甲狀腺激素在無脊椎動物中的研究進展

董震宇，楊 槐，孫 揚，陳 宇，葉瑩瑩，祁鵬志，遲長鳳，郭寶英

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022）

1 甲狀腺激素

甲狀腺激素(TH)發(fā)揮著多種功能，包括調節(jié)新陳代謝、生理發(fā)育及神經系統調控等。在脊椎動物中，3,3',5,5'-四碘-DL-甲狀腺原氨酸(T4)由甲狀腺濾泡細胞所合成的甲狀腺球蛋白碘化酪氨酸而來。在脊椎動物中，T4 常被認為是3,5,3,-三碘甲狀腺原氨酸(T3)的前體。T3 由T4 經TH 轉運蛋白和甲狀腺素脫碘酶催化而來[1]。脫碘酶已被證明在鼠Muridae、文昌魚Epigonichthys cultellus、斑馬魚Brachydanio rerio、蜜蜂Apidae、海葵Actiniaria 和水蛭Whitmania pigra Whitman 中廣泛存在[2]，甲狀腺過氧化物酶已被證明在扁形動物、海鞘Pyrosomella verticilliata、文昌魚、軟體動物和棘皮動物中存在[3-6]。

在已研究的哺乳動物和脊椎動物中，T3 是甲狀腺激素核受體(THR)的主要配體，THR 與維甲類X 受體(RXR)形成二聚體[7-8]。值得注意的是，THR-RXR 異二聚體會與DNA 中的THR 反應元件(THR response element,TRE)結合，抑制轉錄蛋白和輔阻遏物的結合[9]。當T3 與THR-RXR 結合后，輔阻遏物被替換為一種輔激活蛋白并促進轉錄。并不是所有的THR 結合體都會與TRE 結合而促進轉錄，大多數基因都是由THR 進行調控的[10]。

除了通過THR 來實現基因組功能，TH 還具有非基因組功能[11]。與基因組功能相比，這些功能作用更為快速，會在幾秒鐘到幾分鐘內與細胞產生生理反應。例如DAVIS,et al[12]發(fā)現TH 對心臟和神經活動的調節(jié)中，幾乎所有細胞都會響應TH 的非基因組功能，所需時間僅幾秒鐘。

在已知TH 的非基因組功能中，存在著更多的細節(jié)，如結合的TH 主要為T4[13]。TH 與膜受體結合、與膜結合蛋白激酶結合以及與核外受體結合均會產生一定的生物學作用。心臟對TH 的快速反應來自2 種非基因組功能的共同作用，T3 與THR 結合后激活細胞質中的肌醇磷脂-3-激酶，T4 作用于膜受體和αVβ3 蛋白[14]。T4 與αVβ3 蛋白結合作用時幾乎能激活所有脊椎動物細胞的受體激活有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路，T4 與αVβ3 蛋白的相互作用已被驗證具有促進血管生成[15]，調節(jié)中樞神經系統中的鈉離子通道[16]，誘導成骨細胞的增殖等功能[17]。

TH 存在于古老的生物體內并進化至今，絕大多數動物體內都存在著TH 的作用機制[18]。早在上世紀末，EALES,et al[19]便發(fā)現大量無脊椎動物體內存在著對于TH 的應答機制，近年來，在更多的無脊椎生物中TH 的作用機制被人類發(fā)現，如海膽Echinoidea（棘皮類），海鞘（被囊類），文昌魚（頭索動物）等。

2 TH 在無脊椎動物中的作用

無脊椎動物包括脊索動物（如海鞘、文昌魚）、棘皮動物（如海膽、海星Asteroidea）、軟體動物（如長牡蠣Magallana gigas）和兩側不對稱動物（如海月水母Aurelia aurita）。大量研究表明，無脊椎動物中存在著TH的作用機制，而THR 則起源于脊索動物中（表1）。

