孢子絲菌病診斷及治療進展*

侴夢微，郭亞南，劉慧瑜

（1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 皮膚性病科，黑龍江 哈爾濱150001；2.黑龍江省醫院南崗院區 皮膚性病科, 黑龍江 哈爾濱150000）

孢子絲菌病是由申克孢子絲菌復合體感染引起的一種慢性炎癥性肉芽腫性真菌病，臨床表現多樣。診斷的金標準為經典的菌種培養及鑒定[1]，但其耗時較長，且結果易受雜菌影響，不利于臨床的快速診斷。隨著分子生物學、血清學及免疫學研究的深入，涌現出一系列快速的診斷方法，如基于聚合酶鏈反應（PCR）的一系列診斷方法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、孢子絲菌皮內試驗等，并且不斷改良。孢子絲菌病的治療方法也逐漸增多，如傳統治療藥物的新發現、治療的新手段、新藥的研究等。本文圍繞孢子絲菌病的診斷及治療的進展進行綜述。

1 診斷

孢子絲菌病臨床表現多種多樣，可分為皮膚型（固定型、淋巴管型及播散型）和皮膚外型，臨床中以皮膚型多見，其中又以固定型與淋巴管型為主。固定型好發于面及頸部、手背、前臂等外露部位，局限于初發部位；皮損呈多形性，常見的皮損形態有丘疹、結節、膿皰、浸潤樣斑塊、潰瘍、肉芽腫，還有相對少見的疣狀改變及呈壞疽樣皮損。淋巴管型好發于四肢，多為單側發病，典型皮損通常發生在外傷后5～180 d，局部出現丘疹或皮下結節，呈紅、紫或黑色，中央壞死形成潰瘍，表面有膿液或覆有厚痂，經過數天或數周，沿著淋巴管出現向心性排列成串的新結節，一般后發生的結節較少破潰，其受累的淋巴管會出現纖維化。典型病理表現為真皮和皮下組織的化膿性肉芽腫性炎癥，PAS 染色后可有酵母相病原菌，并可見細胞內或細胞外孢子、星狀體、雪茄樣小體，偶見菌絲。但由于菌數較少，病理檢查很難見到典型星狀體與孢子。目前臨床上孢子絲菌病的診斷主要依靠典型臨床表現+真菌培養和/或組織病理檢查，診斷的金標準為真菌培養。然而培養往往需要2～4 周，耗時較長，且結果易受雜菌污染出現假陰性。亟待快速、準確的診斷方法以滿足臨床及流行病學研究的需要。近年來涌現出一系列分子生物學、血清學及免疫學診斷方法，快速、準確，但由于種種原因尚未普及應用。

1.1 分子生物學

分子生物學是生物學研究的前沿與生長點，自20 世紀50年代廣泛應用于臨床及實驗研究，其主要研究領域包括蛋白質體系、蛋白質-核酸體系（中心是分子遺傳學）和蛋白質-脂質體系（即生物膜）。孢子絲菌病的分子診斷方法以PCR 為主導。PCR 可擴增特定的遺傳區域以鑒定病原體，主要包括巢氏PCR、PCR-RFLP、滾輪擴增（rolling circle amplification, RCA）、T3B 指紋識別、物種特異性PCR、DNA 測序等，這些分子檢測手段都具有標準的操作過程，特異性強、敏感性高、簡便快速，但其中大部分方法對分離培養物及DNA 的純度要求較高，需要高級儀器，操作要求高且費用高，不能對菌種進行鑒定，限制了臨床應用和推廣。以下3 種分子方法能夠克服或部分克服以上限制。

