全外顯子組測序檢測貓叫綜合征2例*

易 薇，張志丹，楊必清，葛世軍，禹崇飛，尹祖倫，林克勤，黃 鎧，褚嘉祐，楊昭慶△

1.德宏州人民醫院檢驗科,云南芒市 678400；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫學生物學研究所醫學遺傳學研究室,云南昆明 650118

貓叫綜合征又稱5p缺失綜合征，是由于5號染色體短臂部分或完全缺失所導致的染色體缺失綜合征。早在1963年就有研究者就對3例無親緣關系的貓叫綜合征患兒進行了報道，此后世界各地均有發現病例[1]。該病主要的臨床特征包括嬰兒期似貓叫樣哭聲、獨特的面部畸形、智力障礙和生長發育遲緩等[2]。貓叫綜合征存在明顯的遺傳異質性和臨床表現差異，患者由于受染色體5p缺失片段的位置、大小、參與的修飾基因、有無伴隨其他染色體變異等因素的影響，在臨床表型上顯示出較大差別[3-4]。

國內外關于貓叫綜合征的報道多為散發病例，既往的研究較多集中于臨床資料和細胞遺傳學分析，初步揭示了該病在染色體核型上的多樣性。但核型分析難以對較小片段的微缺失或微重復(<5 Mb)進行定位，熒光原位雜交(FISH)和基因芯片等技術從分子水平上提供了更加精細的染色體異常片段定位分析方法，但仍然存在檢測周期長、檢測效率低和費用高等方面的局限性，臨床診斷上仍然需要對染色體片段異常進行更加高通量、更加精細的定位，從而揭示基因型與表型特征的關聯性。目前，隨著高通量測序技術的發展，全外顯子組測序技術以其所需標本量少、成本低、編碼區域覆蓋深度高等優點，在單基因、多基因遺傳病及產前診斷中得以廣泛應用。全外顯子組測序技術在染色體病的分析中，尤其是通過拷貝數變異(CNVs)分析遺傳病方面還存在爭議。近年來該技術已逐漸在一些病例中得以應用[5]，但還缺乏更多的評價和驗證。本文采用染色體核型分析與全外顯子組測序相結合的方法，結合臨床資料，對兩例貓叫綜合征病例進行綜合分析，探討應用全外顯子組測序技術檢測CNVs來定位染色體缺失片段在貓叫綜合征臨床診斷中的價值，并為深入闡明貓叫綜合征基因型與表型的關聯性提供參考，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患兒1：女，6月齡，漢族，系第2胎第2產，36周早產，出生體質量1 850 g，因無明顯誘因發熱住院。反應差，哭聲小，似貓叫，小頭畸形，鼻梁塌，眼距寬。前囟平軟，張力不高。雙肺呼吸音粗，可聞及痰響。胸片示支氣管炎征象。心臟彩超示卵圓孔未閉，三尖瓣輕度反流。頭顱MRI示胼胝體形態略纖細，雙側側腦室體部間距增寬，雙側側腦室及三腦室擴張，蛛網膜下腔增寬。肝膽胰脾雙腎彩超未見明顯異常。兒保康復科測評示發育落后。

患兒2：男，1月齡，漢族，系第2胎第2產，足月順產，出生體質量2 440 g，以新生兒肺炎收住院。反應差，哭聲細弱，似貓叫。皮膚蒼白，吃奶慢，前囟平軟，張力不高。吸氣性三凹征陽性(重度)，雙肺可聞及痰鳴音。呼吸略急促，有喉喘鳴。血常規示中度貧血。心電圖示竇性心動過速。胸片檢查心膈未見異常。

2例患兒的父母3代以上均為云南德宏地區漢族，表型智力均未見異常，健康狀況良好，否認近親婚配，否認孕期患病史及放射性物質和有毒物質接觸史，否認家族遺傳病及傳染病史，生育患兒時的年齡均在35周歲以下。患兒1有一姐姐，表型智力正常，健康狀況良好。患兒2有一哥哥，表型智力亦正常，健康狀況良好。

