慢性阻塞性肺疾病合并骨質疏松大鼠模型建立與評價

丁念 鄭承紅

(1湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065；2武漢市中醫醫院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)表現為氣流受限呈漸進性不可逆的肺部疾病。COPD不但發病率逐漸增高，且已成為人類繼腫瘤、心腦血管之后的第四大死因。研究表明COPD常合并全身各系統疾病，其中包括心肌病、骨質疏松(OP)等〔1〕。COPD好發于老年男性患者，其骨密度(BMD)較同齡健康者顯著下降，OP發病率可達20%～58%，甚至更高〔2〕。OP是一種代謝性骨病，以單位體積內骨量減少為特點，其病理表現為骨皮質菲薄，骨小梁萎縮稀疏。臨床上易發生骨折，患者常受到骨骼疼痛的困擾，是老年患者傷殘和死亡的主要原因之一。

老年COPD患者OP的發病率是同齡組非COPD患者的2～5倍〔3〕。同樣，OP患者常因肌肉含量下降，骨骼疼痛而直接影響COPD患者的活動耐量及生活質量。本實驗擬采用熏香煙聯合氣道內滴注脂多糖法制備COPD大鼠動物模型〔4〕；利用切除Wistar大鼠雙側睪丸建立OP模型〔5〕；兩種造模疊加建立COPD合并OP模型，為臨床和實驗提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性Wistar大鼠40只，體重(220±25)g，3月齡，購于湖北省實驗動物中心。

1.2試劑和器材 紅梅香煙〔紅塔煙草(集團)有限責任公司；煙氣煙堿量：0.8 mg、焦油量：10 mg、煙氣一氧化碳量：12 mg〕；脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；雙能X線吸收BMD測定儀及附帶的小動物BMD測定軟件(美國Hologic公司)；肺功能檢測儀AniRes 2005(北京貝蘭博科技有限公司)；煙熏籠(自制)。

1.3動物分組和模型制備 將40只大鼠分成4組，即正常組、COPD組、OP組和COPD+OP組，每組各10只，適應性喂養1 w后開始實驗。正常組大鼠正常喂養不做處理。

1.3.1COPD模型的制備〔4〕COPD組大鼠于自制熏煙箱中，每次以20支香煙煙熏1 h，2次/d，連續12 w，并于造模開始后第7、14、21天給予大鼠氣管內注入LPS，仰臥位固定于固定板，暴露聲門以拔除針芯的16號靜脈套管針插入氣管，將LPS(1 mg/kg)通過氣管注入，然后使其直立旋轉，使LPS分布于兩肺。

1.3.2OP模型的制備〔5〕以水合氯醛麻醉后的大鼠俯臥姿勢固定，在雙側睪丸位置消毒后，縱向切開后摘除睪丸，滴入2～3滴青霉素，最后將切口縫合。

1.3.3建立COPD+OP模型 采用熏香煙聯合氣道內滴注LPS法疊加切除雙側睪丸去勢法建立大鼠COPD合并OP模型。

1.4標本的制作及指標檢測 造模12 w后，予10%水合氯醛2 ml/100 g麻醉大鼠，將大鼠左側股骨中段置于雙能X線吸收BMD測定儀測定BMD值。BMD是判定OP是否建立的金標準，也是檢測BMD改變的重要手段。檢測完BMD后，用肺功能檢測儀AniRes 2005對各組大鼠進行肺功能檢測，導出用力肺活量(FVC)、第0.2秒用力呼氣容積(FEV0.2)、第0.2秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值(FEV0.2/FVC)、最大通氣量(MVV)。檢測完成后，所有大鼠打開胸腔，取下右肺中葉并注射5 ml的4%多聚甲醛，然后再固定在4%多聚甲醛中，用于病理檢測。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠肺組織病理改變 正常組和OP組支氣管黏膜上皮細胞正常，未見淋巴細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤，肺泡及肺泡壁結構正常。COPD組：支氣管黏膜可見鱗狀上皮化生，上皮細胞壞死，肺間質及終末細支氣管有大量的炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞，部分融合成肺大泡。COPD+OP組：病理改變同COPD組肺泡結構破壞，且管壁及周圍有炎性細胞浸潤更多，肺泡部分融合成肺大皰。見圖1。