表1 TH 在無脊椎動物中的作用Tab.1 The role of TH in invertebrates

2.1 脊索動物

在脊索動物中，關于TH 的研究主要集中于文昌魚上，早在上世紀研究初期，便有研究表明TH 存在于文昌魚中[20]。

文昌魚的內柱相當于脊椎動物的甲狀腺[21]，碘化發(fā)生在內柱上，過氧化物酶和甲硫咪唑會抑制其碘化[22]。文昌魚與脊椎動物具有較近的進化關系，通過內柱/甲狀腺合成TH 似乎是脊椎動物進化的選擇。在文昌魚中，THR 會結合3,5,3’-三碘甲腺乙酸(THRIAC)控制其變態(tài)發(fā)育[23]，THR 拮抗物NH3會與THR 結合抑制變態(tài)。

在文昌魚中，T3、T4 會被轉化成THRIAC，文昌魚本身也會合成THRIAC[6]。KLOOTWIJK,et al[24]提出THRIAC 可能是脊椎動物中TH 的起源，后來逐漸進化成為T3/T4，然而，在其他無脊椎生物中暫未發(fā)現THRIAC 的生理調節(jié)作用。文昌魚的TH 作用方式有部分與脊椎動物相似，其THR 為TH 所誘導，并且在無脊椎動物和脊椎動物中，TH 的下游信號系統有功能相近的部分[25]。文昌魚體內的TH 作用機制與脊椎動物的具有一定相似性，主要區(qū)別在于文昌魚中作為活性成分的是THRIAC 而不是TH。文昌魚TH 作用機制，既具有普遍存在于脊椎動物中的特征，同時也具有存在于無脊椎動物中的特征，如對THR 的誘導調節(jié)，TH 的非基因組功能，對變態(tài)發(fā)育的影響。

2.2 尾索動物

已有研究表明，屬于尾索動物的海鞘從幼體到成體均會在內柱合成T4[26]。但是海鞘體內并沒有甲狀腺球蛋白，這意味著內柱中有一種碘化蛋白能代替甲狀腺球蛋白進行TH 的合成[21]。海鞘中也具有與脊椎動物相近的甲狀腺過氧化物酶[3]和脫碘酶[27]。在棘皮動物、軟體動物和許多脊椎動物中，T4 具有加速變態(tài)發(fā)育的作用[28]，抑制TH 的合成會延緩或停止變態(tài)的過程，而通過補充外源性TH 則可以恢復其變態(tài)發(fā)育[29-30]。THR 尚未在海鞘中被發(fā)現，但是在虎舌紅Ardisia mamillata 中T3 會與核受體結合[31]，在玻璃海鞘Ciona intestinalis 中克隆到了THR 直系同源物[32]。

2.3 棘皮動物

棘皮動物包含海膽，海星，海百合Crinoidea 等，在進化關系上比被囊類（尾索類）和文昌魚距離脊椎動物更遠。其中TH，尤其是T4，發(fā)揮著加速變態(tài)發(fā)育的作用，在海膽、沙錢Echinarachnius parma 和海星中均有發(fā)現[33-35]，以上研究均未闡明其作用機制。

也有一些海膽自身無法合成TH，通過捕食的海藻等，利用外源性的TH 進行補充，部分可以自行合成TH，是否能自行合成TH 與海膽的品種有關系。雖然沒有確定合成TH 的特定組織，海膽體內也沒有內柱或甲狀腺球蛋白，但可以確定的是，海膽幼體中含有TH，含量在變態(tài)前達到峰值。另外，在沙錢中發(fā)現了延緩變態(tài)的TH 抑制物[36]。

T3 與T4 已被證明存在于海膽中，對于馬糞海膽Hemicentrotus pulcherrimus，T3 與T4 在幼體中可以檢測到，并且隨著幼體成長含量逐漸升高[37]。同時，海膽THR 已被克隆[38]，但是海膽THR 對T4、T3、rT3、TETHRAC 和THRIAC 均無反應[39]。

2.4 軟體動物

最近研究表明軟體動物具有TH 作用系統和THR，在海兔Ovula ovum、扇貝Pectinidae 和牡蠣ostrea gigas thunberg 中發(fā)現了TH 的存在[5,40-41]。

