β淀粉樣蛋白清除的研究進展

杜娟 黃昶荃 何馥倩

(1川北醫學院老年醫學，四川 南充 637000；2綿陽市第三人民醫院·四川精神衛生中心老年醫學科；3綿陽市老年學學會；4四川大學華西醫老年醫學科)

阿爾茨海默病(AD)是常見的癡呆形式，占老年癡呆病人的60%～80%〔1〕，主要表現為進行性記憶力和認知功能下降，死亡常常發生在診斷后幾年內，AD的不可逆神經元功能障礙和致殘將會造成巨大的社會經濟負擔，將成為全球最大的公共衛生挑戰之一，迫切需要新的治療方法。針對β淀粉樣蛋白(Aβ)產生，聚集或其從腦中清除已成為預防或治療AD的活躍研究領域。Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)代謝產生，APP可被α-分泌酶的神經外蛋白酶切割，產生可溶性細胞外片段(sAPPα)，被β-分泌酶(BACE1)切割，產生可溶性細胞外片段(sAPP+)和細胞膜結合片段(C99)，細胞膜結合片段在細胞內被γ-分泌酶裂解，釋放淀粉樣蛋白細胞內結構域和Aβ，Aβ聚集形成寡聚體，原纖維和斑塊。在AD中，Aβ濃度的變化出現在腦脊液(CSF)中，依次是腦Aβ積聚，CSF增加，海馬和灰質體積減少，葡萄糖代謝減少，記憶障礙和癡呆〔2,3〕。Aβ不僅在腦細胞中表達，也在神經元，星形膠質細胞和小膠質細胞中表達，還在外周器官和組織，例如肝腎胰脾等臟器及各種血液和內皮細胞中表達。本文對近年有關Aβ清除及針對該機制的治療策略進展進行綜述。

1 細胞的清除作用

1.1神經膠質細胞 神經膠質細胞通過產生腦啡肽酶，胰島素降解酶、內皮素轉換酶等切割水解Aβ，釋放細胞外伴侶蛋白〔載脂蛋白(Apo)，α2巨球蛋白和α1-抗胰凝乳蛋白酶〕，參與單獨清除Aβ并促進其與進入血液循環的受體或(和)轉運蛋白結合，可促進大部分生理性Aβ清除。小膠質細胞可通過攝取或吞噬作用來清除Aβ，并且能夠在斑塊中捕獲較大的Aβ沉積物，從而最大限度地減少對鄰近神經的損傷。可溶性Aβ可以通過液相胞飲作用及小膠質細胞上的自分泌三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白(ABC)1信號刺激G蛋白藕聯受體(P2Y)4和磷脂酰肌醇3激酶(PI3k)或絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)級聯來誘導其細胞自我攝取〔4〕。星形膠質細胞可以通過肌動蛋白調節來內吞單體和寡聚Aβ，此外，有證據表明星形膠質細胞能夠吞噬含有Aβ的神經元。通過研究證實M2c型小膠質細胞免疫反應分泌的白細胞介素可輔助Aβ細胞合成免疫球蛋白(Ig)G1、IgG3及IgE等抗體，同時清除細胞外Aβ沉積，且對周圍其他腦組織和神經細胞不造成傷害〔5〕。小膠質細胞可被Aβ激活，導致炎性細胞因子的分泌，可損害神經元并引起毒性，因此，小膠質細胞激活對疾病進展有益或有害不能定論。低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)1是一種多配體單一跨膜受體，已被證明可調節腦Aβ代謝，而其拮抗劑，受體相關蛋白(RAP)顯著抑制星形膠質細胞的Aβ降解，LRP1調節星形膠質細胞中Aβ的攝取和降解，星形膠質細胞中低密度脂蛋白受體相關蛋白的缺失減少了Aβ的清除，并增加了小鼠腦中可溶性Aβ和不溶性Aβ的水平〔6〕。雖然需要進一步研究，但星形膠質細胞中的LRP1可能在清除可溶性和不溶性Aβ中起關鍵作用。