圖1 各組肺組織病理切片(HE，×200)

2.2各組肺功能的變化 與正常組比較，COPD組肺功能值顯著降低(P<0.05)，說明COPD大鼠模型復制成功；與正常組比較，OP組大鼠肺功能值略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與正常組比較，COPD+OP組肺功能值顯著降低(P<0.05)；與COPD組比較，COPD+OP組肺功能值略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組BMD的變化 與正常組比較，OP組BMD值顯著降低(P<0.05)，說明OP動物模型復制成功；與正常組比較，COPD組BMD值略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與正常組比較，COPD+OP組BMD值顯著降低(P<0.05)；與OP組比較，COPD+OP組BMD值略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組肺功能及股骨BMD測定

3 討 論

研究發現老年男性COPD患者36%～60%同時合并OP，隨著肺功能損害程度的增加，其OP嚴重程度也隨之增加〔6〕。老年COPD患者長期吸煙、反復使用糖皮質激素抗炎治療，久而久之導致OP，出現骨痛骨折，繼而活動減少，甚至臥床，又會導致肺部感染，使COPD病情惡化，呼吸困難，再次加大劑量使用糖皮質激素等藥物治療導致惡性循環。而合并OP的患者常因肌肉含量下降，骨骼疼痛直接影響COPD患者的活動耐量及生活質量，臨床急需阻斷此種惡性循環。建立COPD合并OP大鼠模型，能夠進一步臨床及實驗提供基礎。

吸煙已被公認是COPD的最主要的病因，香煙煙霧中的水溶性成分可起支氣管平滑肌的高反應性，引發氣道病變，導致COPD的發生發展。既往常采用熏香煙的方法建立COPD模型。近年來，國內外采用熏香煙聯合氣道內滴注LPS法制備COPD模型，更準確地反映出COPD的病理過程。宋小蓮等〔7〕發現采用煙熏加氣道內注入LPS建立大鼠COPD模型的病理生理改變較之單純煙熏法與人類COPD的發病特征更為相似。

目前國內外采用肺組織病理學觀察和肺功能測定作為評價COPD大鼠模型的主要指標〔8〕。研究發現，COPD模型大鼠的肺組織與人類COPD的病理變化基本一致〔9〕。本研究發現COPD合并OP組大鼠支氣管黏膜可見鱗狀上皮化生，上皮細胞壞死脫落，小氣道上皮鋸齒狀增生增厚，肺間質及終末細支氣管有大量的炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞，部分融合成肺大泡，肺氣腫更明顯。

肺功能是判斷氣流受限，診斷COPD的金標準，對COPD分級、評估、轉歸、預后都有著重要意義。目前判斷大鼠肺功能的指標通常選取Fev0.2、Fev0.2/FVC(%)、MVV等〔10〕。本研究中COPD大鼠模型復制成功。

采用睪丸切除法建立OP大鼠模型可以較好地模擬雄激素缺乏或低下時誘發男性OP的發病過程。國外研究發現切除雙側睪丸8 w后大鼠可表現出OP〔11〕。OP組雙側睪丸切除術是通過模擬男性雄激素缺乏，促進骨吸收抑制骨形成，同時使降鈣素分泌減少，破骨細胞活性增加而導致骨質疏松〔12，13〕。BMD檢測是診斷OP的核心指標，本研究結果提示動物模型復制成功。

綜上，通過檢測造模組大鼠肺組織病理及肺功能、BMD的改變驗證了采用Wistar雄性大鼠熏香煙方法聯合睪丸切除誘導COPD合并OP大鼠模型的方法成功有效。研究表明兩種造模方法對大鼠肺功能及BMD存在進一步損傷的影響，與臨床相符。本研究建立的COPD合并OP大鼠模型，將為進一步防治COPD合并OP的研究提供動物模型。