在原腸胚形成過程中，T3、T4 水平迅速升高，變態(tài)前T3 水平緩慢升高。在鮑魚Abalone 等腹足綱軟體動物中，T4 可以誘導殼的形成和發(fā)育速度。多溴聯苯醚會影響脊椎動物TH 的合成和轉運，也會降低菲律賓簾蛤Ruditapes philippinarum 的T3、T4 水平[42]。

近期有研究成果，在長牡蠣中克隆到了THR 序列，通過qRT-PCR 檢測發(fā)現，在TH 存在的情況下，THR 的合成進行負反饋調節(jié)，T3、T4 和THRIAC 不會導致THR 表達量上升。

TH 的功能在軟體動物中尚未得到明確的驗證。在WAHAB,et al[43]和CORNFORD,et al[44]的研究中，宿主體內的TH 水平會影響其體內寄生蟲的發(fā)育；在SAULE,et al[45]的研究中，當宿主的TH 水平降低時，其寄生蟲曼氏吸血蟲Schistosoma mansoni 發(fā)育正常。THR 已經在曼氏吸血蟲、肝吸蟲Clonorchis sinensis 中被克隆得到[46-47]。在曼氏吸血蟲中，THR 與RXR 結合；在肝吸蟲中，T3、T4 促使G6Pase mRNA 升高，抑制MDH mRNA，同時對新陳代謝具有調控作用。目前軟體動物中的TH 作用機制尚不明確，TH 會與THR 結合發(fā)揮生物學功能，也會與RXR 相結合。

2.5 兩側不對稱動物

至今為止還沒有在兩側不對稱動物中發(fā)現THR，海綿中含碘量約占其總重的10%，但是海綿中尚未發(fā)現碘化物。珊瑚蟲Coral 也會吸收碘進入其骨骼，約占其體重的25%，這些碘均以T4 形式存在，集中在其活體細胞與骨骼之間，柳珊瑚Sea whip Gorgonian 中T4 會促進鈣的沉積。使用T4 處理海月水母的幼蟲會使其耳石消失[48]，如果將海月水母暴露在碘或T4 中，會影響其無性生殖[49]。但是在FUCHS,et al[50]的研究中并沒有發(fā)現TH 影響海月水母無性生殖中的直接證據，并認為早期的研究結果只能證明存在一些間接性作用。在水螅的刺細胞和性腺中，含碘量很高[51]，但在刺胞動物中，尚未發(fā)現T3 的存在[52]。

在已研究的生物中，兩側不對稱動物體內缺乏THRs，但是卻對TH 有應答。在刺胞動物和海綿中含有碘的化合物和T4，推測可能參與骨骼、細胞的發(fā)育并發(fā)揮作用。

3 甲狀腺激素核受體

3.1 THRs 及其亞型

THRs 屬于核受體超家族，THRs 是作為配體結合DNA 的轉錄因子。THRs 不僅與DNA 結合，同時也會與RXR 構成二聚體，THR-RXR 二聚體可以控制基因轉錄[53]。以往認為，當THRs 缺乏配合基時轉錄會被抑制，配合基出現時則會與其結合并激活轉錄[54]。THRs 與配合基的結合會影響其與DNA 結合[55]。脊椎動物中THRs 有兩種亞型THRα 和THRβ，硬骨魚類中THRα 還有兩個亞型THRα-A 和THRα-B[56-57]。

細胞質和細胞核中存在THR，這一點是經過共聚焦顯微鏡和細胞成分分析驗證過的。TH 促進THR從細胞質到細胞核的穿梭，THRb1 異構體和其他蛋白質，例如MAPK，磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K) 的p85 調節(jié)亞基和核受體共激活復合物，均被發(fā)現于TH 處理的細胞質中，形成復合物可能有利于促進THR 進入細胞核，并啟動基因轉錄或細胞增殖。T3 也會導致THRa1 留在細胞核內[58]。

在發(fā)育研究中發(fā)現，THRα 在發(fā)育早期表達，THRβ 則在晚期表達[59]。兩棲動物中，THRβ 由T3 誘導，出現時間較晚，在變態(tài)發(fā)育時期表達[60]。非洲爪蟾Xenopus laevis THRα 在變態(tài)前期表達[61]。在牙鲆Paralichthys olivaceus 變態(tài)發(fā)育中，THRα-A 比THRα-B 和THRβ 前期表達量都高[62]。