1.2方法

1.2.1外周血染色體核型分析 經患者家屬知情同意，并征得醫院倫理委員會同意后，抽取患兒及其父母、親兄弟姐妹外周靜脈血2 mL，采用外周血淋巴細胞培養方法常規收獲細胞和制備染色體，并進行G顯帶分析。鏡下計數20個中期分裂相，分析5個核型，參照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)2013》的有關規定確定染色體核型。

1.2.2全外顯子組測序 提取2例患兒基因組DNA，利用iGeneTech人全外顯子組AIExomeV1檢測試劑盒(北京艾吉泰康生物科技公司)構建文庫，使用NovaSeq6000平臺進行150 bp高通量雙端測序(PE150)，測序深度設定為100×。測序所得原始數據經質量控制過濾去除重復序列、接頭序列等，基于UCSC的參考基因組(hg19,2009)，采用BWA、Cnvkit、ANNOVAR、SIFT、Polyphen等軟件對測序數據進行單核苷酸多態性(SNPs)和小插入缺失(InDels)變異分析，對單標本全外顯子采用自行構建的數據庫作為正常參照進行CNVs尋找，并結合以往的全基因組關聯研究(GWAS)數據和CNVD數據庫進行結果注釋。

2 結 果

2.1染色體核型分析結果 兩例患兒的代表性G顯帶核型結果見圖1。患兒1的核型為46,XX,del(5) (p13)；患兒2的核型為46,XY,del(5) (p14)。兩例患兒的父親核型均為46,XY；母親核型均為46,XX；患兒1的姐姐核型為46,XX；患兒2的哥哥核型為46,XY。根據核型分析和臨床表現，兩例患兒診斷為貓叫綜合征。

2.2全外顯子組高通量測序結果 全外顯子組測序CNVs分析結果顯示，兩例患兒在5p上均存在不同程度的染色體片段缺失，缺失片段分別為34.68 Mb和22.01 Mb，相應的缺失區域、范圍及缺失所涉及的部分基因見表1。

注:a為患兒1有5p13→pter片段缺失；b為患兒2有5p14→pter片段缺失；圖中箭頭所示為5p缺失斷裂點。

表1 兩例患兒CNVs檢測結果

3 討 論

貓叫綜合征(CDCS,OMIM 123450)是典型的染色體缺失綜合征，其在活產嬰兒中的發病率約為1/50 000～1/15 000，占小兒染色體病的1.3%，男女發病性別比例為5∶7，約1%的患兒存在嚴重智力障礙(IQ<20)[6]。遺傳學檢查中，77.50%的病例為5p末端缺失，8.75%為中間缺失，5.00%為新發的染色體易位，3.75%為嵌合體型。5p缺失的病因來源，85%～90%的病例源自新發突變，再發風險相對較低；10%～15%的病例源自平衡易位攜帶的雙親，且多源自平衡易位的父親，再發風險相對較高[7-8]。本研究中，兩例患兒的父母、患兒1的姐姐及患兒2的哥哥外周血染色體核型分析結果均未檢出異常，因此，兩例患兒均屬于新發的染色體突變，且均為5p末端缺失。

貓叫綜合征具有明顯的遺傳異質性和臨床表型差異，患者病情的嚴重程度、智力水平、發育遲緩及預后效果與5p缺失的片段大小及位置有關。與貓叫綜合征表型密切相關的關鍵區域主要定位于5p15.2和5p15.3。5p15.2缺失與患兒小頭、圓臉、寬眼距、低耳位、小下頜等典型面部特征及智力低下的臨床表現相關。5p15.3缺失與患兒喉肌發育不良、貓叫樣哭聲和語言發育遲緩等癥狀有關[9-10]。本研究中，患兒1的核型為46,XX,del(5)(p13)，在5p15.33-p13.2(10500-34686487)區域存在34.68 Mb的單拷貝缺失，患兒2的核型為46,XY,del(5)(p14)，在5p15.33-p14.3(10500-22025370)區域存在22.01 Mb的單拷貝缺失。兩例患兒均缺失了5p15.2和5p15.3關鍵區域，并符合貓叫綜合征的臨床特點。

