復方臭靈丹合劑質量標準研究

李江 陳凌云 付鵬 余曉玲

摘要：目的建立復方臭靈丹合劑的質量標準。方法采用TLC對桔梗和魚腥草進行定性鑒別，依據《云南省中藥材（民族藥材）質量標準研究技術指導原則（試行）》對其進行分析方法驗證及重現性考察。采用HPLC對合劑中的洋艾素和金絲桃苷進行定量分析，同時進行相關方法學的考察。結果桔梗和魚腥草TLC鑒別色譜圖中，供試品與對照藥材相應位置上均顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾，且分析方法驗證與重現性考察均合格。洋艾素和金絲桃苷分別在2.59～55.47 μg/mL和4.02～51.68 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程分別為Y1=43.24X-12.39（R=0.999 6）和Y2=63.82X-30.04（R=0.999 4），準確度試驗中，平均加樣回收率分別為100.06%和100.14%，RSD值分別為2.36%和2.74%（n=9），其余方法學考察均合格，洋艾素和金絲桃苷的平均含量分別為2.41 μg/mL和9.95 μg/mL。結論建立的質量標準穩定可行。

關鍵詞：復方臭靈丹合劑;桔梗;魚腥草;洋艾素;金絲桃苷;質量標準

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2021）02-0058-06

Study on the Quality Standard of Compound Laggera Pterodonta Mixture

LI Jiang1， FU Peng1， CHEN Ling-yun1，2， YU Xiao-ling1， 3

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology Research in Universities

of Yunnan Province， Kunming 650500， China;

3. Traditional Chinese Medicine Hospital of Kunming City， Kunming 650011， China）

【Abstract】Objective： To establish the quality standard of Compound Laggera Pterodonta Mixture. Methods： TLC was used to qualitatively identify Platycodon grandiflorum and Houttuynia cordata. According to the "Technical Guidelines for Research on Quality Standards of Chinese Medicinal Materials （Ethnic Medicinal Materials） in Yunnan Province （Trial）"， the analytical methods were verified and reproducible. HPLC was used to quantitatively analyze the artemitin and hyperoside in the mixture， and the related methodology was investigated at the same time. Results： In the TLC identification chromatogram of Platycodon grandiflorum and Houttuynia cordata， the test product and the control medicinal material showed the characteristic spots of the same color on the corresponding positions， negative and no interference. The analytical method verification and reproducibility inspection were all qualified. Artemitin and hyperoside had a good linear relationship in the range of 2.59 to 55.47μg/mL and 4.02 to 51.68μg/mL， respectively. The regression equations were Y1=43.24X-12.39 （R=0.999 6） and Y2=63.82X-30.04 （R=0.9994）， respectively. In the accuracy test， the average sample recovery rates were 100.06% and 100.14%， respectively and the RSD values were 2.36% and 2.74% （n=9）， respectively. The other methodological investigations were qualified. The average contents of artemitin and hyperoside were 2.41 μg/mL and 9.95 μg/mL， respectively. Conclusion： The established quality standards are stable and feasible.

【Key words】Compound Laggera Pterodonta Mixture;Platycodon grandiflorum;Houttuynia cordata;Artemitin;Hyperoside;Quality standard

上呼吸道感染是以咳嗽、咽痛及發熱等為主要癥狀，與細菌或病毒感染有關的疾病[1]，其發病機制與氣道廣泛炎癥、氣道的上皮細胞損傷、氣道高反應性、氣道神經炎癥、β腎上腺素能受體功能的改變、M膽堿能受體功能的改變等有關，并通過炎癥細胞、細胞因子、炎癥介質、神經遞質、神經肽、免疫球蛋白等起作用[2]，其治療藥物以抗病毒及抗生素類藥物為主[3]。

復方臭靈丹合劑中臭靈丹為君藥主要含洋艾素、金腰乙素、槲皮素等黃酮類成分[4]，具有清熱解毒的功效，常用于治療上呼吸道感染[5]，魚腥藥中金絲桃苷具有抑菌抗菌的作用[6]，西青果主要含多酚，類黃酮類成分，具有抗炎，抗菌作用[7]，其余滇柴胡、桔梗等藥味對此過程亦有抑制作用[8-9]。全方合用，具清熱解毒、抗菌消炎之功，用于治療感冒、咳嗽、急性扁桃體炎、咽喉炎、腮腺炎等上呼吸道感染疾病。本研究對復方臭靈丹合劑中的兩味藥進行了薄層鑒別，以洋艾素及金絲桃苷為含量測定指標成分對其質量標準進行了研究，為該合劑后期抗病作用及機制研究奠定了基礎。

1材料

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜系統（DAD檢測器，美國Agilent公司）;Diamonsil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm，迪馬科技公司）;T-1000型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）;WFH-203B三用紫外分析儀（上海精科實業有限公司）;SK2200HP超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）;薄層層析硅膠G板（青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司）。

