褪黑素對人牙周膜細胞成骨分化能力的影響

張夢涵，何智琪，鄧 輝，胡榮黨

牙周炎是牙周致病菌感染從而影響牙周組織的一組慢性炎癥性疾病。牙周炎涉及牙槽骨的進行性丟失，如果不加以治療，就會導致牙齒的松動和隨后的脫落[1-2]。目前，治療牙周炎的方法主要分為基礎治療與外科手術治療，其治療目的不僅僅是為了控制炎癥，更重要的是實現牙周組織的再生和新附著的形成[3]。

目前，實現牙周組織再生中的細胞和基因療法應用已引起人們的廣泛關注[4]。人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)是牙周膜中的功能細胞，被認為是重建牙槽骨、牙骨質和牙周膜的理想細胞類型[5]。hPDLCs能向成纖維細胞、成骨細胞等分化，并形成礦化組織，在牙周修復再生中起到關鍵作用。因此如何促進hPDLCs成骨分化是實現牙周組織再生的重點之一[6]。

褪黑素(melatonin)是由松果體和其他器官以晝夜節律模式合成并分泌的吲哚胺，具有多種生物學特性，在免疫、抗氧化、抗炎、防止外部細菌損傷與提高牙槽骨質量等方面發揮重要作用[7]。有文獻報道褪黑素可促進成骨細胞增殖和分化[8]，降低破骨細胞相關的骨吸收[9]，表明了其具有調節骨代謝的作用。相關臨床和體外研究也記錄了褪黑素對牙周炎的治療作用[10-11]。然而，有關褪黑素能否通過促進牙周骨質新生，從而在牙周再生中發揮作用，目前罕見報道。為此，本研究從細胞分子水平探討褪黑素對hPDLCs成骨分化能力的影響，為今后褪黑素在牙周再生中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；褪黑素、茜素紅S、MTT(Sigma，美國)；SYBR Green Ⅰ染料(Roche，美國)；反轉錄試劑盒(Takara，日本)；引物、Trizol試劑(Invitrogen，美國)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒(南京建成)；ALP染色試劑盒、BCA試劑盒、山羊抗小鼠二抗(上海碧云天)；Ⅰ型膠原(collagenase-Ⅰ，Col-Ⅰ)、Runx2蛋白多抗、β-actin單抗、兔抗山羊二抗(CST，美國)；OSX蛋白多抗(Abcam，美國)。

1.1.2 主要儀器 PCR擴增儀、化學發光儀、電泳轉膜儀(Bio-Rad，美國)；熒光定量PCR儀(Roche，美國)；酶標儀(TECAN，瑞士)。

1.2 實驗方法

1.2.1 hPDLCs的培養與鑒定 樣本選自本單位外科門診就診患者的阻生第三磨牙?；颊邽?8～30歲，口腔衛生良好，牙體無齲損，牙周組織無炎癥。牙拔除后立即用無菌PBS反復沖洗，超凈臺中提取根中1/3的牙周膜，修剪，消化液37 ℃消化30 min，離心(1 000 r/min)5 min，棄上清，轉移至含有培養液的T25培養瓶中。將培養瓶置于37 ℃、5% CO2的條件下培養24 h后，補加2 mL培養液。每3 d換液，7 d左右可見細胞自組織塊中爬出，待細胞長滿至80%后，消化傳代并記為第1代，相關蛋白染色鑒定其來源，取3～5代細胞用于實驗。本研究經本單位醫學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2.2 實驗分組 以DMSO將褪黑素配制成10 mmol/L母液，根據實驗要求將其稀釋。將hPDLCs接種至6孔板，密度為5×104個/mL。當細胞融合至70%～80%后，棄液，以1、10、50和100 μmol/L 的濃度設置4個實驗組，0.1% DMSO作為對照組。根據MTT結果決定后續實驗組的用藥濃度。