1.1.1 RCARCA 自20 世紀90年代以來已廣泛應用于病毒、細菌的鑒定工作。RODRIGUES 等[2]研究表明其也可用于真菌鑒定：他們設計、優化6 種物種特異性掛鎖探針進行RCA 以檢測及鑒定孢子絲菌DNA（直接從10 d 的96 株真菌菌落中提取和純化DNA，菌型包括申克孢子絲菌、球形孢子絲菌、巴西孢子絲菌、墨西哥孢子絲菌、盧艾里孢子絲菌和蒼白孢子絲菌），BLASTn 分析其特異性為100%，RCA通過系統發育分析及物質特異性PCR 鑒定準確性為100%。還可從土壤、植物、小鼠脾臟及糞便等混合物中選擇性地檢測孢子絲菌DNA。RCA 不需要精密儀器，成本低，操作過程便捷、快速，易于判讀結果，特異性、準確性高，對標本純度及濃度要求低，可用于檢測復雜樣本，降低了臨床開展的難度，未來可取代DNA 測序及PCR-RFLP 用于臨床診斷及流行病學的研究，特別是在疾病流行地區及低收入地區。但其敏感性一般，檢測限（limit of detection, LOD）為3×106拷貝，可做改良以提高敏感性。

1.1.2 T3B 指紋識別T3B 指紋識別技術是使用通用引物T3B（5'-AGGTCGCGGGTTCGAATCC-3'）進行PCR 檢測，通過所得指紋譜進行物種鑒定。OLIVEIRA 等[3]使用T3B 指紋識別技術鑒定43 株來自于臨床和環境中的孢子絲菌分離株（申克孢子絲菌、球形孢子絲菌、巴西孢子絲菌、墨西哥孢子絲菌、盧艾里孢子絲菌和蒼白孢子絲菌），提取菌絲相的DNA，通過相同條件下、3 個不同實驗室重復至少3 次，再經系統發育分析其準確性為100%。雖然種內T3B 譜非100% 相似，但在變異范圍內（70%～85%），種間差異也足以明確區分所有物種并對其分組。此方法需要的專業技術知識較少、成本低，具有可重現性，可取代測序應用于流行病學的研究，臨床上有應用前景。但其敏感性和特異性未明確提出，亦未用臨床樣本行此檢測，需進一步驗證。且要避免人工判讀結果時出現誤判。

1.1.3 多重實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR 相較于傳統PCR 更快速、敏感，污染低，廣泛應用于病原體檢測，但尚未用于孢子絲菌檢測。ZHANG 等[4]開發一種新的多重實時熒光定量PCR 方法（基于CAL）鑒定臨床相關的孢子絲菌（球形孢子絲菌、申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌）：25 份孢子絲菌DNA 模板（21 份球形孢子絲菌、3 份申克孢子絲菌、1 份巴西孢子絲菌、25 份菌株在2%馬鈴薯葡萄糖瓊脂玻片上于28℃傳代培養7～14 d，切成小塊置于液氮中徹底研磨后提取、純化DNA）陽性檢出率100%；33 份DNA 模板（28 份其他真菌、3 份細菌、1 份人、1 份小鼠）檢測特異性為100%；將40 份臨床樣本、6 份加標樣本（人工感染申克孢子絲菌、巴西孢子絲菌）的結果與培養和物種特異性PCR 的結果比較以評估準確性。多重實時熒光定量PCR 的陽性檢出率與物種特異性PCR 存在差異（采用配對χ2檢驗，P<0.01），與培養差異無統計學意義（P>0.05）；構建3 個質粒（球形孢子絲菌、申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌）確定LOD 為10 拷貝、10 拷貝、100拷貝，使用9 種不同量質粒的組合以檢驗其是否能檢測共感染。該方法對樣本要求低，敏感性、特異性和準確性高，還可檢測共感染，有標準化操作更容易判斷結果，成本低。但該方法只用申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌的臨床樣本進行驗證，應增加用以驗證此方法的臨床樣本，并且可使用膿腫或活動性病變的分泌物為模板以進一步驗證。若此方法確實可行，可開發成商業試劑盒用于部分菌種的鑒定，因其只能檢測3 種病原菌，并不能滿足臨床對疾病診斷的需求，需加以完善。