1.2藥品與試劑洋艾素對照品（批號：111879-201001）、金絲桃苷對照品（批號：111521-201507）、魚腥草對照藥材（批號：21046-201607）、臭靈丹對照藥材（批號：121231-200301）均購自中國食品藥品檢定研究院;復方臭靈丹合劑（批號180613，180624，180712）由昆明市中醫醫院提供;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1復方臭靈丹合劑的制備本品由昆明市中醫醫院提取，其制備方法如下：按方稱取臭靈丹、西青果等味藥，加水煎煮2次，每次1h，濾過，濾液合并濃縮至適量，加入適量蔗糖和防腐劑，攪勻，即得。

2.2定性鑒別及其方法學考察

2.2.1桔梗的薄層鑒別及其方法學考察取本品30 mL，加硫酸0.5 mL，加熱回流1 h，放冷，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液加水30 mL洗滌，棄去洗液，三氯甲烷液用3 g無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液[10]。取桔梗對照藥材0.5 g，加7%硫酸乙醇-水（1∶3）混合液20 mL，自上述“加熱回流1h”起，同法制成對照藥材溶液。取缺桔梗的復方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進行試驗，以硅膠G板為吸附劑，三氯甲烷-乙醚（1∶1）為展開劑[11]，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 ℃下顯色。結果顯示，供試品與對照藥材相應位置上均顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾，分析方法驗證及重現性考察中，各溶液最佳點樣量均為10 μL，在15 ℃，25 ℃，35 ℃，50%、75%、90%濕度下[12]桔梗的TLC鑒別無明顯差異，青島海洋化工分廠和青島鼎康硅膠有限公司的硅膠G板薄層板對鑒別無明顯影響，所選三批樣品檢定結果均合格，故所建立的TLC鑒別方法穩定可行。結果見圖1。

2.2.2魚腥草的薄層鑒別[13]及其方法學考察取本品30 mL，濃縮至10 mL，加乙醚萃取2次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取魚腥草對照藥材0.5 g，加乙醚20 mL超聲10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為對照藥材溶液。取缺魚腥草的復方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進行試驗，以硅膠G板吸附劑，甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）為展開劑，于365 nm紫外燈下檢視。各項結果與“2.2.1”項中結果相同。結果見圖1。

2.3洋艾素含量測定

2.3.1溶液的制備精密稱取0.00243 g洋艾素對照品（含量以99.4%計），加甲醇定容至10 mL作為儲備液，取1 mL儲備液用甲醇定容至10 mL，作為對照品溶液（24.15 μg/mL）。本品搖勻后取100 mL，濃縮并定容至50 mL，精密移取定容液25 mL，水浴蒸干，干膏加少量甲醇浸潤后移至50 mL容量瓶中加甲醇定容，超聲10 min，濾過，并用10 mL甲醇洗滌容量瓶及濾渣，合并濾液及洗滌液，蒸干，殘渣加甲醇定容至5 mL，濾過，作為供試品溶液。取缺臭靈丹的復方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3.2色譜條件及系統適應性試驗色譜條件：C18柱為色譜柱;流動相為乙腈-2%甲酸溶液[14]（45∶55）;流速1 mL/min，波長350 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。系統適用性試驗中，供試品色譜中洋艾素色譜峰與相鄰色譜峰分離度為大于4.0，理論塔板數以洋艾素計不低于4000。結果見圖2。

2.3.3線性關系及線性范圍考察精密稱取洋艾素對照品0.00279 g，加甲醇定容至5 mL，作為儲備液，精密移取儲備液1 mL，加甲醇定容至10 mL（55.47 μg/mL），取此溶液3 mL，加甲醇定容至5 mL，依次反復操作得33.28、19.97、11.98、7.19、4.31、2.59 μg/mL對照品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件檢測。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y1=43.24Y-12.39（R=0.999 6），表明洋艾素在2.59～55.47 μg/mL間線性關系良好。

2.3.4儀器精密度實驗取“2.3.1”項下對照品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件檢測，連續進樣6次，RSD值為0.78%，表明儀器精密良好。

2.3.5穩定性實驗取“2.3.1”項下對照品溶液和供試品溶液，分別于0、4、8、12、16 h按“2.3.2”項下色譜條件檢測，峰面積RSD值分別為1.55%和1.88%，表明對照品溶液及供試品溶液在16 h內穩定性良好。

2.3.6重復性實驗取同一批樣品（批號180406）6份，按“2.3.1”項下制備供試品溶液，“2.3.2”項下色譜條件檢測，洋艾素平均含量為2.47 μg/mL，RSD為1.67%，表明重復性較好。

2.3.7準確度實驗精密移取同一批樣品9份（平均含量為2.47 μg/mL），每份50 mL，3份為1組，每組各精密加入0.4、0.5、0.6 mL對照品溶液（“2.3.1”項下中儲備液，241.54 μg/mL），按“2.3.1”項下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件檢測，平均加樣回收率為100.06%，RSD為2.36%，表明準確度較好。結果見表1。