在七鰓鰻Lampetra japonicum 中有兩種進化方式尚不明確的THRs，即THR1 和THR2。在其體內THR1與THR2 會像THRs 一樣將T3，T4 轉運并發(fā)揮作用[63]。七鰓鰻是已研究的脊椎動物中唯一在變態(tài)發(fā)育過程中THs 降低的物種，對其補充THs 可推遲其變態(tài)發(fā)育[64]，同時七鰓鰻中有2 種THRs 和3 種RXRs[65-66]。

脊椎動物中對THR 亞型的研究主要有對小鼠基因的敲除與對人類甲狀腺素綜合癥的研究（表2）。在小鼠中，敲除THRβ 基因會引起腦垂體促甲狀腺激素（TSH）分泌失調[67]，其中THRβ2 比其他THRβ 亞型對TSH 分泌影響更大[68]。THRα 對TSH 的調控作用是極其有限的，小鼠中THRβ2 會影響視網膜中視蛋白的表達，從而影響色覺[69]。兩種THRβ 都會影響人的耳蝸與聽力的發(fā)育，而當成年后，只需要THRβ1 來維護耳蝸的正常工作[68,70]。在肝臟中，THRβ1 是TH 參與膽固醇新陳代謝的首要介質，THRβ1 與THRβ2 都會參與白色與棕色脂肪的轉化[71-72]。在大腦中，兩種亞型都會影響TH 的功能，但是THRα1 對交感神經系統的功能有明顯影響[73]。類似的，THRα1 對骨骼、心臟、腸均有明顯的作用，而THRβ1 則在細胞中發(fā)揮的功能較多。在甲狀腺濾泡中，兩種亞型都會影響TH 的合成[74]。

表2 人類與小鼠中幾種THR 亞型的研究與功能Tab.2 Studies and functions of THR subtypes in vertebrates

3.2 THR 的調控機制

TRE 可以分為正面和負面兩類。配體結合的THR 通過陽性TRE 激活轉錄，并通過陰性TRE 抑制轉錄。與正調控的靶基因相反，當TH 缺失和降低時，負調控的基因轉錄活性可以被激活。THR 的DNA 結合結構域（DBD）在DNA 與陽性靶基因結合中起重要作用，但在T3 調控的陰性靶基因中不發(fā)揮重要作用[75]。與THRβ1 相互作用時，T3 總是從TRE 的中心或末端開始[76]。

除了核受體轉錄調控模式，THR 具有其他特征，例如，THR 主要與視黃酸X 受體(RXR) 形成異二聚體，二聚體與TRE 結合，THR-RXR 異二聚體主要作用于AGGTCA 的T3 反應元件，該元件是一個由4 個核苷酸分離的正向重復序列，即DR-4 激活轉錄。RXR 是異二聚體的活性成分，可以結合其配體，并通過各種新機制調節(jié)THR-RXR 的活性[77]。

1997 年，NCoR1 與SMRT 蛋白首次被確認并克隆到全長序列，這兩種蛋白的結構域C 區(qū)都具有THR結合位點[78-80]。NCoR1 和SMRT 蛋白都具有RIDs 結構能夠與THR 和其他核受體相互作用。RIDs 與LxxLL結構共用一個規(guī)則的螺旋區(qū)域，通過這個螺旋區(qū)域使游離的THR 在第12 個螺旋上與LBD 相結合。在此結構上，NCoR1 還可以與RXR-THR 二聚體或THR-THR 二聚體結合。NCoR1 在調節(jié)轉錄中具有重要作用，可與組蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)、G 蛋白通路抑制物2(GPS2)、TBL 相關蛋白(TBLR1,TBL1XR1)等結合發(fā)揮作用[81-83]。目前普遍認為與THR 結合是NCoR1 與SMRT 在TH 相關功能中發(fā)揮的主要作用。