1.2 血清學

血清學鑒定是采用含有已知特異性抗體的免疫血清（診斷血清）與分離培養出的未知純種細菌或標本中的抗原進行血清學反應，以確定病原菌的種型。血清學鑒定方法包括沉淀技術、凝集技術及ELISA。沉淀和凝集雖特異性高但敏感性低；ELISA 敏感性、特異性更高，且可對治療效果進行監測，缺點是仍存在假陽性。ELISA 法診斷孢子絲菌病相較于傳統的真菌培養操作簡單、快速，但其廣泛應用受到假陽性的限制。COELHO 等[5]將患者血清離心10 min 后置于3 ml 無菌管中-20℃冷凍保存，將6 mol/L 尿素加入血清中溫育5 min 后，室溫下進行ELISA，獲得100%的敏感性和特異性，并經20 份患者血清驗證。此ELISA 法只需在原基礎上稍作修飾，即可克服存在假陽性的缺點，但目前用以驗證的樣本量較少，需大樣本的患者血清驗證其敏感性和特異性。若此改良ELISA 法通過大樣本的驗證，則可做為一種有效的孢子絲菌病診斷方法加以廣泛應用。

1.3 免疫學測試

孢子絲菌皮內試驗是在患者前臂皮內注入孢子菌素M（菌絲體），48 h 后判定結果（與結核菌素皮膚試驗相同的標準，當存在硬結并且≥0.8 cm 時，結果為陽性）。此方法能夠了解患者細胞免疫狀態，可作為孢子絲菌病流行病學研究的基本工具[6]。但美國或大多數歐洲國家并不接受該檢查，認為其缺乏標準化，細胞免疫改變的患者（主要是艾滋病、糖尿病和播散性孢子絲菌病）還可出現假陰性[7-9]。BONIFAZ 等[10]收集138 例臨床懷疑孢子絲菌病的患者對其進行孢子絲菌素皮內試驗，后又行真菌培養來驗證結果的準確性，結果顯示皮內試驗敏感性為94.5%，特異性為95.2%，假陽性為7.1%。表明孢子絲菌皮內試驗至少可作為孢子絲菌病的輔助診斷手段，在等待培養結果期間，可為試驗性治療提供依據，盡早治療，有效控制病情的發展，縮短治療時間。在疾病的高發地區可以作為篩查手段，控制疾病的流行。此技術在我國尚未開展。另外還有直接免疫熒光等技術，雖然非常敏感，但是因為價格較高，在欠發達地區不做為常規手段。

2 治療

孢子絲菌病的傳統治療方法包括藥物、輔助治療及聯合治療。藥物主要是抗真菌藥和碘化鉀。輔助治療包括熱療、冷凍、手術等。聯合治療則為藥-藥及藥-輔聯合。具體治療方案因人群及皮損類型的不同有所差異。目前臨床上有部分患者使用傳統治療效果較差，療程長且存在可疑耐藥，因此多采用聯合治療。一些治療方法及藥物的開發也有新進展。

2.1 藥物

2.1.1 伊曲康唑伊曲康唑因其廣譜抗菌作用及療效已取代碘化鉀成為指南推薦治療固定型和淋巴管型孢子絲菌病的首選用藥，但國內外推薦的劑量不同，成人：國內200～400 mg/d，國外200 mg/d；兒童：國內5 mg/（kg·d），國外6～10 mg/（kg·d）。伊曲康唑雖不是播散型的首選藥物，但如果患者不愿或不宜應用兩性霉素B 時，伊曲康唑與碘化鉀聯合仍是一種選擇[11]。最近聯合應用越來越多，LI 等[12]將伊曲康唑與激光（Nd∶YAG 1 064 nm）聯合應用成功治療皮膚型孢子絲菌病（淋巴管型除外），療程短于單用伊曲康唑治療，且激光未加重色素殘留及瘢痕形成。激光為有創操作且痛感較重，雖治療前麻醉，但治療時仍有不同程度的痛感，故此法不適合兒童及老年患者（前者恐不能配合治療，后者如合并糖尿病等易致創口感染、愈合緩慢）。聯合治療可提高療效、縮短療程，減少不良反應和費用，在臨床中可做更多嘗試。

2.1.2 特比萘芬特比萘芬作為二線藥物，使用時對年齡有要求（2 歲以上患者方可酌情應用）。有臨床觀察20 余例< 2 歲患兒應用特比萘芬未出現不良反應[13-14]，提示臨床應用特比萘芬時可適當放寬年齡限制，但仍需大樣本臨床觀察以明確其在<2 歲患兒應用的安全性。

