歐前胡素對人前列腺癌PC3細胞增殖 凋亡及RhoA/ROCK1信號通路的影響

劉明娟，韓瑞霞，李 鐵，李江濤

(1.河北省第七人民醫院泌尿外科，河北 保 定 073000 2.河北省老年病醫院泌尿外科，河北 石家莊 050000)

前列腺癌(PC)是我國男性中最常見的癌癥之一，也是癌癥相關死亡率的第二大誘因，2019年我國新診斷前列腺癌病例為22萬例，與癌癥相關的死亡為月3萬例[1]。傘形科植物白芷的干燥根提取的歐前胡素具有多種生物活性，據報道歐前胡素可抑制癌細胞增殖和誘導其凋亡。先前的研究表明歐前胡素通過抑制細胞周期調節蛋白的表達來調節乳腺癌細胞周期和凋亡[2]。Rho關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶1(ROCK1)是Ras同源基因家族成員A(RhoA)的關鍵下游效應子。在一系列惡性腫瘤中，例如乳腺癌、前列腺癌和胃癌，已經檢測到ROCK1表達升高，其與預后不良相關，RhoA水平升高與PC風險增加相關[3]。RhoA也可能增加PC細胞的體外增殖，而反義介導的RhoA表達抑制可抑制體內腫瘤生長并阻止PC細胞侵襲性[4]。激活的ROCK1通過有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲蘇氨酸蛋白激酶(Akt)途徑使信號磷酸化。這些信號在PC細胞增殖和凋亡抑制中起重要作用[5]。目前關于RhoA/ROCK1信號通路與PC細胞侵襲機制的研究較少，因此，本研究擬探討歐前胡素對人前列腺癌PC3細胞增殖、凋亡及RhoA/ROCK1信號通路的影響，為歐前胡素治療前列腺癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑及儀器:歐前胡素(陜西永源生物技術有限公司，原料藥，純度98%，批號YYI-062)；5-氟尿嘧啶(武漢遠城科技發展有限公司，原料藥，純度99%，批號TY0987-01)；DMEM培養基(美國Gibco公司，批號26140-063)；胎牛血清(美國Invitrogen公司，批號WS12052)；二甲基亞砜、TRIzol試劑(碧云天生物科技有限公司，批號FCFC012、SE-36584)；噻唑藍(MTT)試劑盒(美國Promega公司，批號LE23696)；Transwell腔室系統(美國Corning Costar公司，批號TY1236)；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)檢測試劑盒(美國BD公司，批號LI21458-R)；反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司，批號RR149B、DRR057A)；放射免疫沉淀裂解緩沖液、二辛可寧酸蛋白質定量試劑盒(德國默克公司，批號159696、K36514)；硝酸纖維素膜、超敏ECL化學發光試劑盒(密理博中國有限公司，批號RF-36545、FT-6584)；RhoA、ROCK1、GAPDH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司，批號H00000387-M04、JT-58574、JS-10033)；兔抗人二抗(美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號YU-3654)；ELx800型全自動酶標儀(美國BioTek公司)；SD-98型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；FACScan型流式細胞儀(美國通用公司)；ABI7900型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI公司)；SmartView Pro 2000型凝膠成像儀(北京金恒祥儀器有限公司)。

1.2細胞培養及分組:人前列腺癌PC3細胞購自美國典型培養物保藏中心，批號CSTC-2020010307，將PC3細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，細胞培養環境為：37℃、5%CO2、2% O2、93%N2。 分組設計：PC3細胞組：細胞濃度為5×106/mL的人前列腺癌PC3細胞液在10%胎牛血清的DMEM培養基中培養；5-氟尿嘧啶組：人前列腺癌PC3細胞培養方法同PC3細胞組，并加入濃度為100μg/mL的5-氟尿嘧啶[6]；歐前胡素低、高劑量組：人前列腺癌PC3細胞培養方法同PC3細胞組，各組分別加入濃度為60μg/mL、120μg/mL的歐前胡素[7]。以上各組每孔設6個平行樣，培養72h。

