的膠質瘤細胞對烷化劑有更好的反應。將TMZ與JQ1相結合可以通過調節DNA損傷應答來克服細胞對TMZ耐藥產生的DNA修復機制的激活。此外，JQ1能夠上調促凋亡和抑制細胞增殖相關基因的表達，使GBM細胞更容易受到TMZ細胞毒性的作用，JQ1與TMZ聯合用藥顯示出非常好的協同作用，為JQ1進一步的臨床應用和解決TMZ耐藥提供了具有可行性的方法［15，23］。

OTX015與TMZ聯合用藥能夠有效提高異種移植腦膠質瘤小鼠的生存率，并且OTX015劑量組均未發現任何毒性，而TMZ組5 d后小鼠體重明顯下降。在不存在藥物毒性的情況下，OTX015和TMZ聯合用藥能夠有效提高GBM模型小鼠生存期。OTX015與TMZ、依維莫司或SN38聯合用藥時對膠質瘤細胞也表現出協同作用。雖然單獨使用OTX015發揮了良好的抗惡性膠質瘤作用，但隨著對表觀遺傳藥物領域研究的不斷深入，OTX015聯合常規化療或靶向藥物對惡性膠質瘤的治療更能發揮良好的潛力［36］。此外，I-BET151可通過PUMA誘導GBM細胞增強對TMZ的敏感性［44］。綜上所述，BRD4抑制劑與TMZ聯合用藥，為解決GBM對TMZ耐藥提供了新思路。

4.3.3 雞尾酒治療法 如何在抑制GBM細胞增殖的同時促進細胞分化是提高GBM治療有效性的關鍵問題。有研究提出小分子介導的重編程可以將GBM細胞轉化為神經元。研究表明，forskolin、ISX9、CHIR99021、I-BET151和DAPT混合形成的小分子雞尾酒可以高效地將GBM細胞轉化為神經元。遺傳分析顯示這種小分子雞尾酒能夠上調Ngn2、Ascl1、Brn2和MAP2基因表達，導致神經元重編程。這些重編程細胞高表達神經元標志物和前神經轉錄因子，形態學和免疫熒光檢測證明重組細胞具有與神經元表型相似的特征。此外，雞尾酒法可以抑制GSCs神經球的形成，證實該療法能夠抑制GSCs的自我更新能力［45］。這項較新穎的研究證明了將GBM細胞重編程為神經元是一種有潛力的治療惡性膠質瘤的方法。

5 結語與展望

近年來，BRD4在腦膠質瘤中發揮的作用逐步受到關注，但是目前針對于BRD4抑制劑在腦膠質瘤中的研究和應用仍然具有局限性。治療GBM的有效性受到血腦屏障和對單一藥物易產生耐藥性的限制，因此劑型優化和聯合用藥有望成為提高BRD4抑制對腦膠質瘤治療效果的有效手段。有文獻報道，與無載體組相比，利用轉鐵蛋白納米粒子（transfer‐rin-coated nanoparticle，Tf-NP）為載體攜帶TMZ和JQ1可有效促進膠質瘤細胞DNA損傷和凋亡。對GBM原位移植瘤小鼠模型進行小鼠活體成像檢測表明，攜帶TMZ和JQ1的Tf-NP具有良好的血腦屏障滲透性，能夠直接攜帶藥物作用于腫瘤組織。此外，與無載體組相比，Tf-NP聯合用藥載體組能夠更好地減輕小鼠腫瘤負擔，延長小鼠生存期［46］。藥物載體的創新性為BRD4抑制劑更好應用于治療腦膠質瘤提供了新的研究方向。目前的研究在一定程度上證明了BRD4是極具潛力的腦膠質瘤治療靶點，未來進一步深入研究BRD4將為探尋膠質瘤表觀遺傳學新靶點、新機制提供理論依據。