2.1.3 碘化鉀碘化鉀既往為孢子絲菌病的一線藥物，但因部分患者無效、不良反應相對常見，且有些地區購藥困難，目前臨床應用有所減少。碘化鉀治療皮膚型孢子絲菌病是通過抗真菌作用還是通過增強人體免疫應答尚不明確，但目前傾向于后者。碘化鉀對播散型及內臟型的孢子絲菌病基本無效[15]。碘化鉀有效且廉價，對經濟狀況較差且無禁忌證的患者仍推薦使用。一項隨機對照試驗比較正常劑量及低劑量碘化鉀治療孢子絲菌病的療效[16]，正常劑量組成人和兒童日劑量分別為4.2～6.3 g 和2.1～4.2 g，低劑量組約為1/2 正常劑量，兩組的療效、療程及不良反應發生率差異無統計學意義。提示臨床在使用碘化鉀治療孢子絲菌病時可減低劑量，從而降低不良反應及副作用。

2.1.4 兩性霉素B兩性霉素B 是播散性型及皮膚外型孢子絲菌病的首選藥物。推薦脂質體形式的劑量為3～5 mg/（kg·d）；脫氧膽酸鹽形式的劑量為0.7～1.0 mg/（kg·d）。治療持續時間取決于機體對藥物的反應狀態和副作用（主要是腎臟損害）[17-18]，不能繼續應用時給予伊曲康唑400 mg/d以維持治療。兒童推薦的兩性霉素B 劑量為0.7 mg/（kg·d）[18]。部分播散型及皮膚外型患者存在免疫缺陷如合并HIV，因為造成不良后果的風險較大，亦推薦先用兩性霉素B 后以伊曲康唑進行維持治療。妊娠患者一般不建議使用兩性霉素B，但有報道顯示2 例妊娠患者使用兩性霉素B 治療成功，并產下健康的新生兒[19]。只是例數太少，使用需權衡利弊。在產后和哺乳期短時間內，建議使用兩性霉素B 或伊曲康唑治療，但嚴重患者應加用局部熱療，并暫停哺乳。

2.1.5 新藥的研究克霉唑為經典廣譜抗真菌藥，對多種真菌尤其是白色念珠菌具有較好抗菌作用，對絲狀的申克孢子絲菌也有一定活性，但由于在克霉唑問世時并未發現其他孢子菌物種對人類有致病性，因此，近年來克霉唑對孢子絲菌病活性的影響很少受到關注，亦沒有應用于孢子絲菌病的治療。GAGINI 等[20]在2017年經過體外實驗發現，克霉唑對貓和人巴西孢子絲菌有抑制作用，對貓巴西孢子絲菌的抑制活性優于伊曲康唑，與伊曲康唑聯合時增加了伊曲康唑的抗菌活性。提示克霉唑本身或與伊曲康唑合用可能是一種治療孢子絲菌病的新選擇。GARCIA 等[21]發明一種特異于克霉唑和伊曲康唑的新型微乳液，可用于研究克霉唑和伊曲康唑的最佳藥劑組合，但尚無體內試驗證明其單獨或與伊曲康唑聯用時的有效性，且聯用時的毒副作用也值得注意。噴他脒是治療內臟利什曼病和卡氏肺囊蟲病的次選藥物。BRILHANTE 等[22]通過體外實驗發現噴他脒具有抗孢子絲菌的活性且與抗真菌藥有協同作用，噴他脒通過破壞孢子絲菌的生物膜影響其活性，酵母形式病原菌最小抑菌濃度比絲狀形式小4 倍，可能與絲狀形式病細胞壁含黑色素高有關。下一步可行體內研究以明確其療效及與抗真菌藥的最佳組合及毒副作用。萘醌廣泛分布在植物、地衣、細菌和高等動物中，萘醌衍生物有抗念珠菌屬和皮膚真菌活性[23-24]。研究也證實一些萘醌衍生物對申克孢子絲菌具有抗菌活性[25-28]。GARCIA 等[23]合成17 種奈醌衍生物（化合物1-17）顯示出良好抗申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌的活性和穩定性，體外最活躍者為化合物6 和10，化合物10 與伊曲康唑聯合可增加其抗申克孢子絲菌活性，提示化合物6 和10 可用于新型抗真菌劑的開發。目前萘醌抗真菌的作用機制尚未明確，未來可行該方面研究，還應對其有效性與安全性做進一步研究。這些發現雖不足以證明其可用于孢子絲菌病的治療，但無疑為孢子絲菌病的治療提供了新方向。