分子遺傳學研究在貓叫綜合征患者關鍵區域進一步發現并定位了與疾病表型特征密切相關的一些特異基因。在5p15.33-p11區域的314個基因中，TERT、SEMA5A、CTNND2、MARCH6、NPR3等為單倍劑量不足的敏感基因，SLC6A3、CDH18、CDH12、CDH10、CDH9、CDH6等在其他遺傳因素或環境因素作用下具有單倍劑量不足效應，RICTOR、DAB2等具有單倍劑量致死效應[3]。TERT端粒反轉錄酶基因主要編碼端粒酶催化亞基，是維持端粒酶活性的必要成分，對人體正常細胞的生長發育具有關鍵的調控作用。TERT基因缺失可造成胎兒發育障礙，同時也是影響貓叫綜合征患兒表型變化的重要遺傳因素[1]。SEMA5A、CTNND2及CDH18、CDH12、CDH10、CDH9、CDH6等基因與大腦發育密切相關，其劑量不足將阻礙大腦正常發育，導致泛自閉癥障礙癥候群或不同程度的智力障礙[11-12]。而編碼E3 泛素連接酶的MARCH6基因參與蛋白質的降解途徑，其缺失可能與貓叫樣哭聲有關[13]。本研究中，兩例患兒均表現出貓叫樣哭聲、肌張力低、生長發育遲緩等典型癥狀，筆者認為這與二者均缺失了5p15.33-p14.3片段，缺失了諸如TERT、SEMA5A、CTNND2等上述多個單倍劑量不足或條件性單倍劑量不足的敏感基因有關。此外，與患兒2相比，患兒1的臨床表現更為嚴重，還表現出心臟及腦部發育異常、智力障礙等其他癥狀。筆者推測，這可能與患兒1在5p上缺失了更大的片段(即5p14.3-p13.2片段)，有更多的基因(包括CDH10、CDH9、CDH6、PRDM9等數個關鍵基因)發生了拷貝數異常有關。CHIHPING等[14]的報道也發現5p14.3-p14.1缺失的胎兒產前超聲檢查提示有先天性心臟病。盡管本研究全外顯子組測序結果提示性預測患兒1的臨床癥狀可能重于患兒2，但臨床表型還受到其他遺傳和環境因素的影響。同時，因本研究納入的病例年齡較小，患兒2尚不足1個月，對其是否存在智力低下、語言障礙、心肝脾肺腎異常等基因型-表型關聯性的評價還有待后期對其進行隨訪和檢查，且還需積累更多病例資料，以便對相應的關鍵染色體區域進行更加深入的分子遺傳學分析，從而更深入地揭示貓叫綜合征缺失基因型與表型的相關性。

染色體核型分析是目前診斷染色體疾病的“金標準”，可檢測到染色體數目異常及較大片段(>5 Mb以上)的結構異常[15]。FISH和多重連接依賴式探針擴增技術能分辨較小的染色體缺失或重復，但檢測通量較低，操作相對繁瑣[16]。全外顯子組測序技術能在全基因組水平上檢測到外顯子區絕大部分疾病的相關變異，具有高通量、高靈敏度和高性價比等優勢，已在臨床基因檢測和基因診斷中逐漸被推廣應用，但基于全外顯子組測序技術檢測CNVs來分析染色體疾病的研究尚不多見。隨著探針捕獲技術和生物信息數據算法的不斷優化，一些研究和報道表明全外顯子組測序技術是一種經濟、快速有效的篩查染色體CNVs的輔助診斷方法[5,17]。

本研究采用全外顯子組測序技術將兩例無親緣關系貓叫綜合征患兒的5號染色體缺失區域進行了精細定位，發現了不同大小片段的染色體拷貝數缺失區域及缺失片段所涉及的關鍵基因，進一步提供了貓叫綜合征遺傳異質性的實驗證據，其結果與核型分析能相互印證，進一步表明采用全外顯子組測序與核型分析相結合的聯合分析方法，有利于彌補常規細胞遺傳學分析方法的不足，可在全基因組范圍內對染色體異常位點和片段進行精確定位，可對染色體片段缺失等染色體病進行輔助診斷，為染色體病的臨床表型異質性分析、癥狀預測預警與疾病管理等提供更多分子遺傳學線索和輔助診斷措施，其臨床應用價值和策略值得通過更多的案例來進行驗證和優化。