中藥三七及其復方防治器官纖維化的研究進展

李 娜， 江開春， 王婷婷， 賀 生， 劉安麗， 姬新穎

(1.鄭州澍青醫學高等專科學校基礎醫學部，河南 鄭州 4500064；2.河南大學醫學院，河南 開封 475000)

人體實質性器官由實質和間質兩部分構成。實質通常指執行該器官主要功能的細胞(如肝臟的肝細胞)；而間質則由間質細胞和細胞外基質構成，主要起機械支撐、連接和營養等作用。當組織受到傷害后，機體啟動自我保護機制修復反應，受到損傷的組織通常會以分泌膠原的方式來愈合傷口，可使器官組織恢復正常結構和功能；然而在嚴重或慢性損傷或傷口愈合反應失調的情況下, 膠原和纖維連接蛋白在內的細胞外基質(extracellular matrix, ECM) 成分會在炎癥或損傷的組織內或周圍過度積聚, 并在組織器官上形成永久性瘢痕, 最終引發器官結構改變及功能障礙[1-2]，這就是器官纖維化。

1 器官纖維化

器官纖維化疾病是一種以組織器官內纖維結締組織增多, 而實質功能細胞減少為主要病理特征的慢性持續進展性疾病。這種病理過程通常是由于反復或慢性損傷或組織損傷引起的傷口愈合反應，而與潛在的病因無關，并且幾乎可以發生在任何實體器官或組織。廣泛流行的慢性疾病均可導致纖維化，包括糖尿病、高血壓、病毒性和非病毒性肝炎、心力衰竭和心肌病、特發性肺病、硬皮病和癌癥，它們可以使肝臟、肺、腎、心臟等其他重要器官實質組織破壞并被過度ECM所取代。最近的調查表明，在西方發達國家，嚴重纖維化約占所有死亡人數的45%[3-4]。器官纖維化疾病發病機制復雜、早期診斷困難、預后較差，再加上治療纖維化的藥物少且功效有限，器官纖維化引起的功能障礙嚴重影響到人群的健康，目前被認為是全球范圍內人類發病率和死亡率較高的主要疾病之一。它包括肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、心臟纖維化和腸道纖維化等。

2 器官纖維化的發病機制

纖維化被認為是器官損傷愈合的異常的病理結果。正常的傷口愈合存在一系列有序的過程：損傷、免疫細胞募集和急性炎癥、肌成纖維細胞有限活化、增殖和ECM穩態，傷口愈合。而在促纖維化病理狀態下，多種因素的異常可導致纖維化[5]。在某些刺激持續作用下，促炎因子或生長因子等物質過度表達和激活[6]，它們與多種激酶或核受體相互作用，還有一些因素的缺乏也會導致纖維化進展[7]。然后，異常信號的持續將正常的傷口愈合過程轉變為促纖維化過程，招募多余的免疫細胞，這種“促纖維化環境”誘導肌成纖維細胞(myofibroblasts,MFs)的激活和增殖，促進ECM的大量產生。促纖維化過程反過來也促進這些因子的激活，從而放大炎癥反應，引起慢性炎癥。最后，持續活化的肌成纖維細胞會產生大量的ECM，使平衡向有利于合成ECM的方向傾斜，從而產生纖維化[8-9]。此外，促纖維化過程本身可能導致創傷的繼發性損傷，并導致病理反應的慢性惡性循環。

