絲裂原活化蛋白激酶MAP2K5-rs4776970多態性與異常代謝相關性研究

徐 旭, 劉金玲, 梁國威

(航天中心醫院檢驗科，北京 100049)

近年來，我國人民生活水平有很大幅度的提高，但肥胖、高血壓、血脂紊亂及糖代謝異常等疾病發生率也逐年的增高，并且多種異常的臨床代謝癥狀同時出現稱為代謝綜合征(Metabolic syndrome,MS)，可引起血管動脈粥樣硬化形成斑塊，進而導致心梗、腦梗及糖尿病。近期發生的影響全球的新型冠狀病毒，對人類的健康和生存存在嚴重威脅。有研究顯示，新冠重癥患者體型偏胖，合并癥中存在高血壓、糖尿病是發展成重型、危重型的高危因素之一。遺傳因素對肥胖及其相關并發癥的影響是近年來研究的熱點之一，其最終導致MS發病。Fall等[1]文獻綜述中研究的肥胖相關基因有57種，其中絲裂原活化蛋白激酶激酶5(Mitogen-activated protein kinase kinase 5,MAP2K5)-rs4776970的基因位點國內研究較少，我們通過此隊列研究，探索MAP2K5基因與代謝異常及血管慢性炎癥的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料:采集我院1224例健康體檢人群，根據NCEP-ATPⅢ的中國人修訂診斷標準將他們分為代謝綜合征(MS)組和非MS組，其中MS組520例；非MS組704例。排除嚴重感染、腫瘤、血液病、肝病等。測量腰圍(WC)、體重指數(body mass index,BMI)；收集高血壓史、吸煙史、糖尿病史及其藥物治療情況、空腹血糖等危險因素。MS診斷：①男性腰圍≥90cm，女性腰圍≥80cm；②TG≥1.70mmoL/L；③HDL-C<1.29 mmoL/L(女)，HDL-C<1.03 mmoL/L(男)。血壓≥130/85mmHg和降壓藥物治療者；⑤FPG≥5.6mmoL/L和降糖藥物治療者。符合以上3項及以上。

1.2方 法

1.2.1實驗室檢查：使用真空采血管抽取空腹肘靜脈血，4h內檢測完畢。采用貝克曼庫爾特公司AU5811全自動生化分析儀，測定甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)，日本積水株式會社提供LDL、HDL、hs-CRP試劑及校準品，AUTEC DIAGNOSTICA公司提供TGCHO試劑及校準品。利德曼公司提供血糖試劑及校準品檢測空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)，采用日本東曹公司提供的糖化血紅蛋白儀HLC-723G8及試劑、質控、校準品測定糖化血紅蛋白(HbA1C)。

1.2.2DNA提取：EDTA-K2抗凝血2mL，按照TIANGEN公司提供的DNA提取試劑盒操作說明進行DNA的提取，-80℃冰箱備用。

1.2.3SNP檢測：MAP2K5-rs4776970等位基因采用特異性引物(ARMS原理)，通過特異引物與TaqMan探針和公用引物建立的2個反應體系的Ct值測定不同等位基因，根據ΔCt(ΔCt=野生引物反應體系Ct值-A突變引物反應體系Ct值)來判定基因型。各序列見表1。

表1 ARMS-雙TaqMan方法檢測肥胖相關基因位點突變引物及探針序列

PCR分型反應體系為天根生化科技(北京)有限公司提供，20ul，DNA 2ul，2× Master mix 8ul和Ehance inhibit1ul，MAP2K5-rs4776970上、下游引物各1ul(終濃度0.25uM)，探針各1ul(0.25uM)，水3ul。95℃2min，95℃15s、60℃1min(共40個循環)作為反應條件。使用美國ABI公司的7500熒光定量PCR儀。任意選取分型后的MAP2K5-rs4776970不同等位基因型各3例，經北京諾賽基因組研究中心測序證實100%符合。

1.3統計分析:采用SPSS13.0軟件進行分析。兩組間計量資料比較采用獨立樣本T檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。基因分型與MS間的獨立相關性用Logistic回歸分析。三組間比較使用ANOAN方差分析,以P<0.05認為其差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組基線資料比較:MS組合非MS組人群的基本資料見表2，除了WC、舒張壓、收縮壓、TG、HDL-C、FPG這些納入分組標準的指標有差異外，MS組年齡、HbA1c、Hs-CRP水平顯著高于非MS組，差異有統計學意義(P<0.001)；TC、LDL-C水平MS組與非MS組比較，無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 1224例研究對象基礎資料

2.2MAP2K5-rs4776970基因型在MS中頻率分布:1224例研究對象中MAP2K5-rs4776970等位基因分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.073，P=0.787)，具有群體代表性。MS組中MAP2K5-rs4776970的AA型(7.5% vs 4.0%)分布頻率顯著升高(P<0.05),TT型(56.2%vs 59.5%)、TA型(36.3% vs 36.5%)的分布頻率兩組間無明顯差別(P=0.954)，A等位基因頻率在MS組中的發生率顯著高于非MS組(25.7% vs. 22.2%，P=0.048)見表3。

