特異標記生血內皮的誘導性多能干細胞系的構建*

洪平山，于 波▲，劉雨婷，劉高科，侯思元，陳捷凱，王金勇，蘭 雨△

（1暨南大學基礎醫學院，廣東廣州510630；2中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，廣東廣州510700；3中國人民解放軍總醫院第五醫學中心，北京100071）

造血干細胞（hematopoietic stemcells，HSC）位于成體造血系統的最上游，具有自我更新和分化為各種譜系血液細胞的潛能，HSC的發生發育與血管生血內皮密切相關［1］。HSC起源于胚胎發育中期的定向造血階段，主要發生于主動脈-性腺-中腎（aorta-go‐nad-mesonephros，AGM）區域的背主動脈腹側［2-3］，這些定位在動脈血管內皮并具有生血潛能的細胞群體就是生血內皮細胞（hemogenic endothelial cells，HEC），HEC經過內皮-造血轉化向動脈血管管腔內出芽形成動脈內造血簇，HSC即產生于這些造血簇。由于在胚胎造血發生位點的HEC數量稀少且轉瞬即逝，在體內的功能驗證也存在技術瓶頸，這些因素增加了精準捕獲這群具有HSC重建潛能的HEC的困難。為此，我們前期構建了全新的基因敲入Neurl3-EGFP熒光報告小鼠，實現了對“具有HSC命運的HEC（HSC-primed HEC）”的高效識別與分離［4］。為了更好地利用造血發育理論指導體外造血再生，我們借鑒Takahashi等［5］通過逆轉錄病毒導入4個經典轉錄因子的細胞重編程方案，其中選取Oct4、Sox2和Klf43個轉錄因子驅動已分化的Neurl3-EGFP小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF），簡稱為NE-MEF，轉分化為具有胚胎干細胞（embry‐onic stem cells，ESC）形態與功能的誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC），簡稱為NEiPSC，通過各項多能性驗證，完成了可高效指示造血發育的功能細胞系的構建，為后續的體外定向誘導血液再生提供一種重要的報告工具。

材料和方法

1 實驗動物

本課題組利用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級的C57BL/6N品系小鼠（合格證號：111021300011679；購自北京百奧賽圖生物技術有限公司），通過CRISPR/Cas9技術介導的基因敲入策略構建的全新報告基因Neurl3-EGFP小鼠，毛發純黑色，8～10周齡，體重在18～20 g之間，取3只雌鼠與1只雄鼠合籠并做好標記。由于其可在生血內皮細胞與造血干/祖細胞階段特異性啟動EGFP高表達，故適用于特異性，標記造血發育中內皮-生血轉化等重要事件。

2 主要試劑和材料

質粒（pMXs-Oct4，pMXs-Sox2和pMXs-Klf4）購自Addgene；Plat-E細胞購自Cell Biolabs；轉染試劑Lipo6000和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Anti-NANOGanti‐body購自Bethyl；Anti-OCT3/4山羊抗兔IgG購自San‐ta Cruz；Alexa Fluor 568標記的山羊抗兔IgG和Al‐exa Fluor488山羊抗兔IgG和驢抗小鼠IgG購自Ab‐cam；Trizol Reagent購自Invitrogen；ReverTra Ace qP‐CR RT Master Mix with gDNA Remover購自TOYO‐BO；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix購自上海翊圣生物技術有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit購自北京天根公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、高糖DMEM培養基、N-2添加劑（N-2）、B-27添加劑（B-27）、Trypsin-EDTA（0.05%和0.25%）、雙抗（1×105U/L青霉素+100 mg/L鏈霉素）、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺（1%GlutaMAX）、β-巰基乙醇、重組人堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和DPBS均購自Gibco；DAPI、polybrene、維生素C和氯化鋰均購自Sigma-Aldrich；白血病抑制因子（leuke‐mia inhibitory factor，LIF）購自Millipore；CHIR99021和PD0325901購自Selleck。