1.2.3 MTT法測定褪黑素對hPDLCs增殖的影響 于96孔板中接種hPDLCs，加入培養液100 μL/孔，24 h后棄液。以不同濃度的褪黑素分別培養1、3、5和7 d后，棄液，加MTT 20 μL/孔，37 ℃、5% CO2避光孵育4 h，加DMSO 150 μL/孔。震蕩溶解后，酶標儀測OD490值。以無細胞的單純培養液作為空白對照，設置3個復孔。

1.2.4 ALP染色 預實驗的結果顯示，與3 d和11 d相比，褪黑素孵育7 d后hPDLCs呈現較高的ALP表達。故選擇各組細胞在培養7 d后，換成骨誘導液培養，每3 d換液，連續誘導7 d后，根據說明書行染色后，鏡下拍照。

1.2.5 ALP活性測定 各組細胞培養7 d后，根據說明書操作，以各孔OD520值換算出ALP活性值，實驗重復3次，每組設3個復孔。

1.2.6 茜素紅S染色 各組細胞誘導至21 d時，棄液，PBS洗凈，加固定液于4 ℃固定30 min，行茜素紅S染色，鏡下觀察拍照后，加入氯化十六烷基吡啶溶液。震蕩溶解結節后，酶標儀測每孔OD560值，每組設3個復孔。

1.2.7 實時熒光定量PCR(Real-time PCR) 根據預實驗的結果，選擇將褪黑素孵育6 h及24 h后提取細胞樣本的RNA。應用Trizol試劑提取后，根據OD比值測定樣本純度。樣本純度合格后，根據RT-PCR試劑盒的說明書在冰上進行操作，PCR擴增儀中行逆轉錄，反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。引物序列如表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

使用熒光定量PCR儀進行檢測。設3個復孔，根據各基因Ct值，通過公式2-ΔΔCt，計算出各組mRNA的相對水平。重復3次，取平均值。

1.2.8 Western Blot 根據預實驗的結果，褪黑素孵育7 d后，細胞裂解液裂解細胞30 min并移至EP管內。使用試劑盒進行定量。將煮沸后的樣本通過電泳分離后，轉移至PVDF膜上，封閉劑封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜后，以對應的二抗室溫搖床孵育2 h，最后以ECL增強化學發光顯帶，按照試劑說明書進行曝光、拍照。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 hPDLCs原代培養及鑒定

原代培養1周后，鏡下可觀察到組織塊周圍有少量、稀疏的細胞爬出(圖1A)，2周后細胞密集生長，呈放射狀。傳代1 d后細胞生長旺盛，大多為長梭形(圖1B)。免疫組化染色可見波形蛋白染色呈陽性(圖1C)，角蛋白染色呈陰性(圖1D)，證實細胞來源自于中胚層。根據形態學結果并結合取材部位可確定是hPDLCs。

A：培養7d可見細胞爬出；B：傳代后細胞長梭形生長；C：抗波形蛋白染色呈陽性；D：抗角蛋白染色呈陰性

2.2 褪黑素對hPDLCs增殖的影響

不同濃度褪黑素作用于hPDLCs的MTT結果如圖2所示。褪黑素刺激1 d時，各組OD值無明顯差異。隨著時間延長，褪黑素組OD值較對照組明顯減少，表明hPDLCs的增殖活力受到抑制，且50 μmol/L與100 μmol/L較高濃度的褪黑素組抑制最為顯著(P<0.01)。所以，選擇1和10 μmol/L作為后續實驗組的濃度。

2.3 褪黑素對hPDLCs ALP染色和活性的影響

通過 ALP 染色和 ALP 活性來評價hPDLCs的早期成骨分化。與對照組相比，各褪黑素組ALP表達均有所上升。隨著褪黑素濃度的增加，ALP 染色逐漸加深(圖3A、B)；如圖3C所示，ALP的活性亦呈現相似的變化，10 μmol/L組上升最為明顯(P<0.01)。

與對照組相比，*：P<0.05，?：P<0.01

與對照組相比，*：P<0.05，?：P<0.01

2.4 褪黑素對hPDLCs礦化結節形成的影響

通過茜素紅S染色來評價hPDLCs的晚期成骨分化。染色結果顯示，隨著褪黑素濃度的增加，礦化結節的數量逐漸增多。肉眼可見褪黑素組染色加深(圖4A)，鏡下可見紅色礦化結節，結節中心黑紅色，四周云霧狀(圖4B)。圖4C定量分析結果同樣表明，加入褪黑素后，礦化結節數量呈濃度依賴性增多(P<0.01)。

