瑞舒伐他汀對膿毒癥大鼠心肌自噬的影響*

齊心欣，顧忠民，劉宇簫

廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 350007

膿毒癥性心肌損害為嚴(yán)重膿毒癥的常見并發(fā)癥，其病死率較高，目前發(fā)病機(jī)制仍未完全明確［1］。自噬（autophagy)是細(xì)胞在基因調(diào)控下對胞內(nèi)錯誤折疊的蛋白質(zhì)及損傷的細(xì)胞器進(jìn)行降解過程，其是維持細(xì)胞功能的重要生理活動，但過高或過低的自噬活動對機(jī)體有害。新近研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥心肌損害時存在自噬異常［2］，但其在病情發(fā)展中的作用未完全明確。瑞舒伐他汀（rosuvastatin,ROS）是新型親水型他汀，其藥理作用強(qiáng)、副作用相對較低，目前廣泛應(yīng)用于冠心病、腦梗塞等心腦血管疾病治療［3］。新近有研究發(fā)現(xiàn)在帕金森動物模型中，ROS影響神經(jīng)細(xì)胞自噬［4］，但相關(guān)研究仍很少。關(guān)于ROS是否影響膿毒癥心肌細(xì)胞自噬、減輕心肌損害目前未見報(bào)道。故筆者通過實(shí)驗(yàn)比較膿毒癥大鼠予ROS治療后，血漿超敏肌鈣蛋白I（High-sensitivity troponin I，hsTnI）、心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(microtubule-associated protein l light chain 3B，LC3-II)、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin,mTOR)及自噬效應(yīng)蛋白Beclin-1的水平變化，探討其影響膿毒癥心肌自噬及減輕膿毒癥心肌損害的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

24只6周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重（200±10）g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK滬，2017-0005），按照隨機(jī)數(shù)字表分為3組，即假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥心肌損傷模型組（CLP組）、膿毒癥瑞舒伐他汀給藥組（ROS組），每組8只。

1.2 試劑及儀器

瑞舒伐他汀（阿斯利康制藥有限公司，批號135508），大鼠hsTnIELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號m l059498），抗大鼠PGC-1α一抗（北京博奧森生物技術(shù)公司，批號bs-1832r)，抗大鼠LC3-II一抗（美國CST公司，批號#4108)，抗大鼠mTOR一抗（北京博奧森生物技術(shù)公司，批號bs-1992R），抗大鼠Beclin-1一抗（北京博奧森生物技術(shù)公司，批號bs-1353R），HRP goat anti-rabbit IgG（美國proteintech，批號SA00001-2），10%水合氯醛溶液（廣州沛瑜生物制品有限公司），10%甲醛溶液（湖南爾康制藥股份有限公司），RIPA裂解液（中國上海碧云天，批號P0013B），生物樣品均質(zhì)儀（中國杭州奧盛，型號BioPrep-24），臺式冷凍離心機(jī)（中國湖南湘儀，H1650R），酶標(biāo)儀(美國AWARENESS公司，型號Stat Fax 2100)，石蠟切片機(jī)（德國徠卡，型號RM2235），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，型號BX51TF）等。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法：Sham及CLP組于造模前連續(xù)5天，每日給予淀粉混懸液灌胃一次（混懸液配置為淀粉2.0 mg/kg.d溶于2 m l生理鹽水）；ROS組于造模前連續(xù)5天，每日予瑞舒伐他汀混懸液灌胃一次（混懸液配置為ROS 2.0 mg/kg.d溶于2 m l生理鹽水）；術(shù)前12 h禁食。大鼠瑞舒伐他汀治療量以成人每日20 mg用量為基礎(chǔ)，按照大鼠與人的藥物劑量換算表計(jì)算出。

1.3.2 模型制作：CLP組及ROS組參考Hubbard WJ等人的實(shí)驗(yàn)方法［5］造模：大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 m l/kg麻醉，手術(shù)切開腹腔，結(jié)扎盲腸中段，在結(jié)扎處遠(yuǎn)端0.5 cm處用25號針頭貫穿腸壁1次，擠出腸內(nèi)容物，回納盲腸并縫合關(guān)腹。Sham組同法開關(guān)腹，但不予盲腸結(jié)扎穿孔。3組術(shù)后皮下注射林格氏液50m l/kg，術(shù)后正常飲食、飲水。

