高效液相色譜分析中的樣品前處理

◎ 田一茗

（咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心彬長(zhǎng)旬區(qū)域分中心，陜西 咸陽(yáng) 713500）

近年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)于食品安全問(wèn)題越來(lái)越重視，國(guó)家對(duì)食品安全的監(jiān)管力度不斷加強(qiáng)。食品檢測(cè)作為食品安全監(jiān)管的技術(shù)支撐，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)于食品監(jiān)管至關(guān)重要。食品檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，其中液相色譜分析法使用廣泛，是目前食品檢測(cè)領(lǐng)域最主流的技術(shù)手段之一。

一方面，由于食品生產(chǎn)工藝的不斷進(jìn)步以及監(jiān)管部門加大監(jiān)管力度且食品中的目標(biāo)組分含量越來(lái)越少，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中樣品處理技術(shù)的要求越來(lái)越高，加大了檢測(cè)人員工作的難度。另一方面，在食品檢測(cè)過(guò)程中，能夠直接進(jìn)入液相色譜儀分析的樣品極少。因此，選用合適的樣品前處理方法在液相色譜分析中尤為重要。

1 樣品前處理的重要性

樣品前處理是整個(gè)儀器分析實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)從采樣到數(shù)據(jù)處理中相當(dāng)關(guān)鍵的一環(huán)，也是儀器分析中操作最復(fù)雜、最耗時(shí)的部分。液相色譜分析中樣品前處理的重要意義概括來(lái)說(shuō)有以下幾個(gè)方面。①樣品的基質(zhì)過(guò)于復(fù)雜，影響了目標(biāo)組分的測(cè)定。由于食品的配料以及加工工藝等原因，其所含成分復(fù)雜，可能會(huì)出現(xiàn)與目標(biāo)組分性質(zhì)相似的干擾成分，導(dǎo)致與被測(cè)組分的峰分離不完全或者出峰時(shí)間接近無(wú)法判斷，檢測(cè)人員需要通過(guò)預(yù)處理減少雜質(zhì)干擾、改善分離效果。②樣品中目標(biāo)組分的含量過(guò)低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于色譜儀的檢出限，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)得目標(biāo)物含量，需要通過(guò)提取、富集、濃縮等預(yù)處理方法提高檢測(cè)的靈敏度。③樣品中含有的某些物質(zhì)，破壞色譜柱。通過(guò)樣品的前處理，可以除去對(duì)色譜柱有破壞的物質(zhì)，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、微生物分子以及提取時(shí)的強(qiáng)極性溶劑，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。④由于前處理的步驟繁雜，在處理過(guò)程中方法不得當(dāng)或者忽略某一操作，會(huì)使加標(biāo)回收率偏低，目標(biāo)物質(zhì)定性錯(cuò)誤，出現(xiàn)結(jié)果偏離。

2 樣品的前處理技術(shù)

2.1 蒸餾技術(shù)

蒸餾技術(shù)是利用液體混合物中不同組分的沸點(diǎn)不同將目標(biāo)組分分離的前處理技術(shù)。實(shí)驗(yàn)室常用的蒸餾方法有水蒸氣蒸餾、減壓蒸餾以及常壓蒸餾。①水蒸氣蒸餾法。將待測(cè)樣品與水共同蒸餾，目標(biāo)組分與水共沸后隨水蒸氣分餾出來(lái)，是目前實(shí)驗(yàn)室常使用的提取方法之一，如食品添加劑丙酸鹽的提取[1-2]。②減壓蒸餾法。在常見(jiàn)的蒸餾裝置中加入一個(gè)真空泵，使得蒸餾裝置內(nèi)的壓力降低，降低了液體的沸點(diǎn)，用來(lái)分離或提純沸點(diǎn)較高且熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)，如辣椒中蘇丹紅的提取。③常壓蒸餾法。主要用于易揮發(fā)物質(zhì)與不易揮發(fā)物質(zhì)以及兩種沸點(diǎn)相差較大的物質(zhì)，除去待測(cè)樣品中的干擾組分。

2.2 溶劑萃取技術(shù)

溶劑萃取萃取依據(jù)萃取對(duì)象的基質(zhì)可分為液-液萃取、液-固萃取、液-氣萃取，液液萃取是分析實(shí)驗(yàn)中常用到的萃取方式。液液萃取應(yīng)用了相似相容原理，利用樣品中不同組分在不混容的兩種溶液中的分配比例不同，從而將目標(biāo)組分從復(fù)雜基質(zhì)中分離出來(lái)。例如蜜餞中色素赤蘚紅的提取[3]，將樣品溶液與三正辛胺-正丁醇溶液混合，振搖后，待水相與有機(jī)相分層后，分取溶有目標(biāo)組分的有機(jī)相進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。在實(shí)驗(yàn)操作中，檢驗(yàn)人員應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行萃取，一般遵守的溶劑選擇原則是：①萃取溶劑與原來(lái)溶液中的溶劑不發(fā)生作用、互不相溶。②萃取溶劑對(duì)于待測(cè)組分的溶解度要比原溶液中的溶劑大得多。③萃取溶劑對(duì)待測(cè)組分溶解度大且對(duì)其他雜質(zhì)的溶解度小，使待測(cè)組分從混合物中被有選擇地分離開(kāi)來(lái)。