3 主要方法

3.1 細胞培養液 Plat-E細胞培養液：高糖DMEM培養基/10%FBS。MEF細胞培養液：高糖DMEM培養基/10%FBS，含1%NEAA與1%雙抗。iCD1無血清培養液：高糖DMEM培養基/N-2（0.5×）/B-27（0.5×）混合，添加雙抗、1%GlutaMAX、1%丙酮酸鈉、1%NEAA、100μmol/Lβ巰基乙醇、50 mg/L維生素C、10μg/L bFGF、5 mmol/L氯化鋰、1×106U/L LIF、CHIR99021（GSK3β抑制劑，2 000×）和PD0325901（MEK抑制劑，2 000×），此培養液可提高重編程效率。小鼠多能干細胞維持培養液：含15%FBS的高糖DMEM培養基，加入雙抗、1%GlutaMAX、1%丙酮酸鈉、1%NEAA、100μmol/Lβ-巰基乙醇1×106U/L LIF、CHIR99021（2 000×）和PD0325901（2 000×）。

3.2NE-MEF的分離與培養 性成熟雌鼠與雄鼠合籠后，次日上午觀察雌鼠陰道口有乳白色膠凍狀陰道栓即可確定受孕，記為胚胎第0.5天；在胚胎第12.5～15.5天將孕鼠脫臼安樂死后浸泡于75%乙醇中消毒20 min，在無菌條件下剖腹取出妊娠子宮，剪開宮腔夾出妊娠囊，去除胚胎頭部、四肢和內臟，僅留取軀干部分，PBS洗3次；轉至無菌不銹鋼篩網中用0.25%Trypsin-EDTA浸泡，用滅菌注射器內芯研磨成細胞懸液轉入離心管；室溫下消化5 min后加入3倍體積培養液終止消化。以1個胚胎對應1個T75培養瓶的比例進行原代細胞培養，置于37℃，5%CO2培養箱培養，次天更換新鮮培養液，傳代后即為P1代。

3.3NE-MEF重編程為NE-iPSC 待10 cm培養皿中Plat-E細胞覆蓋約90%即用0.25%胰酶消化并計數，按每個10 cm培養皿接種8×106個細胞量的比例將其分盤，每盤對應轉染pMXs-Oct4/Sox2/Klf4各個質粒，次日即可轉染質粒；按試劑盒說明書將含有相應體積質粒的750μL Opti-MEM培養基與含有30μL脂質體Lipo6000的Opti-MEM培養基750μL相混合，室溫靜置5 min后轉入含Plat-E細胞的培養皿；轉染后6 h更換新鮮培養液；36 h后第1次收取病毒上清液，過濾備用；隔24 h第2次收上清；提前兩天將NE-MEF復蘇接種于6 cm培養皿，待其80%融合即可消化計數，以每孔2×104的細胞量接種于包被0.1%gelatin的12孔板；將病毒上清液與基礎培養液按1∶1比例混合，添加polybrene（1 000×）后感染NEMEF；24 h后重復第2次感染；隔18 h換成iCD1無血清培養液啟動重編程；24 h后換液即為Day1，一般Day6前后可見iPSC克隆，用玻璃管針挑出克隆接種至已鋪好飼養層細胞的24孔板中，換成小鼠多能干細胞維持培養液；隔日可將已貼壁的克隆消化成單細胞傳至12孔板。

3.4NE-iPSC的鑒定

3.4.1 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色 使用4%多聚甲醛將NE-iPSC原盤細胞固定30 min，PBS洗3次，每次5 min，取3.3μL BCIP與6.7μL NBT加入1 mL AP底物溶液，混勻后轉入6孔板培養皿的1個孔中，室溫避光染色30 min，ddH2O洗兩次終止染色反應，拍照記錄。

3.4.2NE-iPSC多能性基因表達水平的分析 消化收集NE-iPSC后用Trizol Reagent裂解法提取RNA并檢測RNA濃度與純度。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。cDNA稀釋后用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行RT-qPCR。同時設置NE-MEF和小鼠ESC作為對照，管家基因Gapdh作為內參照，每次均進行不少于3次的獨立分析驗證。數據經2?ΔΔCt法計算相對基因表達水平。RT-qPCR程序：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，60 s退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環。所用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