同樣的，類固醇受體輔激活物(SRC)中的SRC1 在1995 年首次被確認，之后研究得到了其兩個亞型SRC2、SRC3，分析發(fā)現雖然其同源性很高，但是作用卻不一致[84-85]。SRCs 中包含著LxxLL 結構，其可以與THR 等核受體相互作用。YANG Zhihong,et al[86]研究發(fā)現SRC 可與THRβ2 氨基末端結合并在TH 相關功能中發(fā)揮重要作用。并且THRs 與SRC 的各種復合蛋白也會結合并發(fā)揮作用[87]。在SRC1 敲除的小鼠中出現了類固醇受體信號的缺陷，其THR 與TSH 不會因TH 處于高水平而負調節(jié)，但是敲除SRC2 卻不會影響HPT（下丘腦-垂體-甲狀腺）軸的功能[88]，說明SRC1 在THR、TSH、TH 的反饋調節(jié)上發(fā)揮著重要作用。

4 TH 信號通路

TH 在脊椎與無脊椎動物中，涉及諸多信號通路（表3）。

表3 TH 相關信號通路Tab.3 TH-related signaling pathway

TH 在無脊椎動物中的研究揭示了TH 合成與作用機制的進化。EALES,et al[19]在1997 年首先提出了動物最初是從食物中獲取TH 這種激素來調節(jié)各項生理活動，后來進化獲得了能自行合成TH 的能力。因為在海洋中各種海藻，海綿，珊瑚體內都存在著T4 形式的碘有機化合物。藻類中含有T3、T4 碘化物占總重的1%[18]。同時有些無法自行合成TH 的生物，卻會對TH 有反應。如以海藻為食的海膽體內就存在著大量的外源性TH，在幼體內就會有TH 存在，水平逐漸增長直至變態(tài)[35，89]。

在長牡蠣中盡管存在著THR，并且TH 會與THR 結合調控變態(tài)發(fā)育，但通過熒光素酶檢測法發(fā)現CgTHR 并不參與T3、T4 和THRIAC 調整轉錄活動，有推測是CgTHR 僅參與非基因組功能[44]。一種可能性是CgTHR 像脊椎動物一樣通過PI3K 的途徑參與非基因組作用，這可以解釋為何TH 是與CgTHR 結合后影響轉錄，而不是直接與目的DNA 和CgTHR 結合。

在脊椎動物中，TH 的轉運通過轉運蛋白和跨膜核受體，其信號傳遞在脊椎動物發(fā)育中起重要作用[89]。在無脊椎動物中，外源性TH 在行使非基因組作用時也需要轉運蛋白和核受體，這似乎是與脊椎動物共同進化而來。如刺細胞生物中含有多種能與T4 結合的整聯蛋白，包括脊椎動物中存在的RGD 結合域[15]，雖然刺細胞生物中沒有THR，但也能結合TH 并完成非基因組功能。

在對脊椎動物的研究中，HIROI,et al[89]發(fā)現，在血管內皮細胞，THR 會結合PI3K，最終激活一氧化氮合酶。在此過程中THR 沒有與RXR 形成異構體也沒有結合TRE。LIU Xin,et al[90]研究發(fā)現TH 通過整合素αVβ3-PKC-PKD-HDAC5 信號轉導通路促進堿性成纖維細胞成長因子(bFGF) mRNA 的表達，具有在表觀遺傳學層面發(fā)揮促血管新生作用的功能。整合素αVβ3 具有2 個TH 結合位點，能夠結合T3、T4，促進細胞質內的THRα1、THRβ1 穿梭到細胞核，在細胞核內通過轉錄水平的調節(jié)，影響某些基因如VEGF、bFGF的表達[91-92]。VEGF 通過PKC/PKD 依賴途徑介導Ⅱ類HDACs 中的HDAC7 磷酸化及出核，除此之外Ⅱ類中的HDAC4、HDAC5 亦可由VEGF 介導發(fā)生磷酸化及出核。bFGF 作為HDAC5 下游的靶基因，對血管形成起重要作用，細胞核內磷酸化HDAC5 降低，下游bFGF mRNA 表達增加，表明T4 通過整合素αVβ3-PKD-HDAC5 信號通路可以引起bFGF mRNA 的表達，從而在表觀遺傳學層面發(fā)揮促血管新生的作用。