1.2間充質干細胞(MSC)衍生的周細胞 周細胞是神經血管單元中具有多種功能的關鍵組分，在AD患者中已經證實微血管上的周細胞覆蓋減少，一些實驗證明周細胞植入減少了海馬中的Aβ沉積，周細胞可通過多種途徑直接或間接地促成Aβ清除。MSC移植可增加Aβ降解并激活小膠質細胞，從而改善小鼠模型中的Aβ病理學，離體和體外實驗表明C3H/10T1/2細胞衍生的周細胞可能通過吞噬作用促成Aβ清除。C3H/10T1/2細胞衍生的周細胞能有效地從小鼠腦切片中去除Aβ沉積，但在沒有LRP1的情況下功能減弱。MSC衍生的周細胞具有通過吞噬作用或蛋白酶介導的降解消除腦Aβ的能力〔7〕。因此，移植的MSC可能通過分化成血管壁細胞譜系來促進Aβ清除。周細胞和平滑肌細胞可通過LRP1介導內化Aβ，他們還能把Aβ從腦組織轉運至腦血管，但是當內化作用達到飽和時，隨著疾病的發展，Aβ沉積于大腦血管壁，也可能造成腦血管功能退化和淀粉樣腦血管病的發展。因此，通過周細胞移植的基于細胞的療法可能是預防或治療AD的有希望的方法。

1.3外周和單核細胞 研究證明輸入源自外周人臍帶血的單核細胞降低了Aβ負荷，改善了AD46小鼠模型中的認知缺陷，這意味著外周單核吞噬細胞在Aβ清除中具有重要作用〔8〕。由于單核細胞對Aβ的吞噬作用增強了Aβ清除率并減弱了AD的發病機制，因此，促進外周血單核細胞的吞噬功能或促進外周巨噬細胞向腦中的轉運可能會改善大腦中的Aβ清除。

2 靶向清除Aβ

2.1抗β免疫療法 近年來，許多針對Aβ候選藥物已進入臨床試驗階段;然而，由于安全問題或缺乏療效，大多數都失敗了,主動免疫包括可引發針對Aβ免疫應答的Aβ抗原,過去10余年來研究了包括AN-1792疫苗，Vanutide(與滅活的白喉毒素載體連接的多個短Aβ片段的綴合物)等方法，均因藥物副反應及無明顯臨床效果已停止研究，目前只有一種活性抗Aβ疫苗CAD106正在進行一項5年，雙盲，安慰劑對照Ⅱ/Ⅲ期研究,該研究預計將于2024年5月完成〔9〕。

2.2單克隆抗體 Solanezumab是一種人源化單克隆抗體，可識別Aβ的中間區域并結合肽的可溶性單體形式，可逆轉記憶缺陷而不影響腦淀粉樣蛋白斑，提高了靶向可溶性Aβ44的可能性。2017年6月，Solanezumab的靜脈注射劑量從400 mg增加到1 600 mg，每4 w一次，研究持續時間為4～5年，該試驗預計將于2022年完成。Gantenerumab是一種完全人重組單克隆IgG1抗體，可與Aβ的氨基末端和中心區域結合，Gantenerumab也正在DIAN-TU Ⅱ/Ⅲ期試驗中進行研究。Crenezumab是一種人源化抗Aβ單克隆IgG4抗體，可與多種Aβ結合，對聚集的Aβ的寡聚體具有特別的親和力。Crenezumab正在一項雙盲，安慰劑對照研究(API ADAD)中作為預防性治療進行測試，該試驗應于2022年3月完成。Aducanumab是重組人IgG1抗體，其與可溶性Aβ聚集體和不溶性原纖維結合，選擇性比單體高10 000倍。它能識別Aβ序列的氨基末端殘基，兩項為期18個月，雙盲，安慰劑對照的III期研究(ENGAGE和EMERGE)，預計將于2022年12月完成〔10〕。