表3 MAP2K2-rs4776970基因型在MS中分布頻率n(%)

2.3MAP2K5-rs4776970基因型發生MS的危險性：對年齡和性別校正后，Logistic回歸分析表明，MAP2K5-rs4776970基因型與MS患病無顯著相關性(OR值為0.851，95%CI：0.7-1.035，P=0.106)。

2.4MAP2K5-rs4776970各基因型臨床資料比較：MAP2K5-rs4776970三個基因型與WC、BMI及Hs-CRP相關(P=0.015；P=0.011；P=0.049)，進行任意兩組的比較,結果提示AA型的BMI、WC與TT型比較有顯著差異(P<0.01)；與TT型比較AA型的Hs-CRP及TA型的WC差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表4。

表4 MAP2K2-rs4776970基因型之間臨床資料比較

3 討 論

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是真核細胞的轉導反應中重要的信號系統。其信號轉導通路中三種激酶(MAP3K、MAK2K、MAPK)通過磷酸化依次激活，影響基因調控轉錄，調節細胞增殖、轉化、分化和凋亡、參與炎癥應激反應等重要病理生理過程。MAP2K中的MAP2K5是激活細胞外信號調控的蛋白激酶(ERK)5的重要激酶，對激活細胞外信號調控有重要作用，可以介導不同的生物學效應，對于細胞生存、增殖分化起著極其重要的作用。MAK2K5與肥胖、BMI、IR、瘦素等密切相關[2,3]。MAP2K5-rs4776970位于15q23，它參與激活的大MAPK通路(BMKI)在動脈粥樣硬化引起的心血管疾病中作用重要，可維持血管生成、完整性及心臟發展，使心室肥厚，增加心臟功能，還與細胞外及神經生長因子的作用相關[4]。

本研究顯示，年齡、HbA1c、hs-CRP水平MS組顯著高于非MS組，它們之間的差異有統計學意義(P<0.001)，提示該基因位點與糖代謝、肥胖及血管炎癥密切相關。其中AA型(7.5%vs 4.0%)分布頻率顯著升高(P<0.05)，A等位基因與MS相關(P=0.048)，是MS的遺傳危險因素。這可能與MAP2K5激活BMKI通路參與下丘腦瘦素-黑皮質素體重調控有關，瘦素通過作用于中樞神經系統調節能量代謝引起肥胖，肥胖是導致MS的發病的重要因素。付俊玲等[5]的一篇關于3506名中國兒童的研究顯示該基因位點與兒童肥胖也顯著相關(P=0.004)，特別是BMI、WC與血壓(P=0.02;P=0.02;P=0.03)，與瘦素、脂肪量呈正相關(P=0.013；P=0.014)，介導肥胖的原理可能是通過中樞神經的“瘦素抵抗”，激活ERK通路，對胰島素信號通路發揮了負調控作用。內臟脂肪較易分解成游離的脂肪酸，沉積后導致機體糖代謝障礙，也可通過釋放出炎性因子及引起胰島素抵抗來參與MS發病，同時慢性炎癥也增加了血糖控制不良的T2D患者發生心肌梗死和感染疾病的風險。在控制了性別年齡后，MAP2K5-rs4776970與MS無顯著相關(P=0.106)，說明該基因型與MS的關系可能與年齡增長有關。

hs-CRP是一個炎性指標，排除急性炎癥情況，可用來間接反映血管的慢性炎癥程度，對評估動脈粥樣硬化程度，有效預測心腦血管疾病敏感性高。本研究中MS組與非MS組的hs-CRP水平差異顯著，提示MS人群存在血管慢性炎癥，且攜帶AA基因型的人群hs-CRP水平明顯高于攜帶TT型的人群，更易發生血管炎癥。MAP2K5參與調控了多種致炎因子誘導的細胞間黏附分子、血管細胞黏附分子、基質金屬蛋白酶和單核細胞趨化因子的表達，促進炎癥反應，誘發血管內皮細胞的功能紊亂，在早期的動脈粥樣硬化發生中起到關鍵作用[6]。炎性反應是MS的誘發因素，通過多種機制參與其發生、發展。

綜上，本研究提示，MAP2K5-rs4776970基因多態性與肥胖、糖代謝異常及血管慢性炎癥相關，MAP2K5-rs4776970AA基因型及A等位基因頻率在MS人群中比例更高，但其不是MS發生的獨立危險因素。本研究還缺乏大樣本前瞻性研究，以明確MAP2K5- rs4776970位點基因多態性與異常代謝及血管慢性炎癥的相關性。減少肥胖，降低MS的發生，可能是降低新型冠狀病毒感染重癥率和死亡率的有效方法。