3.4.3 移植NE-iPSC產生畸胎瘤 消化收集NEiPSC后用PBS洗1遍，4℃、250×g離心5 min，計數，用含2%FBS的DPBS重懸細胞，在小鼠腹部與大腿連接處作皮下注射，每個部位的移植細胞量為（1～2）×106，1個月后可觀察到腫瘤包塊生長，頸椎脫臼處死小鼠后分離出完整腫瘤，DPBS洗1遍，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色后觀察來自三個胚層的不同組織細胞的病理變化并記錄。

3.4.4 核型鑒定 待無飼養層細胞的NE-iPSC生長密度達80%，更換新鮮培養液，加秋水仙素使終濃度達0.2 mg/L，置于37℃培養箱60 min；吸棄培養液用DPBS清洗，0.25%胰酶消化收集細胞，250×g離心5 min；加37℃預熱的0.075 mol/L氯化鉀溶液7 mL重懸，37℃水浴20 min；用固定液（甲醇與冰醋酸按3∶1配制）預固定3 min，150×g離心5 min后棄上清，加7 mL固定液37℃水浴40 min；150×g離心5 min，保留適量固定液重懸細胞；在預冷的載玻片上滴片，轉入75℃烘箱烘3 h；0.05%胰酶消化8 s后轉入生理鹽水終止消化；用Giemsa染液染色10 min，用水輕輕沖洗后晾干，油鏡下觀察分裂相。

3.4.5 免疫熒光染色 將NE-iPSC種到已包被0.1%gelatin并鋪有小圓蓋玻片的6孔板內，待克隆長到合適大小即吸棄培養液，DPBS洗2遍，加4%多聚甲醛1 mL室溫固定30 min；DPBS洗2次，加入1 mL封閉通透液（3%BSA與0.2%Triton X-100按1∶1混合），室溫靜置1 h；DPBS清洗3次，按抗體最佳使用濃度用3%BSA稀釋各種Ⅰ抗，夾出圓玻片，細胞面朝上，用巴氏滴管輕輕滴加適量Ⅰ抗，4℃孵育過夜；玻片放回培養皿用DPBS洗4遍，按照類似Ⅰ抗的步驟染Ⅱ抗，室溫下避光孵育1 h；DPBS洗5次，DAPI染色孵育1 min，DPBS洗3次；在載玻片上滴加5μL抗熒光猝滅封片液，玻片細胞面朝下輕輕壓下完成封片，鏡下觀察熒光并記錄。

3.4.6NE-iPSC擬胚體形成實驗與測序比對驗證

將25μL細胞懸液滴于培養皿蓋的內側，培養皿懸滴法培養2.5 d，收集后在鏡下觀察擬胚體形態并記錄；應用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取NEiPSC基因組，對PCR擴增所得序列進行測序并與EGFP基因序列相比對。PCR所用引物序列見表2。

表2 PCR擴增EGFP基因所用引物序列Table 2.Sequences of the primers of EGFP gene used in PCR amplification

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0.1統計軟件對實驗數據進行統計學分析，數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NE-MEF的分離與培養

Neurl3-EGFP熒光報告小鼠在胚胎第12.5～15.5天，安樂死孕鼠后取出胚胎，分離并培養胚胎成纖維細胞，選取代數在P3以內的成纖維細胞通過共感染三因子啟動重編程，結合iCD1高效誘導體系確立NE-iPSC重編程方案。實驗流程示意圖見圖1。

Figure 1.Schematic representation of NE-iPSCgeneration protocol.圖1 NE-iPSC重編程示意圖

2 NE-MEF重編程為NE-iPSC

感染逆轉錄病毒前NE-MEF在鏡下呈長梭型網狀交織，經2 d的病毒感染后換為iCD1去血清培養液，感染后第3天左右即可觀察到NE-MEF逐漸呈向心性匯聚成團，第6天左右在鏡下可見鳥巢樣NE-iP‐SC克隆，克隆輪廓清楚，克隆內細胞間結合緊密，細胞核偏大。挑取單個克隆接種于飼養層細胞上很快貼壁，2～3 d后克隆增大，形態圓且邊緣整齊，類似小鼠ESC，亮度稍高。將單個克隆消化成單細胞傳代于飼養層細胞上，3 d左右即可形成較多稍隆起的大小均勻的類圓形細胞克隆。見圖2。