1.3.3 標(biāo)本采集：術(shù)后24 h三組大鼠予10%水合氯醛3.5 m l/kg腹腔注射麻醉后，眼球采血2 m l，分離血清（3 000 r/min離心20 min），-80℃冰箱保存待檢hsTnI；取左心組織加入RIPA裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中研磨成勻漿，4℃，12 000 rpm離心15 min分離上清液，待檢PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1；取右心組織置入10%甲醛溶液保存24 h備光鏡檢查。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血清hsTnI濃度測定分離血清標(biāo)本按照ELISA試劑盒使用說明檢測hsTn I濃度。

1.4.2 心肌PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1蛋白測定 取分離后組織上清液，加5×SDS上樣緩沖液，98℃加熱5 min，使蛋白變性，灌膠上樣進(jìn)行電泳。取出凝膠轉(zhuǎn)膜，封閉，依次加入一抗、二抗并室溫孵育，ECL顯色曝光，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件分析相關(guān)蛋白條帶的灰度值，以相關(guān)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值比值作為上述蛋白的表達(dá)水平。

1.4.3 心肌病理取固定后心肌組織，石蠟包埋切片，光學(xué)顯微鏡下觀察三組大鼠心肌組織改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各 組 大 鼠hsTnI、PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1濃度比較

三組術(shù)后24 h hsTn I、PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1濃度間有顯著差異（P<0.05）；與Sham組比較，術(shù)后24 h CLP、ROS組hsTnI、PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1濃度均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與CLP組同期比較，ROS組hsTnI、PGC-1α及mTOR濃度均明顯下降，LC3-II及Beclin-1濃度升高，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1，圖1。

表1 各組大鼠24 h hsTn I、PGC-1α、LC3-II、m TOR及Bec lin-1濃度比較（±s）

表1 各組大鼠24 h hsTn I、PGC-1α、LC3-II、m TOR及Bec lin-1濃度比較（±s）

注：三組間同期比較P＜0.05，CLP與Sham組同期比較a P<0.01，ROS與Sham組同期比較b P<0.01；ROS與CLP組同期比較，c P<0.05

組別Sham（n＝8）CLP（n＝8）ROS（n＝8）F t a t b t c hsTn I(pg/m L）309.50±31.80 1 524.00±93.97a 696.70±52.61bc 91.6 12.3 6.3 7.68 PGC-1α 15.92±4.49 63.56±9.27a 39.18±6.08bc 11.89 4.62 3.07 2.19 LC3-II 17.83±1.47 33.09±1.42a 40.47±2.55bc 37.32 7.46 7.67 2.52 mTOR 17.33±1.13 29.72±2.15a 24.12±1.29bc 15.21 5.08 3.96 2.23 Beclin-1 20.58±1.68 30.48±1.86a 41.09±3.22bc 18.76 3.93 5.63 2.84

圖1 各組大鼠24 h PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1的表達(dá)

2.2 各組大鼠心肌組織變化比較

Sham組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞膜光整，細(xì)胞間隙未見滲出改變；CLP組心肌細(xì)胞腫脹、空泡變性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清甚至壞死，組織間隙見明顯滲出，而ROS組心肌細(xì)胞變性、壞死及組織間隙滲出等病變較CLP減輕，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織光鏡結(jié)果(HE染色×400)

3 討論

心臟是嚴(yán)重膿毒癥最常受累的器官之一，目前研究提示多種機(jī)制參與了膿毒癥心肌損害過程［1］。自噬被認(rèn)為是維持正常細(xì)胞功能的自我保護(hù)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時，免疫細(xì)胞內(nèi)合適的自噬水平具有清除胞內(nèi)微生物、抗原提呈及調(diào)節(jié)免疫等功能［6］。新近研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時脂多糖、炎癥介質(zhì)、微循環(huán)障礙等多因素可造成心肌細(xì)胞胞內(nèi)多種細(xì)胞器損傷，細(xì)胞通過適應(yīng)性自噬增加，清除受損細(xì)胞器、炎癥小體等避免細(xì)胞進(jìn)一步損傷甚至壞死，自噬被認(rèn)為是心肌細(xì)胞自我保護(hù)的機(jī)制［2］。然而隨著膿毒癥病情進(jìn)展，胞內(nèi)自噬減弱，出現(xiàn)細(xì)胞壞死，加重了器官功能障礙。藥物干預(yù)能否影響膿毒癥心肌自噬從而改善心肌存活等，目前都成為研究熱點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物除有調(diào)脂、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊作用外，還具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化反應(yīng)等額外藥理作用［3］。ROS是新型親水型他汀，其藥效強(qiáng)、體內(nèi)清除路徑多、不良反應(yīng)較低。新近有研究發(fā)現(xiàn)在帕金森動物模型中ROS影響神經(jīng)細(xì)胞自噬［4］，但是否影響膿毒癥心肌自噬而減輕膿毒癥心肌損害，目前未有報(bào)道，故本研究予探討。

