地鱉蟲活性蛋白分離純化及藥理學進展

賈強 沈宏萍 仁德芳 曾海燕 袁紀元

摘要：地鱉蟲作為一種傳統的重要中藥材，在我國人工養殖發展迅速，從而地鱉蟲的來源豐富，價格便宜，從而廣泛的應用于中藥處方中。隨著時代的進步，其主要的活性成分纖溶蛋白質、脂多糖等，現已實現了分離純化。針對地鱉蟲的現代藥理學機制等研究越來越多，并且成為熱點。目前已有大量研究證實地鱉蟲活性蛋白具有抗腫瘤、抗氧化、抑制血管生成及抗凝血等作用，本文就地鱉蟲活性蛋白的分離純化及藥理活性研究進行簡單的概述，為地鱉蟲的應用前景進行提供參考。

關鍵字：地鱉蟲;活性蛋白;抗腫瘤、抗氧化、抑制血管生成

【中圖分類號】R-3 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）01-000-02

地鱉蟲Eupolyphage sinensisWalker，又名土元、土鱉，屬節肢動物門昆蟲綱蜚蠊日鱉蠊科動物，早在《神農本草經》及《金匱要略》等均對其有明確記載，該藥味咸，寒，具有逐瘀、破積、通絡、理傷等藥用功效，主治癥瘕（即腫塊、腫瘤）積聚、經閉、瘀血、腹痛、跌打損傷等癥[1-3]。其中的活性蛋白成分由于其具有溶解靜脈血栓，抗氧化衰老、抗腫瘤等藥用功效成為了學者們研究的熱點。

1. 地鱉活性蛋白的分離純化

韓雅莉等人[4]將新鮮地鱉經勻漿、鹽析和透析得到蛋白質粗提物通過DEAE-52離子交換纖維素層析分離后洗脫出現了3中蛋白峰，選擇第3組蛋白含量較高的峰，并通過DS-PAGE電泳檢測，其電泳圖譜顯示出單一蛋白帶，最終純化最終提取到了蛋白質的單一組分——纖溶活性蛋白（EFP）。EFP經測定其相對分子質量為41300，總含糖量為7.03%，經IR分析后確定EFP為一種糖蛋白。

王鳳霞等人[5]，通過硫酸銨沉淀、超濾、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF 及 Q-Sepharose HP 離子交換、Butyl Sepharose HP 疏水色譜以及 Superdex 75 凝膠過濾色譜法分離純化得到單鏈蛋白活性組分EPS72，其分子質量約為72 kD，對人肝癌Bel-7402 細胞、肺癌 A549 細胞、宮頸癌 Hela 細胞、結腸癌 RKO 細胞以及胰腺癌 Panc-28 細胞均有明顯的增殖抑制作用，提示該蛋白成分具有潛在的廣譜的抗癌活性。

王淑敏等人[6]，采用水提醇沉法提取地鱉蟲蛋白質粗液，將其通過CM-Sepharose FastFlow離子交換柱層析的方法得到3個組分，其中組分Ⅲ的纖溶活性最高，經透析、凍干后，呈淡黃色粉末，且易溶于水。

將組分III 經Sephadex G-50凝膠過濾柱層析，再得到3個組分Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。組分Ⅵ活性最高，經透析、凍干后，呈白色絮狀，易溶于水。經反相高效液相色譜柱層析，收集保留時間為17 min左右。

2. 地鱉活性蛋白的抗腫瘤作用

曹付春等人[7]，研究了EFP對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和人肺癌（A 549）、乳腺癌（MCF- 7）細胞分泌血管內皮細胞生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），發現EFP含藥血清對人臍靜脈內皮細胞、肺癌、乳腺癌細胞的VEGF和bFGF表達均有抑制作用，提示EFP可抑制腫瘤細胞VEGF和bFGF表達。而惡性腫瘤生長可分為無血管的緩慢生長階段與有血管的快速增殖階段，若無血管生成，則原發腫瘤的生長緩慢，從而提示EFP通過抑制血管內皮細胞增殖，減少有關促血管生長因子VEGF、bFGF等蛋白的表達，抑制腫瘤血管生成。

林澤飛等人[8]，將不同濃度 EFP 小鼠含藥血清，對 A549 細胞做了增殖抑制效果考察，采用 MTT 法、流式細胞術、Annexin V - FITC/PI 雙熒光染色法以及免疫組織化學法驗證 EFP 對A549 細胞做了增殖作用，發現隨著 EFP 劑量的增大，A549 細胞凋亡數增加，其中高濃度和中濃度的凋亡率接近;EFP 能夠延緩 G0 /G1 期向 S 期過渡，改變細胞的周期分布，使細胞阻滯于 G0 /G1 期，抑制 A549 細胞的增殖活性;EFP 含藥血清組的Bcl-2陽性率降低，Bax 陽性率升高，提示EFP 可增強肺癌 A549 細胞 bax 的表達，抑制 Bcl - 2 的表達，從而抑制其生長，其機制可能是通過下調 Bcl-2 蛋白表達和上調 Bax 蛋白表達，促進腫瘤細胞凋亡。