2.3 超聲萃取技術(shù)（SAE）

超聲萃取技術(shù)就是在溶劑萃取時(shí)將其置于超聲環(huán)境下進(jìn)行，縮減了溶劑萃取的時(shí)間，提高萃取效率。在超聲振動(dòng)的過(guò)程中，所產(chǎn)生的能量被介質(zhì)吸收轉(zhuǎn)化成為熱量使介質(zhì)的溫度不斷增加到一定程度，這樣的升溫方式與傳統(tǒng)的水浴加熱所獲得的效果不相上下，而且更加便捷。空化機(jī)制[4]是超聲萃取技術(shù)的主動(dòng)力，當(dāng)超聲波作用于液體且其所產(chǎn)生的聲壓足夠大時(shí)，液體的平均分子間距不斷加大，最終大于分子間的極限距離，這時(shí)液體中會(huì)產(chǎn)生微小氣泡，這些微小氣泡在高頻率振蕩下生長(zhǎng)不斷聚集聲場(chǎng)能量，當(dāng)所積聚的能量達(dá)到一定值，其空腔內(nèi)部激烈收縮且崩潰，瞬間產(chǎn)生高壓和高溫，使液體中微粒的運(yùn)動(dòng)速度加快，使得萃取效率大大提高。超聲技術(shù)不止應(yīng)用在萃取中，在乳化、分散以及加速試劑溶解中都廣泛應(yīng)用，比傳統(tǒng)的分液漏斗振蕩和水浴振蕩器操作更加便捷高效。

2.4 固相萃取技術(shù)（SPE）

固相萃取技術(shù)是目前液相色譜分析中運(yùn)用最廣泛的樣品前處理萃取技術(shù)，如黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A等真菌毒素類以及其他農(nóng)殘檢驗(yàn)項(xiàng)目的樣品前處理都有采用固相萃取技術(shù)。固相萃取利用固體吸附劑將樣品中的干擾物質(zhì)與目標(biāo)組分分離開(kāi)來(lái)。基本原理：樣品經(jīng)過(guò)處理后成為樣液，通過(guò)有吸附劑填充的萃取小柱，目標(biāo)組分和干擾雜質(zhì)被吸附，然后利用選擇性溶劑去掉雜質(zhì)，用洗脫溶劑洗脫出目標(biāo)組分，濃縮、過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。操作步驟如下。①活化。一方面為了除去吸附劑中可能存在的與吸附相互作用且比目標(biāo)組分更強(qiáng)的雜質(zhì)，另一方面可以使吸附劑填料濕潤(rùn)，否則會(huì)使目標(biāo)組分過(guò)早流出萃取小柱，導(dǎo)致最終結(jié)果偏低。不同萃取小柱在使用活化溶劑時(shí)應(yīng)當(dāng)注意，非極性類的、反相固相萃取柱和離子交換柱用到的活化溶劑應(yīng)易溶于水，如乙腈、甲醇、丙酮等，再用水或者緩沖溶液洗去殘留的有機(jī)溶劑。極性的正相固相萃取小柱通常用非極性溶劑進(jìn)行活化，因?yàn)闃O性溶劑會(huì)與填充物中的極性物質(zhì)鍵合，減小了目標(biāo)組分與填充物的作用面積，導(dǎo)致回收率低。②上樣。應(yīng)當(dāng)注意加入萃取柱中的樣品體積應(yīng)與填充物用量相匹配，否則就減少加入小柱內(nèi)樣品的體積。樣品流速應(yīng)當(dāng)適合，不可過(guò)快，盡可能保證所有的目標(biāo)組分能夠有充分的時(shí)間被吸附劑吸附。③淋洗。用極性較弱的溶劑除去吸附在萃取柱中的干擾化合物，對(duì)于反相萃取柱來(lái)說(shuō)，一般用含適量有機(jī)溶劑的水溶液或者緩沖溶液來(lái)淋洗。④洗脫。使用強(qiáng)度合適的洗脫劑將目標(biāo)組分完全洗脫下來(lái)，經(jīng)過(guò)氮吹、濃縮后復(fù)溶。為了獲得較高回收率的同時(shí)，使用盡量少的洗脫溶劑，檢驗(yàn)人員可以通過(guò)條件實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇洗脫溶劑的用量和強(qiáng)度。確定一個(gè)最佳的洗脫方式，不但能夠最大限度地洗脫目標(biāo)組分，也可以使干擾組分能夠不被洗脫下來(lái)，而且減少了濃縮體積，提高實(shí)驗(yàn)效率。