2.2 輔助治療

2.2.1 溫熱療法孢子絲菌對溫度敏感，溫度>42℃時生長受到抑制。溫熱療法為每天進行2、3 次45℃熱療、局部加熱或熱浴等，每次15～20 min，因此溫熱療法被應用于固定型及淋巴管型孢子絲菌病的治療，通常與藥物聯合應用。但對于妊娠患者，因不宜應用唑類及碘化鉀等對胎兒有潛在致畸作用的藥物，熱療可作為一種替代方案單獨使用。已有學者報道妊娠患者單獨應用溫熱療法成功治愈[19，29-31]。對不愿接受藥物治療的患者，尤其是兒童，也可考慮單獨使用溫熱療法。溫熱療法對患者的依從性要求較高，在治療時應避免皮膚灼傷。

2.2.2 冷凍使用低溫作用于組織，導致組織變性壞死。用液氮作用于病變組織是皮膚科一種傳統可祛除病變組織的治療手段。因為孢子絲菌病是一種肉芽腫性疾病，臨床也可應用冷凍治療孢子絲菌病。對藥物治療效果不理想的患者，以冷凍輔助療效較好。如妊娠患者也可應用冷凍治療。FICHMAN 等[32]報道4 例妊娠患者單獨應用冷凍術獲得治愈，冷凍1～3 次，無不良反應。雖此報道患者例數較少，但目前冷凍在臨床中用作妊娠患者的單一療法并不在少數，且有越來越多的趨勢。

2.2.3 光動力光動力自20 世紀70年代末問世以來，已廣泛應用于皮膚疾病的治療。光動力可影響真菌生物膜的形成，近年來也有使用光動力（光敏劑：1%亞甲藍）治療孢子絲菌病的報道，療效顯著，其治療的有效性也已經過體內及體外研究證實[33-34]，采用的光源為Aktilite 燈和日光，兩者相比，日光作為光源時沒有疼痛和不良反應，且不會對病變外觀造成不良影響，也不需與抗菌劑聯合[34]，患者的治療體驗更佳，應用日光作為光源的光動力療法治療孢子絲菌病做為更優的選擇，可進一步研究其廣泛應用的有效性和副作用。

2.2.4 外科手術對藥物治療效果不理想、皮損局限、周圍纖維組織包裹明顯的固定型皮損患者，或一些難以耐受藥物不良反應及相互作用的固定型特殊患者（肝功能異常等），可選擇手術治療一次性根除病變。

2.2.5 電外科即通過高頻電流的凝固和燒灼作用使病變組織熱變性，破壞組織達到治療目的。因此可應用電外科來破壞組織中的真菌以治療孢子絲菌病。SOEIRO 等[35]使用20 W 電極筆作用于皮損，待其凝固后用刮匙去除組織，成功治療5 例固定型疣狀孢子絲菌病患者。電外科治療療效明確、療程縮短，可降低成本和藥物的不良反應，易于操作，相對手術切除還有能保持病變部位功能和外觀的優點，建議臨床單獨或聯合應用。但需注意避免灼傷，瘢痕體質者慎用，體內安有起搏器的患者亦盡量避免使用，會造成起搏器失效。

3 總結與展望

隨著科技進步，越來越多的技術和方法可應用于孢子絲菌病的診斷，但仍沒有一種真正高效、便捷、易于操作且廉價的方法能進入臨床取代菌種培養以實現快速診斷。目前孢子絲菌病的臨床表現多樣，不典型的患者也時有出現，且部分患者對藥物的敏感性降低，更說明了對孢子絲菌病診治研究的重要性。期望能研究出可廣泛應用于臨床的準確、高效的孢子絲菌病的診斷及治療方法。