Figure 2.Reprogramming process of NE-MEF.The scale bar=200μm.A：the morphology of NE-MEFs before infection；B：day 3 after infection，the morphology of NE-MEFs were dramatically changed in iCD1 medium；C：day 6 after infection，NEMEFs formed ESC-like colonies；D：cultured day 2 on the feeder，single NE-iPSC clone was trypsinized into single-cell suspensions and replanted into fresh feeder.圖2 NE-MEF的重編程過程

3 NE-iPSC細胞系的多能性檢測

經重編程誘導產生的NE-iPSC具有典型的胚胎干細胞形態，呈堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）染色陽性，見圖3。RT-qPCR結果說明NE-MEF來源的NE-iPSC克隆表達的多能性基因與ESC相當，包括Oct4、Sox2、Nanog和Rex1；多能性基因的表達水平較未重編程的NE-MEF明顯增高（P<0.01），見圖4。將NE-iPSC移植到重度聯合免疫缺陷（se‐vere combined immunodeficiency，SCID）小鼠體內進行多能性驗證，歷時一個月可在注射部位觀察到較大體積的畸胎瘤，取出腫瘤組織經固定、包埋、切片及HE染色，在光鏡下觀察到三個胚層來源的不同組織細胞，其中以腺體樣細胞、腸腔黏膜上皮細胞、肌細胞與神經細胞等較為典型，見圖5，在同期移植了ESC的對照小鼠也觀察到同樣的現象。核型鑒定結果表明，NE-iPSC克隆具有正常的20對染色體，見圖6，基本排除重編程過程產生的核型異常。免疫熒光染色實驗結果顯示Nanog和Oct4表達增加，見圖7。NE-iPSC懸滴法培養2.5 d即可演繹為擬胚體，克隆直徑在150～300μm之間，呈類圓形，邊緣整齊光滑，見圖8，與同期懸滴培養的ESC表現基本一致。

Figure 3.Morphological change of established NE-iPSCs and alka‐line phosphatase（AP）staining（scale bar=200μm）.A：phase micrographs of NE-iPSCs were shown，which were morphologically indistinguishable from ESC；B：NE-iPSCsexpressed APpositive as well as ESC.圖3 NE-iPSC呈堿性磷酸酶染色陽性

4 EGFP的測序驗證

對NE-iPSC基因組DNA的PCR擴增序列進行測序，與EGFP片段進行比對，顯示其序列完全一致，見圖9，與Neurl3-EGFP熒光報告小鼠的打靶策略示意圖相符，見圖10，證實NE-iPSC的Neurl3-EGFP在重編程過程中堿基序列并未發生突變。

討 論

特異識別生血內皮的標志基因對于造血發育與再生的研究具有重大意義，不僅可以明確不同細胞譜系的來源，而且可以提高體外定向誘導產生造血干/祖細胞的效率。近幾年，關于生血內皮標志基因的研究層出不窮。Swiers等［6］用Runx1 23GFP+報告基因標識內皮細胞，但未能誘導產生具有造血和內皮雙潛能的細胞群；Robin團隊通過轉基因報告小鼠Gfi1-Tomato揭示內皮-造血轉化事件，卻因為HEC與非HEC在轉錄組水平高度相似，入選的細胞群體被認為不具有典型代表性［7］。為了篩選特異性更強的內皮標志基因，結合此前在人胚胎造血干祖細胞發育過程中密切相關的生血內皮細胞表面標志的發現［8］，通過單細胞轉錄組學測序非偏頗地鑒定HSCprimed生血內皮細胞，選取在HSC-primed HEC特異標記基因中表達最顯著的Neurl3，利用CRISPR-Cas9技術構建Neurl3-EGFP基因敲入熒光報告小鼠［4］，基因打靶策略示意圖見圖10。