2.3β及γ-分泌酶抑制劑 β-分泌酶抑制劑介導的APP裂解是產生Aβ的第一步，β-分泌酶抑制劑代表上游對Aβ級聯的干擾，影響神經系統內外的許多生理基質和功能。目前很少有β-分泌酶抑制劑處于Ⅲ期臨床開發階段，有幾種因人類毒性而被遺棄。Verubecestat是一種口服β-分泌酶抑制劑，對β-分泌酶抑制劑顯示出納親和力，但因為無確切效果該試驗已經提前終止。Lanabecestat是一種口服、長效β-分泌酶抑制劑，目前已停產。Elenbecestat是一種β-分泌酶抑制劑，已被證明可降低大鼠，豚鼠和非人類靈長類動物的腦和腦脊液中的Aβ濃度，目前在研究中，預計完成在2021年3月。Atabecestat是一種非選擇性口服β-分泌酶抑制劑，劑量依賴性地降低大鼠和猴子的腦脊液Aβ水平，一項類似的5年，雙盲，安慰劑對照，Ⅱ/Ⅲ期研究，研究人員招募了2 000名年齡60～75歲的認知健康，純合或雜合的ApoE4攜帶者，將以每天15 mg和50 mg的劑量進行測試，該研究應于2024年8月完成〔11〕。γ-分泌酶的活性由早老素(PS)、Aph1、Pen2和 Nicastrin蛋白(NCT)組成的多蛋白復合體介導，它的亞基被認為是調節Aβ產生及清除的潛在治療劑〔11,12〕。

2.4炎癥小體 大腦中炎癥對神經元可產生直接和間接影響，直接作用是免疫細胞參與的神經毒性活動，例如消化酶的產生及健康神經元的吞噬作用。間接作用是由星形膠質細胞和小膠質細胞引起的，這些星形膠質細胞和小膠質細胞通過細胞內和細胞外環境的作用導致神經元死亡，目前研究支持慢性炎癥可加速淀粉樣蛋白沉積和記憶缺陷，目前已發現NOD樣受體熱蛋白結構域(NLRP)3和NLRP1炎性體在AD動物模型中的病原性神經炎癥中是不可或缺的。炎癥小體是非常有前途的新型藥理學靶點，是值得進一步研究AD的有效治療方法〔13〕。

2.5納米顆粒 目前，成功開發了一種多功能的基于肽聚合物的納米掃描儀(M3)，能通過被動或主動機制穿透血腦屏障，通過水解裂解或氧化調節Aβ聚集而表現出對AD的潛在治療活性。體外和體內實驗的結果證實了納米掃描儀對Aβ清除率的高效率。在Aβ處理的細胞中，納米受體使細胞活力增加，在用納米受體處理的AD轉基因小鼠的腦中，不溶性和可溶性Aβ均降低〔14〕。納米黏附劑具有臨床實用性并為Aβ的清除提供有效的治療系統，這個研究結果支持這種新的多功能肽聚合物納米污染物作為治療AD的有希望的治療劑的潛力，為治療應用開辟了新的途徑。

2.6金屬螯合劑 金屬螯合劑已被提議作為AD的潛在治療劑，它們可以通過從金屬-Aβ聚集體中捕獲金屬離子來抑制或解聚金屬誘導的Aβ聚集，Aβ含有金屬結合位點，可以與幾種金屬離子相互作用以影響Aβ聚集和毒性。由于His殘基的咪唑側鏈與Pt(Ⅱ)的天然親和力，鉑絡合物可通過與His殘基配位占據Aβ的金屬結合位點來調節Aβ聚集及其毒性，此外，金屬復合物還可以拯救小鼠海馬切片中Aβ誘導的突觸毒性〔15〕。用于AD治療的Aβ靶向金屬復合物治療是一種新興的策略，目前已經開發了一些金屬配合物作為抗擊AD的潛在治療劑，但仍存在一些挑戰，例如較差的血腦屏障滲透性，體內毒性及不明的藥代動力學和藥效學特征。

3 血腦屏障清除Aβ

血腦屏障是由腦微血管內皮細胞(BMECs)、周細胞、星形膠質細胞的終足及基底膜構成〔16〕。是腦組織與血液之間將中樞神經系統與外周隔離的物理性屏障,具有限制分子跨血腦屏障轉運及維持中樞神經系統穩態的重要作用。