細胞內外各種因子介導了纖維化的進展，許多靶分子參與了纖維化過程。大多數與纖維化相關的細胞外因子是受體結合的配體，如生長因子和細胞因子。當上皮/內皮細胞受損時，組織中的成纖維細胞、免疫細胞和生長因子聚集。這些生長因子通過自分泌、旁分泌作用于自身或鄰近的細胞，然后它們與細胞膜上的特定受體結合，觸發細胞內信號，激活纖維化的主要細胞執行者，即間質細胞(如成纖維細胞、周細胞和肌成纖維細胞等)，啟動和維持病理纖維化。轉化生長因子β(Transforming growth factor beta，TGF-β)就是纖維化的主要調制器之一，它通過激活經典的依賴SMAD和非經典的非SMAD依賴信號通路[10-11]和其他纖維化反應導致器官纖維化。TGF-β信號級聯反應誘導了大量具有分化標志α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的MFs的生成[12]。此外，TGF-β信號導致膠原蛋白的轉錄和collagen Ⅲ基因[13]對ECM積累的貢獻。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)在器官纖維化過程中也是一個中心介質，它與PDGF受體 (PDGFR-α 和 PDGFR-β) 結合，激活酪氨酸激酶，PDGF通過下游的 ERK/MAPK信號通路和PI3K/Akt 信號通路，激活 MF及其前體細胞的增殖，發揮其促纖維化作用[14]。其他的胞外因素，主要是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等可以降解ECM，防止其過度積累。細胞因子更傾向于作為細胞信號傳遞物，增強免疫反應，進而導致炎癥。其中趨化因子就是一種主要類型的細胞因子，它引導免疫細胞和成纖維細胞募集到損傷部位。不同的免疫細胞被不同的趨化因子吸收，T細胞因子主要由活化的T淋巴細胞分泌，它們包括白細胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)，介導促進纖維化的適應性免疫反應和炎癥。研究報道IL-6在腹膜纖維化中通過信號轉導器和轉錄3(STAT3)信號通路激活劑將組織修復轉變為慢性炎癥狀態[15]。

與纖維化相關的細胞內因子主要是激酶。上游炎癥階段諸多因素(TGF-β、TNF-α、表皮生長因子Epidermal growth factor，EGF)啟動增殖絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)。其中絲裂原活化蛋白激酶-2是MAPK通路的一個元件，介導肌成纖維細胞的分化，調節Col1a2、Col3a1、LOX等多種基質蛋白的基因表達[16]。另一個重要的細胞內信號，調節細胞生長和增殖的關鍵分子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)由Wnt和TNF-α通路激活。然后，mTOR通路激活核糖體蛋白S6激酶β-1調節p21和p27蛋白，進而調控許多細胞(包括成纖維細胞)的細胞周期，來影響纖維化的進程。

3 中藥三七防治器官纖維化

傳統中藥療法通常以草藥配方出現，作為多組分藥物已經被研究了數千年[17]，多組分藥物含有多種活性成分，具有同時調節多個通路并產生協同效應的優勢。三七是含有PNS、PDS、PTS以及三七氨酸等多種有效成分的天然藥物，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗心血管疾病、改善微循環等多種重要藥理作用。在近二十年，就中藥三七的有效成分、單味藥、復方等多個層面，積極開展了抗肝、肺、腎、心肌等器官纖維化的實驗和臨床研究，取得了一定的進展。

3.1 肝纖維化 病毒和寄生蟲感染、過度飲酒和非酒精性脂肪性肝炎等各種致病因素引起的慢性肝臟創傷愈合反應，表現為肝內細胞外基質過度異常地沉積[18]。肝纖維化是慢性或反復性肝損傷的常見最終途徑，伴有結構喪失和功能衰竭，并出現危及生命的并發癥。

研究發現肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)[19]等前體細胞獲得肌成纖維細胞表型，激活的肝肌成纖維細胞HSCS(Actived HSCS)遷移到損傷部位，它們不斷產生促纖維化因子，導致細胞外基質過度沉積。Geng等[18]體外培養的肝星狀細胞(HSCs)實驗發現，人參皂苷Rg1明顯抑制PDGF刺激的肝星狀細胞增殖、活化和活性氧的形成。Hui[20]用三七總皂苷顯著降低肝星狀細胞的α-SMA表達和產生膠原蛋白的總量。因此推測PNS預防纖維形成的作用機制是抑制了肝星狀細胞活性。