本實(shí)驗(yàn)大鼠予盲腸結(jié)扎穿孔造模，術(shù)后光鏡下見大鼠心肌出現(xiàn)明顯損傷甚至壞死，同期血清hsTnI明顯增高，出現(xiàn)膿毒癥心肌損害。目前研究認(rèn)為膿毒癥心肌損害患者早期即出現(xiàn)hsTnI水平增高，是預(yù)測患者早期死亡率的獨(dú)立危險因素［7］。由于hsTnI可作為膿毒癥心肌損害的重要生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)，因此積極控制其水平對病情有重要意義。我們研究發(fā)現(xiàn)，ROS組hsTn I濃度有明顯下降，心肌病理損傷減輕，提示瑞舒伐他汀可減輕膿毒癥心肌損害。

PGC-1家族是一類核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)。PGC-1α是其中的一員，分布與心肌、肝等線粒體豐富的組織中，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)胞內(nèi)脂肪酸代謝蛋白的表達(dá)［8］。生理下心肌主要通過脂肪酸β氧化獲得能量，病理下降低心臟細(xì)胞對脂肪酸的利用，可以滿足心肌細(xì)胞的低耗氧要求［9］。膿毒癥心肌損害時心肌線粒體受損，細(xì)胞氧利用障礙［1］，脂肪酸氧化加重細(xì)胞缺氧損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CLP組PGC-1α水平明顯增高，同期心肌病理損害嚴(yán)重，提示CLP時心肌脂肪酸代謝不利于細(xì)胞存活。我們發(fā)現(xiàn)治療組PGC-1α水平下降，心肌損害減輕，提示ROS通過影響其表達(dá)可減輕膿毒癥心肌損害。目前研究發(fā)現(xiàn)PGC-1與自噬間存在一定聯(lián)系，但具體關(guān)系通路及合適的表達(dá)水平未完全明確，有待進(jìn)一步研究［10-11］。

LC3-II蛋白目前認(rèn)為是胞內(nèi)自噬發(fā)生的標(biāo)志蛋白［12］。當(dāng)自噬誘導(dǎo)產(chǎn)生后，細(xì)胞內(nèi)LC3-I蛋白經(jīng)泛素樣修飾后轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II，其促進(jìn)胞內(nèi)自噬小體的形成，通過檢測LC3-II蛋白量，可反映胞內(nèi)自噬水平。mTOR通路是最主要的自噬激活通路，mTOR水平下降可激活自噬［13］。目前研究發(fā)現(xiàn)mTOR通路參與了膿毒癥心肌損害［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CLP及ROS兩組光鏡及hsTnI水平支持出現(xiàn)膿毒癥心肌損害，同期LC3-II水平增高，提示膿毒癥心肌損害時心肌細(xì)胞存在自噬。然而CLP組mTOR水平明顯增高，LC3-II水平下降，提示CLP組心肌自噬受到抑制，細(xì)胞損害明顯。ROS組通過降低mTOR水平，增強(qiáng)了胞內(nèi)自噬，從而減輕心肌損害。目前認(rèn)為Beclin-1通過與PI3-Atg14相互作用，促進(jìn)自噬進(jìn)程，其介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳遞鏈?zhǔn)橇硪唤M重要的自噬正反饋通路。近來發(fā)現(xiàn)通過激活Beclin-1表達(dá)，可減輕膿毒癥心肌損害［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CLP組自噬受限，同期Beclin-1水平下降，ROS通過增強(qiáng)其表達(dá)，改善自噬，減輕心肌損害。

綜上本研究提示膿毒癥心肌損害時，hsTnI和PGC-1α等反映心肌損傷的因子水平明顯增高，同期胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白如mTOR、Beclin-1及LC3-II等表達(dá)異常，自噬活動受限。ROS通過影響自噬因子表達(dá)，減輕膿毒癥心肌損害，其為臨床用藥提供一定的治療依據(jù)。