劉浩等人[9]建立了S180腹水瘤、實體瘤模型以及H22荷瘤腹水瘤、實體瘤模型。將S180腹水瘤小鼠、S180實體瘤小鼠、H22腹水瘤小鼠以及H22實體瘤小鼠分別40只，每個類別隨機分5組（8只/組），陽性對照組（注射環磷酰胺），陰性對照（注射生理鹽水），藥物高劑量組，中劑量組，低劑量組，將40只以及40只，分別隨機分5組（8只/組），陽性對照組。結果發現，在EFP濃度2.90mg·kg- 1對S180腹水瘤、2.18mg·kg- 1對H22肝癌和0.73～ 1.45mg·kg- 1對S180實體瘤的荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯抑制作用。在高濃度的EFP對小鼠的S180實體瘤抑瘤率與環磷酰胺相似，在低濃度EFP對H22實體瘤抑瘤率最高，且高濃度下小鼠脾重最大。提示，地鱉蛋白對S180和H22腫瘤細胞均具一定的抑制作用，且抑制效果和環磷酰胺類似。且EFP對S180等細胞無殺傷效果，說明EFP對S180、H22荷瘤小鼠存在顯著抑瘤作用，而無明顯的細胞毒作用。

3. 地鱉活性蛋白抗氧化衰老作用

谷崇高等人[10]，通過小鼠連續腹腔注射D-半乳糖 20 d，建立了小鼠衰老模型，對模型小鼠每日灌服 0、40、80、160 mg / kg地鱉多肽提取物，衰老組以及對照組小鼠每天灌服等量生理鹽水，觀察小鼠的正常活動、運動和耐應激能力。分別采用黃嘌呤氧化酶法、分光光度法檢測小鼠血液和不同組織中超氧化物歧化酶（ SOD） 、過氧化氫酶（ CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-PX） 活力，以及丙二醛（ MDA） 和還原型谷胱甘肽（ GSH）含量，免疫熒光法檢測細胞核轉錄因子 2（ Nrf2） 在 Caco-2 細胞的表達。結果顯示，與對照和多肽組比較，衰老組小鼠體重增重緩慢、組織臟器系數降低、運動時間縮短、抗應激能力降低、組織中抗氧化酶活力降低。多肽組小鼠體重增加明顯，肝臟、脾臟和腎臟指數增加顯著，小鼠靜力和動力運動時間明顯延長，并與地鱉多肽劑量的呈正比關系。與對照組比較，劑量組小鼠耐缺氧、耐高溫和運動時間延長并與之接近，血液和不同組織中的 SOD、CAT、GSH-PX 活力及 GSH 含量顯著提高，但MDA 含量降低，Caco-2 細胞核內 Nrf2 表達量明顯增加，接近陽性對照組。由此可知，地鱉多肽可能通過啟動 Nrf2-ARE 抗氧化信號通路，提高 D-半乳糖致衰老小鼠抗應激和抗氧化能力，從而延緩小鼠氧化衰老。

4. 結語：

綜上所述，地鱉活性蛋白具有良好的藥理活性，特別是在抗腫瘤方面，有較好的開發潛力。

參考文獻：

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[7] 曹付春，韓雅莉，陳冰，黃明星，丁鴻，余磊，葉韻.地鱉纖溶蛋白對人臍靜脈內皮細胞、肺癌、乳腺癌細胞VEGF和bFGF表達的影響[J].時珍國醫國藥，2011，22（08）：1827-1829.

[8] 林澤飛，韓雅莉，陳冰.地鱉纖溶活性蛋白含藥血清對人肺癌A549細胞凋亡及凋亡相關表達的影響[J].時珍國醫國藥，2013，24（04）：807-810.

[9] 劉浩，韓雅莉，丁鴻，黎子蔚.地鱉纖溶蛋白對荷S_（180）和H_（22）小鼠的抑瘤作用研究[J].時珍國醫國藥，2010，21（09）：2140-2142.

[10] 谷崇高，張永紅，白若雨，田美杰，沈紅.地鱉多肽提取物的抗氧化衰老機制[J].中國實驗動物學報，2014，22（06）：66-74.

通訊作者：

袁紀元（1992-），女，西南醫科大學碩士，研究方向為：新型藥物遞送系統設計與系統評價。

作者簡介：

賈強（1992-），男，西南醫科大學學士，研究方向為：新型藥物遞送系統設計與系統評價;

沈宏萍高級職稱 研究方向：藥物臨床試驗機構管理與臨床藥理

仁德芳（1991-），女，西南醫科大學碩士，研究方向為：新藥臨床。

曾海燕（1986-），女，碩士，研究方向為：流行病學。

基金項目：2018年度西南醫科大學校級基金資助項目 西南醫大校【2018】138號

西南醫科大學附屬中醫醫院 四川瀘州 646000