用四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化模型大鼠做實驗研究，研究發現三七總皂苷PNS 不僅能顯著降低組織病理學改變，還能有效降低血清細胞因子IL-1、IL-6、NF-κB、TNF-α、TGF-β水平，增加IL-10水平[21-22]。Peng等[23]實驗計算出三七總皂苷治療組膠原面積和膠原蛋白面積百分比，確定三七總皂苷減弱肝組織中肝纖維化程度，可能通過免疫調節促纖維化和抗纖維化細胞因子實現的。炎性細胞因子在肝纖維化始動激活和調控中具有重要作用，武凡等[24]發現三七主要成分Rgl、Rbl通過抑制 sPLAZ、PGE水平來減輕四氯化碳所致的肝細胞損害，減少對肝細胞的炎癥刺激和庫普弗細胞激活, 使 TNFα生成量減少達到抗纖維化的作用。姜輝等[25]發現三七總皂苷可降低模型大鼠血清中ALT、AST的水平，顯著升高肝臟中MMP-13的表達，降低TIMP-1的表達，提示三七總皂苷可能通過促進膠原降解，從而減少大鼠肝纖維化程度。Chen等[26]用PNS的主要代謝產物化合物K和人參皂苷Rh1研究發現單獨或聯合使用CK和Rh1均能抑制纖維化因子TIMP-1、PC-Ⅰ和PC-Ⅲ的表達，證實了PNS具有保護肝臟免受酒精或高脂飲食(HFD)所致大鼠肝細胞損傷的作用。在研究三七有效成分基礎上，Park等[27]利用三七降糖水提物通過大鼠實驗模型，驗證了三七通過減少脂質過氧化物丙二醛(MDA)的生成抑制肝星狀細胞的活性，從而延緩纖維化的進程。因此PNS對肝纖維化具有保護作用，可能與調節細胞因子網絡有關。許多細胞因子和生長因子通過JAK-STAT信號通路來傳導信號，這包括白介素2～7(IL-2～7)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)和干擾素(IFN)等。這些配體與細胞膜上相應受體結合后，活化酪氨酸激酶JAK，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程。Hui等[20]發現PNS顯著降低肝纖維化模型大鼠肝臟羥脯氨酸和膠原蛋白的表達, 通過調控JAK2/STAT3信號轉導途徑減輕肝纖維化。 Nrf2是調控細胞氧化應激反應的重要轉錄因子，同時也是維持細胞內氧化還原穩態的中樞調節者。Li等[28]認為Nrf2通路的激活有助于人參皂苷Rg1在酒精和CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中的抗纖維化作用。動物模型體內實驗發現三七及其復方藥物均可降低動物血清中細胞因子水平，可能通過調節MMP-13和TIMP-1的表達，促進膠原降解，從而減少大鼠纖維化程度。三七的降糖水提物可能通過Nrf2通路調控細胞氧化應激反應，減少過氧化物的形成，抑制HSC活性；也可通過JAK-STAT信號通路調節細胞增殖、分化和凋亡。

3.2 肺纖維化 肺纖維化是由于毒物、自身免疫疾病、藥物副反應、感染、嚴重的外傷等多種原因引起肺部炎癥，肺泡持續性損傷、細胞外基質反復摧毀、修復、重建并過度積聚，導致正常肺組織結構改變、功能喪失的一類疾病。