3.1晚期糖基化終末產物受體(RAGE) 介導Aβ流出的主要ABC是ABCA1，位于腦內皮的近腔側，它直接將Aβ輸出到血液循環中，以ApoE依賴性方式介導Aβ清除，游離Aβ可以通過RAGE轉運，可溶性轉運蛋白(如可溶形式的RAGE，抗Aβ IgG，血清淀粉樣蛋白P成分(SAP)，可溶形式的LRP，結合血漿Aβ并抑制RAGE的結合，從而阻止Aβ進入間質，阻斷Aβ清除。Aβ清除受轉運蛋白表達和活性配體親和力的影響。首先，血液流出轉運蛋白LRP1123和ABCB1147的表達降低，而血液流入轉運蛋白RAGE的表達上調。第二，阿爾茨海默病中的氧化變化與可溶形式的LRP的變化相關，降低其對Aβ的親和力，可能促進Aβ流入可溶性轉運蛋白的間質〔17〕。血腦屏障提供了大的表面積，并且已被證明是去除腦可溶性轉運蛋白的重要介質。

3.2LRP1 是低密度脂蛋白受體家族的成員，在全身多個器官遍布及表達，高度集中在肝、肺和腦中，LRP1通過小膠質細胞，神經元和星形膠質細胞介導Aβ清除。細胞膜結合的LRP1，集中在近腔內側有助于轉胞吞作用。在肝臟中，可溶性-LRP1(sLRP1)合成并分泌到外周循環中。sLRP1結合的Aβ在正常人中可以隔離70%～90%的血漿Aβ，使Aβ的全身濃度保持足夠低，從而驅動跨越血腦屏障的Aβ轉胞吞作用〔18〕。都被認為在腦的Aβ流出中起關鍵作用，兩種蛋白質在功能上相互連接，通過內皮細胞介導Aβ的協同轉胞吞作用。研究發現胰島淀粉樣多肽可通過誘導受體LRP1亞細胞易位到血腦屏障內皮的質膜誘導Aβ通過胰島淀粉樣多肽受體進行血液清除〔19〕。周細胞位于血腦屏障的近腔側，覆蓋其周長約25%。周細胞表達受體LRP1和ABCB1，它們都顯示在Aβ清除中起作用〔20〕。作為神經血管單元(NVU)的一部分，周細胞對于血腦屏障的發育和穩定性至關重要，并通過控制細胞收縮/松弛來調節通過毛細血管的血流。

3.3脈絡叢(CP)清除Aβ CP是由大腦四個腦室內的毛細血管和立方上皮細胞組成的網絡。上皮細胞產生CSF并主動過濾血液和血漿。重金屬積累和毒性是AD發病機制和破壞Aβ清除機制的主要變量，活性氧(ROS)水平，胰島素抵抗受損和膽固醇酯升高在血腦屏障功能障礙中起重要作用。ROS介導的基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP9的活化已經證明了基底膜蛋白的降解和隨后的血腦屏障完整性的喪失。此外，ROS誘導的緊密連接蛋白的磷酸化通過蛋白酪氨酸激酶(PTK)的上調(蛋白酪氨酸磷酸酶減少)引發滲漏的血腦屏障〔21〕。

3.4CSF吸收清除 Aβ在循環的CSF中可被蛛網膜顆粒及血腦屏障吸收進入血循環，也可通過血管周圍間隙或神經周圍間隙(包括腦膜淋巴管)進入淋巴系統。磷脂酰肌醇結合網格蛋白裝配(PICLAM)蛋白由PICLAM基因編碼，參與膜受體的內化和內吞作用〔22〕。它在腦毛細血管內皮中大量表達，并且已經顯示出影響Aβ代謝和通過血腦屏障的轉運。