2.5 褪黑素對hPDLCs 成骨mRNA和蛋白表達的影響

Real-time PCR和Western Blot結果發現，褪黑素處理可以上調hPDLCs表達成骨相關mRNA和蛋白的表達水平。如圖5A所示，1 μmol/L濃度的褪黑素處理6 h時，hPDLCs的Col-Ⅰ mRNA表達少許增高，但較對照組未見顯著差異(P>0.05)；進一步處理至24 h，1 μmol/L濃度的褪黑素組hPDLCs的Col-Ⅰ mRNA明顯升高，約為空白組的2倍(P<0.01)。10 μmol/L較高濃度的褪黑素6 h及24 h均略微抑制Col-I mRNA的表達(P<0.01)。如圖5B所示，褪黑素處理hPDLCs 6 h時，Runx2 mRNA的表達均高于對照組，且隨濃度增加而上升(P<0.01)。進一步處理至24 h時，褪黑素組Runx2 mRNA的表達量較對照組稍高，但無顯著差異(P>0.05)。如圖5C所示，褪黑素處理hPDLCs 6 h及24 h時，1 μmol/L濃度的褪黑素組hPDLCs的OSX mRNA表達均少許減少，但較對照組未見顯著差異(P>0.05)。褪黑素處理6 h時，10 μmol/L濃度的褪黑素組略微抑制hPDLCs的OSX mRNA表達(P<0.05)。隨著時間的延長，高濃度褪黑組抑制效果增加(P<0.01)。Western Blot結果表明，與對照組相比，褪黑素作用7 d后Col-Ⅰ、Runx2和OSX蛋白表達均有明顯上升，且1 μmol/L組表達水平達到最高(P<0.01)，見圖5D、E。

與對照組相比，*：P<0.05，?：P<0.01

與對照組相比，*：P<0.05，?：P<0.01

3 討 論

牙周炎是一類炎癥性疾病，以炎癥和牙槽骨吸收為特征[1]。雖然目前有各種手術和非手術治療方法，但全球牙周炎的患病率仍然非常高(40%～90%)[12]。傳統的治療方法對于控制牙周炎的進展有一定療效，但已被破壞的牙周組織卻難以恢復。因此，如何實現牙周組織尤其是牙槽骨的功能性再生一直是人們關注和研究的熱點，且已成為當前牙周再生治療、修復前和種植前外科手術研究的重要目標之一[13]。近年來牙周組織工程的發展為實現牙周組織再生的目標提供了新的思路[14]。其中，位于牙骨質和牙槽骨之間的hPDLCs因其干細胞特性，具有良好的增殖和分化能力，且能夠分泌調節結締組織和骨組織穩態的因子，在牙周再生中起著重要作用，被認為是牙周支持組織再生和修復的一種有前景的資源[15]。因此，如何促進hPDLCs骨向分化，誘導其分化形成新的牙周組織，是牙周再生治療的關鍵[5]。

褪黑素是一種由松果體、視網膜、骨髓、腸道和免疫系統等多種器官分泌的吲哚胺[7]。它是一種無毒的內源性化學介質，有研究表明其除了具有抗炎、抗菌、抗氧化和免疫增強作用外[16]，還能促進細胞增殖分化和骨重塑[11]，可能對延緩牙周病的發展有一定的作用。Balci等體內實驗研究表明，施用褪黑素可降低患有牙周炎的糖尿病大鼠的破骨細胞活性和牙槽骨喪失程度[17]。Roth等研究表明，在MC3T3-E1成骨細胞系中，褪黑素能夠促進成骨細胞分化以及礦化[18]。Arabac等研究表明，褪黑素治療可顯著抑制局部牙槽骨吸收，并有助于牙周組織的愈合[10]。Kim等發現褪黑素可以通過下調NF-κB途徑抑制破骨細胞分化少。但褪黑素對牙周膜細胞骨向分化的影響尚罕見報道[19]。