肌成纖維細胞活化、形成和持續激活在肺纖維化的進程中起著重要作用，涉及TGF-β、PDGF等細胞因子的激活，同時也有各種信號通路參與，和一些小分子的microRNA參與。耿德海等[29]用實驗動物驗證了三七總皂苷能抑制肺成纖維細胞的增殖及向肌成纖維細胞的轉化，從而抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成。吳娟娟等[30]發現復方三七飲對博萊霉素致大鼠肺纖維化具有一定的防治作用，可能與調節TGF-β1/Smads信號通路有關。Zhan等[31]發現人參皂苷Rg1(PNS活性成分)可增加Caveolin-1(Cav-1)mRNA和蛋白的表達水平，降低肺纖維化(PF)大鼠肺組織中TGF-β1的mRNA和蛋白的表達，推測人參皂苷Rg1可通過TGF-β1的下調和Cav-1的上調，恢復博萊霉素誘導的PF組織學改變，起保護作用。 Zhang等[32]研究表明三七總皂苷(PNS)通過抑制NF-κB信號通路，降低AST、LDH、CK和IL-6的表達，減輕肺纖維化模型兔子心肺的病理超微結構損傷，減輕PF。孫曉芳[33]通過博來霉素(BLM)誘導小鼠肺纖維化為模型，發現PNS通過抑制肺組織CatB/CatD和Fas/FasL的活性，調節Bax/Bcl-2的表達，抑制肺上皮細胞的凋亡，促進成纖維細胞的凋亡，來實現PNS防治肺纖維化的作用。管新竹[34]用三七總皂苷注射BLM誘導的間質性肺炎小鼠模型發現，它可幫助維持氧化/還原平衡，控制炎性反應，改善小鼠肺內血液運行情況，來改善小鼠的肺纖維化程度。 實驗動物研究，PNS和復方三七飲可能通過TGF-β1/Smads信號通路，改善模型小鼠的肺循環，控制炎癥過度反應和調節Bax/Bcl-2信號，實現對肺纖維化進展的控制作用。

體外肺泡上皮細胞培養，任周新等[35]培養篩選由TGF-β1誘導的上皮間質轉化(EMT)人肺泡上皮細胞，發現PNS可顯著提高MMP-9水平(P<0.05)，降低TIMP-1水平，細胞外基質降解能力增強，表現出抗肺纖維化能力。丁玉文[36]證實PNS對由上皮間質轉化人肺泡上皮細胞的細胞外基質降解能力增強，可能與調控TGF-β1/p38MAPK信號通路有關。

3.3 腎纖維化 各種有害刺激引起腎臟固有細胞受損，大量細胞外基質異常沉積和積聚，造成腎實質硬化形成瘢痕，直至腎臟功能完全喪失的過程，稱為腎纖維化。

早期腎臟損傷引起的炎癥是始動因子，研究證實[37-38]酪氨酸激酶(JAK)/轉錄因子(STAT)信號通路參與并促進炎癥的發生發展。Chow等[39]實驗研究發現三七總皂苷可通過抑制JAK/STAT 信號通路的表達，減輕巨噬細胞在損傷部位的浸潤，緩解巨噬細胞介導的炎癥反應，從而延緩腎纖維化的進程。Lv等[40]在慢性腎臟病(CKD)患者體內發現一些炎癥信號分子基因表達上調，包括單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、緩激肽B1受體(B1R)、核因子κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、TGF-β和PDGF等。席加喜等[41]用PNS對順鉑尾靜脈注射腎損傷SD大鼠實驗研究發現，PNS可能通過下調模型大鼠腎組織中腎纖維化相關性因子CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的表達，從而發揮減輕順鉑致腎纖維化的作用。Ren等[42]發現人參皂苷Rg1和黃芪甲苷Ⅳ抑制TGF-β1/ Smads信號通路在糖尿病腎病大鼠腎纖維化中的級聯反應。這些肌成纖維細胞[43]來源于血管壁周細胞、活化的腎成纖維細胞、上皮-間質轉化(EMT)成纖維細胞、內皮間質轉化(EndoMT)成纖維細胞和源自骨髓的成纖維細胞樣細胞和骨髓中募集的巨噬細胞[44]，其中周細胞是腎臟纖維化過程中肌成纖維細胞的主要來源。蘇白海等[45]通過單側輸尿管梗阻(UUO)腎間質纖維化腎病的大鼠的實驗發現，三七總皂苷能阻斷腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉化，并且對腎小管上皮細胞有修復保護作用。研究發現Bax -Bcl決定細胞的凋亡，Liu等[46]通過實驗的研究表明 PNS通過抑制 Bax 及caspase9 的表達，增加的 Bcl-2的表達，來降低腎小管細胞的凋亡率，從而通過抑制線粒體途徑減輕腎組織細胞凋亡，防止順鉑引起的腎毒性。 以上研究發現三七總皂苷可緩解模型大鼠的炎癥反應，下調腎纖維化相關性因子的表達，可能是通過抑制JAK/STAT 信號通路，從而延緩腎纖維化進程；人參皂苷Rg1和黃芪甲苷復方藥物抑制腎纖維化可能與抑制TGF-β1/ Smads信號通路有關；單側輸尿管梗阻(UUO)腎間質纖維化腎病研究發現 PNS可能通過抑制Bax及Caspase9的表達，降低了腎細胞的凋亡。