2.5 衍生化技術(shù)

在液相色譜分析中，部分目標(biāo)組分不能夠直接被分離、檢測(cè)或者對(duì)檢測(cè)器響應(yīng)值低甚至無(wú)響應(yīng)時(shí)，使用衍生化試劑（具有特殊官能團(tuán)的試劑）與之反應(yīng)，將這種官能團(tuán)引入到目標(biāo)組分中，使其容易被分離或檢測(cè)。衍生化技術(shù)分為柱前衍生化和柱后衍生化。柱前衍生是將多組分樣品先通過(guò)衍生化反應(yīng)生成衍生化產(chǎn)物，進(jìn)入色譜柱分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行分析。但是，柱前衍生比較突出的缺點(diǎn)是把復(fù)雜組分衍生化后，可能會(huì)生成多種衍生化產(chǎn)物，不利于色譜分離，加大了色譜分離的難度。而柱后衍生化技術(shù)[5]改變了衍生化反應(yīng)和色譜分離的先后順序，克服了柱前衍生中多種衍生化產(chǎn)物引起的色譜分離效果不好的困難。相較于柱前衍生反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性良好、分析自動(dòng)化更高，因此被廣泛應(yīng)用。柱后衍生是將多組分樣液通過(guò)色譜柱在一定色譜條件下分離并流出色譜柱后，各組分分別與衍生化試劑反應(yīng)，得到的衍生化產(chǎn)物又重新進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行分析。比較常用的方法有熒光檢測(cè)的衍生化、紫外-可見(jiàn)檢測(cè)的衍生化以及電化學(xué)衍生化[6]。在黃曲霉毒素B1檢測(cè)過(guò)程中就用到了高效液相色譜-柱后衍生法，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016[7]中規(guī)定了3種檢測(cè)方法溴或碘試劑衍生、電化學(xué)衍生、光化學(xué)衍生。實(shí)驗(yàn)中，采用光化學(xué)柱后衍生法，黃曲霉毒素B1分子上的活性雙鍵在紫外光的照射下發(fā)生羥基化反應(yīng)，生成熒光強(qiáng)度更高的物質(zhì)。這種方法在不使用任何試劑的情況下，有效解決了黃曲霉毒素B1因響應(yīng)值過(guò)低而達(dá)不到儀器檢測(cè)要求的問(wèn)題。

3 樣品前處理的發(fā)展趨勢(shì)

樣品前處理技術(shù)在不斷發(fā)展的過(guò)程中，需要尋求的是一種比傳統(tǒng)技術(shù)和現(xiàn)有技術(shù)更加高效、更加環(huán)保且回收率高、重現(xiàn)性好的處理技術(shù)。近幾年，樣品前處理技術(shù)自動(dòng)化迅速發(fā)展。自動(dòng)化儀器比起傳統(tǒng)手工操作，不僅效率高而且結(jié)果好。例如，濃縮過(guò)程中，氮吹儀的自動(dòng)化，省去了手動(dòng)調(diào)節(jié)試管高度，避免了因人工操作不穩(wěn)導(dǎo)致的溶液外漏。還有，固相萃取從最初的手動(dòng)單個(gè)樣品處理以及自制萃取柱，到后來(lái)的可以批量處理的固相萃取裝置，通過(guò)與真空泵的連接來(lái)調(diào)節(jié)液體流速，以及固相萃取柱的商品化，如免疫親和柱、分子印跡柱、凈化柱等，再到全自動(dòng)固相萃取儀，可以萃取、濃縮一體操作。各種樣品前處理儀器的自動(dòng)化在樣品前處理環(huán)節(jié)中，不但將復(fù)雜煩瑣的操作變得簡(jiǎn)便快捷，而且還能在處理過(guò)程中減少有毒有害試劑、氣體對(duì)檢驗(yàn)人員造成的身體傷害以及對(duì)環(huán)境的污染。如今，傳統(tǒng)的前處理技術(shù)已經(jīng)不再滿足當(dāng)下的檢驗(yàn)需求，探索和學(xué)習(xí)前沿技術(shù)不僅是提高實(shí)驗(yàn)效率的手段，更成為未來(lái)樣品前處理技術(shù)發(fā)展的新趨勢(shì)。

4 結(jié)語(yǔ)

樣品前處理是目前色譜分析中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是操作相對(duì)較為困難的環(huán)節(jié)。想要得到較好的回收率，在樣品的前處理階段就需要選擇與目標(biāo)組分性質(zhì)相匹配的前處理方法，所選方法是否適用直接決定了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來(lái)，各種新型的前處理技術(shù)不斷發(fā)展、設(shè)備不斷更新，除了現(xiàn)有技術(shù)的學(xué)習(xí)使用外，檢測(cè)人員也應(yīng)加強(qiáng)新技術(shù)的學(xué)習(xí)，不斷提高檢測(cè)能力。