鄺娟等[93]研究發(fā)現，在甲狀腺癌TPC-1 細胞中，沉默THRβ 后，p-Akt 及CCND1 蛋白水平有所下調，沉默THRβ 誘導PRMT2 后，p-Akt 及CCND1 蛋白水平進一步下調，同時PRMT2 的高表達會使THRβ 表達水平明顯下調。表明PRMT2 可能通過抑制THRβ 來抑制Akt-CCND1 信號通路，對TPC-1 細胞增殖產生影響。

HASHIMOTO,et al[94]發(fā)現，類固醇反應元件結合蛋白1c（steriod response element binding protein-1c,SREBP-1c）的啟動子區(qū)有TRE，SREBP-1c 激活一系列基因表達，包括脂肪酸合酶和乙酰輔酶A 羧化酶，調節(jié)肝臟脂質的合成。當THs 進入細胞質中與THRβ 結合，可促使THRβ1 與PI3K 解離，非結合的PI3K催化Akt 磷酸化，進而調節(jié)SREBP-1c 的表達。人類肝癌細胞株(HepG)中T3 誘導SREBP-1 的表達可被Akt 或ERK 抑制劑減弱[95]。識別細胞膜受體的瓊脂結合T3 可促進ERK 的活化，而非瓊脂結合的T3 并不能激活Akt，表明T3 可與膜表面受體整合素αvβ3 結合激活ERK[96]。因此，TH 調節(jié)SREBP-1 的表達通過兩條獨立的非經典途徑，一是T3 通過整合素αvβ3-MAPK-ERK 通路，二是通過THR-PI3K 復合物的解離激活PI3K-AKt 通路[97]。

根據已有研究，甲狀腺激素能夠通過整合素αVβ3 進入細胞質，發(fā)揮非基因組功能，激活：MAPKERK1/2 信號通路、PI3K 信號通路。THs 激活的ERK1/2 促進細胞質中STATs、THRβ、ERα 等蛋白質向細胞核的轉運。進入細胞核后，這些蛋白質被激活的ERK1/2 進一步磷酸化，或增強其功能，或改變其轉錄活性等。另外，活化的ERK1/2 可以調控細胞膜上Na+/H+交換的活性。MAPK 信號通路通過整合素αvβ3 被THs激活后，還可以誘導腫瘤細胞增殖和血管生成。PI3K 被THs 激活后，與細胞質中的THRβ 或THRα 結合，誘導下游一些特殊基因的表達，包括：ZAKI-4α、HIF-1α、GLUT-1 等。此外，被激活的PI3K 還可以激活細胞表面的Na+，K+-ATPase，并使其嵌入細胞膜中。

5 結語

在海洋無脊椎動物中存在著內源性甲狀腺激素或其他含碘化合物，并且對TH 刺激有各種應答行為，但在TH 的非基因組功能上的研究很少。THR 廣泛存在于各門無脊椎動物中，但相較于脊椎動物，其作用機制尚未明確。在信號通路的研究上，海洋無脊椎動物尚未有明確的研究成果。基于已有的研究，對比于脊椎動物我們可以推測，棘皮動物和軟體動物中具有尚未發(fā)現的膜受體或THR 的非基因組功能配體。在腔腸動物中，THR 的缺失和T4 對細胞發(fā)育和珊瑚骨骼的礦化也值得研究。在第三代高通量測序技術的輔助下，目前已取得了大量的數據，這為研究海洋無脊椎動物的信號通路提供了極大便利與支持。在此基礎上可以使用重組蛋白，免疫共沉淀和酵母雙雜交等技術具體分析甲狀腺激素的功能與信號通路成員。目前海洋無脊椎動物甲狀腺激素信號通路分子蛋白水平的研究尚未有成果被報道，相信可以通過借鑒已知的脊椎動物部分來進行對其通路下游進行更深入的研究，揭示其作用機理。