3.4 心肌纖維化 心肌纖維化是多種病因導致的心肌細胞及心肌間質的改變，是各種心血管疾病發展到終末階段的共同病理特征[47]。受損組織被成纖維細胞和肌成纖維細胞產生的纖維化瘢痕取代，導致心臟功能衰竭。

近年來，中醫藥三七抗心肌纖維化治療實驗研究建立在心腦血管疾病模型動物開展的。Li等[48]通過慢性血栓性肺動脈高壓(CTEPH)模型大鼠發現人參皂苷Rg1可上調MMP-2和MMP-9的表達，從組織形態學觀察發現Collagen-I減少。Xiao等[49]通過異丙腎上腺素(ISO)誘導的動脈粥樣硬化大鼠模型發現三七皂苷R1抑制趨化因子受體2(CCR2)的表達，并阻止促炎單核細胞和隨后的心肌炎癥反應以及心臟傷口周圍各種細胞衍生因子的表達，可以減輕心臟功能障礙防治心臟纖維化。最近認為microRNAs (miRNAs)是細胞分化過程中的重要調控因子[50]，有研究發現miR-調控(CFs)增殖的作用，抑制心肌成纖維細胞的增殖、分化、遷移和膠原合成[51-54]。Liu等[55]用異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌損傷小鼠實驗發現PNS降低了Collagen(Col)1a1、Col1a2、Col3a1、Col5a1、fibrillin 1(Fbn1)表達，而miR-29c靶基因的表達增加。三七皂苷R1通過增加心臟中miR-29c的表達，減少心肌纖維化發生從而對心臟起保護作用。近年來多成分復方藥物聯合用藥優于單味用藥有協同作用，比如新興的多成分藥物芪參益氣(QSYQ)滴丸的主要成分有黃芪、丹參、三七、降香油，正在進行缺血性心力衰竭的Ⅱ期臨床試驗[56]。研究證實QSYQ減弱心臟纖維化通過IL-6/STAT3和TNF-α/核因子激活B細胞的κ-輕鏈增強(NF-κB)信號和抗凋亡活動。胡艷紅等[57]發現人參-三七-川芎提取物，通過調節CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和TGF-β1蛋白表達，可改善糖尿病小鼠心肌纖維化。聶丹等[58]用結扎大鼠左冠狀動脈前降支方法，發現丹皮酚、三七總皂苷組方能可降低Ⅰ、Ⅲ型膠原表達，改善心肌梗死大鼠心肌纖維化。丹皮酚聯合三七總皂苷復方藥物[59]可以上調高脂高糖飼喂聯合腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病心肌病模型心肌組織中HO-1、SOD的表達，降低MDA的水平，使ROS水平下降，進而抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達，通過抗氧化應激作用，激活Nrf2/ARE信號通路，具有協同減輕DCM引起心肌纖維化。多種心血管模型的動物實驗表明三七皂苷R1可通過miRNAs調控細胞的分化對心臟起保護作用；三七總皂苷復方藥物可能通過調節NF-κB、Nrf2/ARE等信號通路實現抑制心肌纖維化進程。

4 問題和展望

多種器官疾病的相關損傷都會引發復雜的細胞和分子級聯反應, 并最終發展為纖維化疾病[3]。纖維化指的是過度瘢痕超出組織對損傷的正常愈合反應，影響了正常器官的功能。持續損傷和實質細胞死亡會引起組織炎癥、巨噬細胞活化和免疫細胞浸潤，持續釋放可溶性介質(警報素、細胞因子、趨化因子)導致間充質干細胞和各種細胞類型過渡到肌成纖維細胞，大量的ECM的積聚形成器官纖維化。本文全面回顧了目前關于器官纖維化的發病機制，認識到不同器官的纖維化既有其不同的器官特性，也存在著共同的潛在機制[60]。共同機制的存在促進了對纖維化發病機制的完整解釋，并提高了對纖維化相關疾病的認識，加強了不同學科的交叉和滲透。