Figure 4.RT-qPCR was used to analysis the expression of pluripotent genes in NE-iPSC.mESC：mouse embryonic stem cells.The expression of pluripotent markers in NE-iPSCwas significantly increased compared with NE-MEF（control）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NE-MEFgroup.圖4 RT-qPCR對NE-iPSC克隆多能性基因的表達分析

Figure 5.Paraffin sections of teratoma formed by NE-iPSC（HE staining）.The scale bar=100μm.A：glandular cells；B：gut-like epithelium；C：muscle cells；D：neural cells.圖5 移植NE-iPSC可形成畸胎瘤

Figure 6.Karyotype identification for NE-iPSC.圖6 核型鑒定

在此之前，Neurl3并未在血液領域有相關的研究報道。在小鼠胚胎造血發育過程中，僅有主動脈內皮層特異表達Neurl3，這些表達Neurl3的細胞幾乎都共表達Runx1與CD44，雖然在胚胎第10天的主動脈下間質也有部分細胞表達Runx1，但是Neurl3僅在主動脈內皮層與Runx1共表達［4］。由此可對位于AGM區主動脈腹側的HEC和非HEC進行甄別。可見，Neurl3-EGFP不僅可以精確定位HEC，而且可以高效富集HSC-primed HEC。

Figure 7.Results of immunofluorescence staining for NE-iPSC.The scale bar=100μm.A：red-Nanog stood for cell nucleus in NE-iPSC；B：green-Oct4 stood for cell nucleus in NE-iPSC；C：blue-DAPIstood for cell nucleus in NE-iPSC.圖7 NE-iPSC免疫熒光染色

由于臨床治療和生物醫藥工程等領域對血液細胞，尤其是HSC的需求日益增加。學者們不斷對體外血液再生提出改良方案，包括了用人ESC來源的HEC移植到小鼠體內使其分化為造血干祖細胞［9］，以及直接將小鼠成體血管內皮細胞誘導為HSC［10］。這些誘導策略都基于對造血發育事件的正確認識［11］，但是存在著誘導效率與可重復性等問題。為了建立更高效的誘導體系，Guo等［12］用雙因子驅動多能干細胞實現了造血祖細胞的轉化，但該體系在誘導產生造血祖細胞效率方面仍有待提高。在本研究中，我們把Neurl3-EGFP報告基因小鼠體細胞重編程為NE-iPSC并進行多能性驗證。NE-iPSC作為體外誘導分化體系的起始細胞，Neurl3的引入可在體外再生造血干祖細胞過程中實現對HSC-primed HEC的實時監測，在提高造血干祖細胞再生效率的同時，也有助于指導體外誘導體系的進一步優化。

Figure 8.Embryoid body of NE-iPSC.The scale bar=100μm.圖8 NE-iPSC擬胚體形成實驗

由于ESC細胞系的構建存在一定技術瓶頸，而且iPSC重編程技術相對成熟且高效，同時規避了免疫排斥與道德倫理等問題［13］，故確定構建NE-iPSC。考慮到Yamanaka經典四因子的c-Myc是癌基因，四因子重編程方案可能出現阻礙重編程進度的中間狀態pre-iPSC［14］。同時，過表達c-Myc可能引起細胞癌變，細胞生長速度過快容易造成密度過大，在早期可因接觸性抑制影響重編程的進度［15］。本研究利用iCD1去血清培養液［16］，高效重編程得到在形態、多能性和穩定性等方面均不亞于ESC的NE-iPSC。NEiPSC作為精準識別HSC-primed HEC強特異性的生物學工具，在未來的單克隆、無損、高通量的體外誘導體系的評估中具有廣闊的應用前景，有望為人類臨床治療級別的造血干祖細胞在體外高產量再生提供技術參考。

Figure 9.NE-iPSCDNA sequencing of EGFP and comparison analysis.圖9 比對NE-iPSC EGFP序列的測序結果

Figure 10.Schematic image of targeting strategy.圖10 Neurl3-EGFP基因敲入小鼠打靶策略模式圖