1.3細胞增殖水平測定:將每孔2×103個PC3細胞接種到96孔微量滴定板中，于37℃在5%CO2環境中培養48h。將10μL MTT試劑(5 mg/mL)添加到100μL培養基中，并在37℃下孵育4h。除去培養基，并加入二甲基亞砜(150μL/孔)。使用酶標儀測量490 nm處的吸光度OD值，存活率=(實驗組OD值- PC3細胞組OD值)/(實驗組OD值-空白對照組OD值)×100%。孔中含有培養基，但沒有細胞用作空白對照。

1.4細胞侵襲遷移水平測定:各組人前列腺癌PC3細胞培養結束后，將細胞重懸于無血清培養基中(細胞密度為8×103/mL)。將每組總共200μL細胞懸液添加到Matrigel包被的Transwell腔室系統中，并向基底外側室中添加含有100mL/L胎牛血清的培養基。培養48h后，將剩余的細胞用乙醇固定并用結晶紫染色，將室的基底膜風干并在倒置顯微鏡下檢查，并隨機選擇六個視野以獲取侵襲細胞數量的平均值并拍攝照片。

1.5細胞凋亡水平測定:各組人前列腺癌PC3細胞培養結束后，將細胞用胰蛋白酶消化并用PBS緩沖液洗滌兩次。然后將細胞用70%的冰冷乙醇固定，使用Annexin V-FITC/PI試劑盒進行分析。使用流式細胞儀通過熒光激活細胞分選分析染色的細胞后，生成細胞凋亡直方圖。FACS生成的直方圖由Cell Quest(Becto-Dickinson)分析，以確定每個階段中細胞的百分比。

1.6細胞RhoA、ROCK1 mRNA水平測定:使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用反轉錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒通過qRT-PCR儀進行擴增。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，使用引物序列：RhoA正向：5'-GCAGTTGTGCTCCTGAAGAA-3'，RhoA反向：5'-CGGGCGGCCAGAAACTACTG-3'；ROCK1正向：5'-GTGCCCAAAGAAAGGTGCTG-3'，ROCK1反向：5'-AGGAGGGGAGCCATCCATAG-3'；GAPDH正向：5'-GTAAAGACCTCTATGCCATCA-3'，GAPDH反向：5'-GGACTCATCGTACTCCTGCTG-3'。GAPDH基因用作標準化對照。PCR總反應體系(10μL)為：SYBR Premix Ex Taq 4 μL，cDNA模板 1μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，去離子水4 μL。熱循環參數為：95℃ 60s，95℃ 20s，57℃ 30s，70℃ 40s，78℃ 20s，共30個循環。采用2-△△Ct法計算RhoA、ROCK1 mRNA相對表達水平。

1.7細胞RhoA、ROCK1蛋白水平測定:各組人前列腺癌PC3細胞培養結束后，將細胞用放射免疫沉淀裂解緩沖液在冰上裂解30min，并在4℃下以10000×g離心10min。使用二辛可寧酸蛋白質定量試劑盒來測量蛋白質濃度。取總共30μg總蛋白用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上，并用Tween 20制備的5%脫脂奶粉封閉1.5h。然后將膜與RhoA(1∶1000)、ROCK1(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)一抗在4℃孵育過夜，然后將兔抗人二抗(1:5000)與膜在室溫下孵育2h，通過增強化學發光試劑盒顯色并由凝膠成像儀拍照。使用Quantity One軟件分析蛋白質條帶的灰度值。

2 結 果

2.1各組人前列腺癌PC3細胞OD值、存活率比較:與PC3細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組OD值、存活率降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組OD值、存活率升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組OD值、存活率降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組人前列腺癌PC3細胞OD值存活率比較

2.2各組人前列腺癌PC3細胞侵襲遷移能力比較:與PC3細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組穿膜數降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組穿膜數升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組穿膜數降低(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組人前列腺癌PC3細胞穿膜數數目比較(結晶紫染色，200倍)注:A：PC3細胞組，B：5-氟尿嘧啶組，C：歐前胡素低劑量組，D：歐前胡素高劑量組

表2 各組人前列腺癌PC3細胞侵襲遷移能力比較

2.3各組人前列腺癌PC3細胞凋亡率比較:與PC3細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組凋亡率升高(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組凋亡率降低(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組凋亡率升高(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組人前列腺癌PC3細胞凋亡率流式細胞圖注:A：PC3細胞組，B：5-氟尿嘧啶組，C：歐前胡素低劑量組，D：歐前胡素高劑量組