越來越多的抗纖維化藥物被證明是有效的，同時抗纖維化藥物治療可以跨越不同的疾病和器官。目前抗纖維化藥物的設計大多數是針對細胞外因子的，如生長因子、細胞因子和基質金屬蛋白酶。大多數抑制劑可直接與靶標的活性位點結合，如以TNF為靶點，藥物沙利度胺和波馬利多胺這些小分子廣泛應用于纖維組織相關疾病[61]；抑制白細胞介素的藥物通常是單克隆抗體；臨床前藥物抑制MMPs，如Marimastat，它同時下調MMPs基因表達和MMPs活性。其次針對細胞內因子的藥物種類較少，它們大多是小分子，因為只有小分子可以很容易地轉移到細胞質中，這些藥物可抑制位于細胞質內的多種激酶，從而抑制轉錄因子的易位，這些轉錄因子可驅動促纖維化基因的表達。雷帕霉素和西羅莫司就是被批準的抑制mTOR的藥物[62]。另外microRNA是目前研究最多的以表觀遺傳學為基礎的纖維化治療方法[63]。器官纖維化的過程是多個細胞、分子參與的，多個信號通路相互作用的復雜過程。某一種西藥僅僅作用在某一靶點(非關鍵靶點)雖有一定的功效，但療效有限。那么中醫藥可通過多靶點、多途徑的先天優勢在治療纖維化藥物開發中顯得尤為重要。中藥三七有效成分、單味藥及其復方，不管是動物模型還是體外細胞培養實驗都對肝、肺、腎和心肌纖維化有保護作用，但作用機制有待進一步深入研究。因此有必要重新考慮這些機制涉及的靶點，并評估其在跨組織和器官纖維化治療中的潛在作用，加強研究免疫細胞及其炎癥介質網絡調控纖維化的相關分子機制，為進一步探索和驗證有效的抗纖維化分子治療靶點提供前期的基礎數據。雖然多組分中藥及其復方具有針對不同靶點同時調節多個通路并產生協同效應的優勢，但某些藥物化學結構和有效成分不明確，在加上致纖維化信號通路復雜的網絡關系，使研究顯得尤為困難。所以未來中醫藥的治療研究應該朝兩個方向發展[64]。采取的第一個方向應該是建立一個中藥化合物庫，將其功能與結構聯系起來；第二個方向應該是將網絡藥理學和制藥技術結合起來，深入研究其作用機制，挖掘致纖維化的關鍵靶標。

盡管有些藥物在實驗動物中具有較好的抗纖維化療效，但目前在臨床應用時卻難以取得預期的效果。這是因為與損傷原因明確的動物模型相比，人類纖維化疾病往往是多因素的，可能無法消除損傷刺激或者是現有的動物模型往往不能完全概括相關的人類疾病，因此導致動物模型纖維化策略可能不能直接轉化為人類的治療。因此需要優化纖維化動物模型。目前在具有人性化免疫系統或實質組織的小鼠模型方面已取得了一定的實質性進展[65]，其中一些已用于纖維化的研究[66]。但是在這些實驗系統的應用中仍然存在重大的挑戰，改進的動物模型的發展將可能為解決纖維化帶來新的見解。至此隨著器官纖維化發病的機制及其過程認識的不斷深入，新的纖維化靶點和治療藥物將會不斷涌現。分析討論中藥三七及其復方通過不同的作用機制影響器官纖維化進程，挖掘致纖維化關鍵機制和途徑有重要的意義。明確的致纖維化細胞分子靶標將被作為治療各種器官纖維化疾病的潛在療法，為更好地發揮中藥優勢，開發未來纖維化藥物奠定重要的理論基礎。