4 外周清除途徑

研究表明，中樞和外周途徑可以相互作用并協同清除腦中的Aβ，大約60%的腦Aβ運輸到外周清除。幾種外周組織或器官參與Aβ分解代謝并構成潛在的Aβ清除途徑，包括單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及肝細胞的攝取、吞噬、內吞作用，或通過膽汁或尿液排泄，由Aβ結合蛋白和細胞介導的血液清除，如紅細胞，白蛋白，抗凝血酶Ⅲ和脂蛋白(包括載脂蛋白E和載脂蛋白J)。肝臟介導Aβ外周清除是維持Aβ穩態所必需的，循環中的Aβ主要通過肝細胞降解或膽汁直接排泄來清除，肝臟也可能通過調節白蛋白水平和Aβ相關脂質代謝間接影響Aβ清除，LRP1介導的肝臟Aβ攝取的治療減輕了大腦中Aβ的負擔和認知障礙。因此，改善肝臟的Aβ清除能力是AD的潛在全身治療方法。腎功能不全可溶性Aβ是人尿的正常成分。動物實驗表明，在顱內或靜脈內輸注125I標記的Aβ后，隨后在腎臟和尿液中檢測到放射性，這些發現表明腎臟可能通過將Aβ從血液過濾到尿液而參與Aβ的生理清除，相反，腎功能不全可能導致外周Aβ清除受損。此外，人腎捐獻者腎小球濾過率降低并且Aβ的循環水平增加，這表明與單個腎相關的腎功能儲備的減少也減弱了外周Aβ清除率。腎功能不全會增加認知障礙和癡呆癥的風險，這種關聯可能涉及AD途徑。因此,腎移植可降低血漿Aβ水平，血液透析可緩解慢性腎臟病患者腦內Aβ沉積〔22〕。這些觀察結果表明腎功能的改善是AD預防和治療的有希望的方法。血漿白蛋白交換既可改善認知，又可降低AD患者的Aβ負擔，腹膜透析可降低人體血液Aβ水平，并減弱AD小鼠模型中的病理學;接受血液透析的患者表現出腦內Aβ沉積減少。因此，主動去除過量的外周Aβ是特別有前景的治療策略。

5 腦膜淋巴管

腦膜淋巴管可能是Aβ清除的新途徑。例如，在衰老的哺乳動物中，腦膜淋巴的功能受損,可導致腦實質中毒性Aβ的加速積聚，加重AD相關病理〔16〕。腦實質沒有自己的淋巴系統，主要依賴于血管(glymphatic)途徑和最近發現的腦膜淋巴管去除代謝廢物和毒性代謝物，兩種排泄途徑都通過CSF代謝廢物，“glymphatic”系統代表全腦實質內的實質途徑，其通過間質液-CSF交換介導腦代謝物的清除。發表在Nature上，弗吉尼亞大學的Kipnis小組通過注射能夠選擇性破壞淋巴管內皮細胞的光動力藥物，在藥理學上消除了小鼠的腦膜淋巴管，包括手術破壞淋巴引流至深頸部淋巴結，使用遺傳改變/受損淋巴管的工程小鼠及利用多種示蹤劑評估引流。在缺乏腦膜淋巴管的小鼠中，鞘內和實質內注射熒光示蹤劑未能到達深頸部淋巴結。正常腦膜淋巴引流的中斷損害了CSF和間質溶質的淋巴交換，表明間質液-CSF交換和CSF淋巴引流的過程之間存在功能聯系。在AD的轉基因小鼠模型中，作者觀察到淋巴引流受損促使大腦和腦膜中的Aβ沉積達到與人類病理相似的程度，年輕成年小鼠導致CSF腦灌注受損和伴隨的神經認知缺陷。特別是老年小鼠的腦膜淋巴功能降低，作者假設這可能導致年齡相關的認知能力下降。最后，用血管內皮生長因子C治療老年小鼠增強了腦膜淋巴引流和CSF-大腦間質液清除，改善腦灌注和認知表現。調節腦膜淋巴管代表了一種有前景的新型治療途徑，未來的研究對于確定其在神經認知疾病和腦蛋白病中的作用至關重要〔23〕。

6 小結與展望

目前AD尚無有效的治療方式，膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸拮抗劑的藥物主要作用為改善記憶和警覺性，而不改變AD的預期壽命和總體進展。多年來已經進行了大量的努力來了解AD的發病機制并開發有效的抗AD的策略，Aβ級聯假說仍然是AD病因學中最廣泛接受的解釋。目前盡管一些Aβ靶向治療及外周、腦膜淋巴管代謝等方式正作為抗AD進行研究，但它們仍處于發展的早期階段，并且在臨床試驗之前還有很長的路要走，仍存在一些挑戰，目前AD患者Aβ清除缺陷的機制尚不完全清楚，有待進一步研究。