表3 各組人前列腺癌PC3細胞凋亡率比較

2.4各組人前列腺癌PC3細胞RhoA、ROCK1mRNA表達水平比較:與PC3細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組RhoA、R71.1mm。80.8mm(+28.2mm,94.7mm)〗51.1mm。80.9mm(+8.2mm,3.7mm)〗OCK1 mRNA表達水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組人前列腺癌PC3細胞RhoA ROCK1 mRNA表達水平比較

2.5各組人前列腺癌PC3細胞RhoA、ROCK1蛋白表達水平比較:與PC3細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1蛋白表達水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1蛋白表達水平升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組RhoA、ROCK1蛋白表達水平降低(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組人前列腺癌PC3細胞RhoA ROCK1蛋白表達水平比較

圖3 各組人前列腺癌PC3細胞RhoA、ROCK1蛋白表達水平印跡圖注:A：PC3細胞組 B：5-氟尿嘧啶組 C：歐前胡素低劑量組 D：歐前胡素高劑量組

3 討 論

草藥及其提取物可提供具有多種生物學功能的多種植物化學物質。在這些植物化學物質中，歐前胡素涉及不同細胞系統的生物化學反應，在植物生物化學和生理學中起著重要作用，包括抗氧化劑，酶抑制劑和有毒物質的前體[8]。在其多種生物學特性中，其抗腫瘤活性和抗增殖作用已得到廣泛研究和報道。本研究中，與PC3細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組OD值、存活率、穿膜數降低，凋亡率升高；這說明，歐前胡素能明顯抑制人前列腺癌PC3細胞增殖、侵襲，促進其凋亡。有研究表明，歐前胡素在腫瘤細胞系中顯示出較強細胞毒性活性，歐前胡素對肺癌細胞系具有顯著的抗增殖活性[9]。這與本研究結果一致。

侵襲-轉移級聯的初始步驟包括細胞間粘附的喪失、侵襲局部微環境、血管內滲入血液和淋巴管系統以及滲入遠處組織的實質。該過程由上皮-間質轉化(EMT)控制，通過該過程，上皮細胞喪失其上皮特征并獲得間充質細胞的許多屬性，包括與上皮細胞片的結合喪失以及獲得細胞運動性、侵襲性和抗凋亡性[10]。EMT程序涉及上皮蛋白表達的上調，特別是RhoA。RhoA是上皮表型的下游效應子，并且是EMT誘導因子抑制的靶標，當RhoA過表達時，會觸發許多與EMT相關的表達[11]。EMT可能僅涉及癌細胞的一小部分-少數位于癌細胞內上皮和基質之間的界面。實體瘤的進展涉及EMT在空間和時間上的發生，從而腫瘤細胞獲得更具侵襲性和轉移性的表型。RhoA的上調是轉移性癌癥中最常報道的現象之一，ROCK1在乳腺癌中具有促進作用[12]。生物信息學分析顯示ROCK1是RhoA的潛在靶目標[13]。體外細胞學研究表明，ROCK1與乳腺癌細胞的體外遷移能力呈正相關[14]。相比較具有低轉移能力和低表達ROCK1的乳腺癌MCF-7細胞，高表達ROCK1可使這些細胞獲得更高的轉移潛能。在乳腺癌MDA-MB-231細胞中，ROCK1低表達顯著抑制了細胞遷移能力。ROCK1能夠抑制原代星形膠質細胞中caspase-3的活性。研究發現抑制RhoA和ROCK1的表達能夠誘導白血病細胞凋亡[15]。本試驗研究結果顯示，與PC3細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達水平降低；且歐前胡素高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達水平低于歐前胡素低劑量組。說明歐前胡素可抑制人前列腺癌PC3細胞侵襲遷移、促進其凋亡水平，其機制可能與歐前胡素可抑制人前列腺癌PC3細胞RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達進而抑制RhoA/ROCK1信號通路的激活有關。

綜上所述，歐前胡素能明顯抑制人前列腺癌PC3細胞增殖、侵襲，促進其凋亡，其機制可能與歐前胡素可抑制人前列腺癌PC3細胞RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達進而抑制RhoA/ROCK1信號通路的激活有關。