2.3.8樣品中洋艾素含量測定取3批樣品，每批平行取2份，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件檢測。結果顯示，洋艾素平均含量為2.41 μg/mL，RSD值為2.36%。結果見表3。

2.4金絲桃苷含量測定

2.4.1溶液的制備精密稱取金絲桃苷對照品（含量以94.3%計）0.00274 g，加甲醇定容至10 mL作為儲備液（258.38 μg/mL），移取1 mL儲備液用甲醇定容至10 mL配得濃度為25.84 μg/mL作為對照品溶液。本品搖勻后精密移取10 mL，加等體積水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇液減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇定容至5 mL，濾過，作為供試品溶液。取缺魚腥草的復方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。

2.4.2色譜條件及系統適應性色譜條件：C18柱為色譜柱;流動相為乙腈-甲醇-水（11∶6∶83）;流速1.3 mL/min，波長360 nm;柱溫40 ℃;進樣量10 μL。系統適用性試驗中，供試品色譜中金絲桃苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于3.0，理論塔板數以金絲桃苷計不低于5000，結果見圖3。

2.4.3線性關系及線性范圍考察精密移取“2.4.1”項下對照品制備液（258.38 μg/mL）1 mL，加甲醇定容至5 mL，取定容液3 mL加甲醇定容至5 mL，依次反復操作得51.68、31.01、18.60、11.16、6.70、4.02 μg/mL的對照品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件檢測。以峰面積為縱坐標，各對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y2=63.82X-30.04（R=0.999 4）。結果表明，金絲桃苷在4.02～51.68 μg/mL間線性關系良好的。

2.4.4儀器精密度實驗取“2.4.1”項下對照品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件檢測，連續進樣6次，RSD值為0.78%，表明儀器精密良好。

2.4.5穩定性實驗取“2.4.1”項下的對照品溶液和供試品溶液，分別于0，4、8、12、16 h按“2.4.2”項下色譜條件檢測，結果表明，對照品溶液及供試品溶液在16 h內穩定性良好。

2.4.6重復性實驗取同一批樣品（批號180406）6份，按“2.4.2”項下制備供試品溶液。按“2.4.2”項下色譜條件檢測，金絲桃苷平均含量為9.74 μg/mL，RSD為1.84%，表明此方法重復性較好。

2.4.7準確度實驗精密移取同一批樣品9份（平均含量為9.74 μg/mL），每份5 mL，3份為1組，每組各精密加入0.15、0.2、0.25 mL對照品溶液（“2.4.1”項下中的儲備液，質量濃度為258.38 μg/mL），按“2.4.1”項下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件檢測，平均加樣回收率為100.14%，RSD為2.74%，表明準確度較好。結果見表2。

2.4.8樣品中金絲桃苷含量測定取3批樣品，每批平行取2份，按“2.4.1”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件檢測。結果顯示，金絲桃苷平均含量為9.95 μg/mL，RSD值為2.32%。結果見表3。

3討論

桔梗定性鑒別中，在三氯甲烷-乙醚（2∶1）及二氯甲烷-乙醚（1∶2）[15]的基礎上進行了展開劑種類的篩選和展開劑比例的優化，最終優選出三氯甲烷-乙醚（1∶1）最佳。魚腥草定性鑒別中，分別采用乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷[16]萃取樣品，蒸干，加甲醇溶解制成三種供試品，并以環己烷-乙酸乙酯（9∶1）、甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）為展開劑進行了鑒別，最終優選出采用乙醚萃取，甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）為展開劑。薄層鑒別的分析方法驗證中以《云南省中藥材（民族藥材）質量標準研究技術指導原則（試行）》為依據進行考察，15℃～35℃、50%～90%相對濕度、不同廠家的薄層板均對所建立的方法無明顯影響。

因洋艾素及金絲桃苷具有抗菌抑菌的作用，為臭靈丹和魚腥草中的有效成分，且在合劑存放至有效期后仍能測到較高的含量，故選二者為含量測定的指標性成分。因洋艾素為黃酮類成分，金絲桃苷為黃酮醇苷，試驗中對采用雙波長-HPLC法對二種成分同時進行測定進行了考察，以乙腈-0.2%醋酸（18∶82）、乙腈-2%甲酸（45∶55）、乙腈-0.1%磷酸（16∶84）、乙腈-甲醇-水（11∶6∶83）為流動相，并在此基礎上進行了流動相比例，柱溫的調整，均未能使兩種成分同時達到分離度的要求，使得方法學考察難以合格，故最終采用了兩種分析方法對兩種成分分別進行測定。洋艾素含量測定時，供試品制備過程中對超聲時間進行了考察（5，10，15 min），結果顯示，超聲10與15 min所測含量RSD至小于1.0%，5 min時含量明顯小于10 min，故確定超聲時間為10 min。含量下限擬定中，以平均含量的80%為下限，擬定本品含臭靈丹及魚腥草分別以洋艾素和金絲桃苷計，不得少于1.90和7.90 μg/mL。