因此，我們研究了褪黑素對體外原代培養hPDLCs成骨分化的影響。本實驗培養出hPDLCs，并證實其中胚層來源。MTT結果顯示，褪黑素濃度對細胞增殖活力的影響較大。其中，50 μmol/L與100 μmol/L高濃度的褪黑素對hPDLCs具有一定的抑制作用。

ALP是成骨細胞分化早期出現的一種關鍵酶，能促進骨基質的礦化，可促進骨形成與礦化[20]。本研究發現，不同濃度的褪黑素作用于hPDLCs 7 d均可促進細胞ALP活性與表達，且10 μmol/L高濃度褪黑素組上升程度明顯高于1 μmol/L低濃度褪黑素組。該結果表明高濃度褪黑素可促進hPDLCs的早期成骨分化。

進一步采用茜素紅S染色檢測褪黑素對hPDLCs礦化結節的影響。hPDLCs在含有地塞米松、抗壞血酸及維生素C等成分的成骨誘導液培養基內生長21 d，能向成骨細胞轉化并產生獨特的礦化結節，其在茜素紅S染液的作用下呈紅色。實驗組在褪黑素作用后，茜素紅S染色可見大量紅色礦化結節，表明褪黑素能明顯促進礦化結節的形成。

最后，采用實時熒光定量PCR和Western Blot檢測Col-Ⅰ、Runx2以及OSX的mRNA和蛋白表達水平。Col-Ⅰ是成骨細胞分泌的骨蛋白之一，在成骨細胞的分化、骨組織的修復重建以及維持骨強度方面發揮重要作用[20]。Runx2是一種特異的轉錄因子，可誘導部分前體細胞分化為成骨細胞，進而調控成骨細胞的成熟[21]。OSX在骨組織形成和重建的初始調控中起著重要的作用[22]。因此將3種蛋白作為檢測成骨分化情況的指標。本實驗檢測了不同時間點不同濃度的褪黑素對hPDLCs Col-I、Runx2和OSX的mRNA以及蛋白表達水平影響。

熒光定量PCR結果顯示，褪黑素可促進成骨相關mRNA的表達，但在不同濃度、不同的時間點所起的作用有所差別。1 μmol/L的褪黑素作用hPDLCs 6 h時，實驗組與對照組的Col-Ⅰ mRNA表達無明顯差異，這可能是由于Col-Ⅰ位于Runx2信號途徑的下游，其表達受Runx2的調控，褪黑素作用6 h還不足以引起它們表達水平的明顯增加。隨著作用時間延長，Col-Ⅰ mRNA表達量逐漸升高且高于對照組。而較高濃度的褪黑素則會抑制Col-Ⅰ mRNA的表達，這與馬勇等研究發現褪黑素濃度越高，越能抑制肝星狀細胞Col-Ⅰ mRNA表達的結果[23]一致。Runx2 mRNA的熒光定量PCR結果表明，在褪黑素作用hPDLCs 6 h時其表達可明顯上升，24 h時與對照組無顯著差異，這可能是因為Runx2是促進成骨的早期轉錄因子，它在成骨分化的早期表達較高[24-25]。10 μmol/L的褪黑素作用6 h及24 h時，OSX mRNA表達均顯著減少，這可能是時間點的選擇以及高濃度的褪黑素抑制OSX mRNA的表達的結果。

Western Blot結果發現，褪黑素作用于hPDLCs 7 d后上述成骨相關蛋白的表達明顯上升，尤其是在1 μmol/L的褪黑素作用下上升最為明顯。Western Blot結果與熒光定量PCR結果不完全一致的原因，可能是因為檢測的時間點不同。

綜上所述，褪黑素可上調hPDLCs的ALP活性和表達，促進其礦化結節的形成以及相關成骨mRNA和蛋白的表達，具有一定的促進牙周成骨作用，可能是促進牙周炎牙槽骨形成和重建的一種有前景的治療策略。褪黑素促進成骨的具體機制及其效應還需進一步闡明。