谷物植物化學物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選及其分子機制

石嘉懌，張 冉，梁富強,，程玉鑫，張 太

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023；2.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

谷物尤其是全谷物及其制品因含有多種植物化學物，包括多酚類物質、膳食纖維、維生素、礦物質等，具有多種健康效應，已經成為健康膳食的重要組成部分。國際糖尿病聯盟的最新數據顯示，目前我國的糖尿病患者人數高達1.164億，居世界首位，預計到2045年可達1.472億[1]，其中90%～95%為II型糖尿病患者，糖尿病已經成為了嚴重威脅人們健康的慢性疾病之一。α-葡萄糖苷酶是調控餐后血糖的關鍵酶之一。阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖是目前常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑，然而它們的使用對機體胃腸道具有嚴重的副作用[2]。因此，從全谷物植物化學物中篩選發(fā)現無毒副作用的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑是控制餐后血糖、預防糖尿病的一個重要途徑。

大量研究表明，增加全谷物食物的攝入能夠降低包括II型糖尿病在內的多種人類慢性疾病的發(fā)生風險[3]。研究認為這與其富含黃酮類、酚酸、烷基間苯二酚、生物堿、植物淄醇等多種植物化學物密切相關[4]。近年來，越來越多的研究顯示富含谷物植物化學物的提取物或化合物單體表現出α-葡萄糖苷酶抑制活性[5-6]，說明谷物是日常膳食中天然安全抑制劑的重要來源。并且與其他來源不同，谷物中植物化學物多以結合態(tài)存在，經膳食能夠在腸道中酵解后大量釋放[7]。Parizad等的研究認為有色谷物提取物抑制小鼠腸道α-葡萄糖苷酶的活性可能是由于提取物中酚類物質的協同效應[8]。因此，可以推斷膳食中的谷物植物化學物更利于α-葡萄糖苷酶的抑制從而更好地使其發(fā)揮抑制活性。作為控制餐后血糖關鍵靶點之一，α-葡萄糖苷酶是一種主要存在于人小腸絨毛黏膜細胞刷狀緣的酶類。然而，目前大多數研究均是以酵母源α-葡萄糖苷酶為靶點。因此，以人源α-葡萄糖苷酶為靶點，從谷物植物化學物中篩選天然α-葡萄糖苷酶抑制劑，對控制餐后血糖水平從而預防II型糖尿病具有重要意義。

本實驗構建了谷物植物化學物小分子數據庫，以人源α-葡萄糖苷酶（PDB ID：5NN8）[9]為靶點，采用分子對接的方法并結合ADME和Lipinski性質從中篩選潛在的人源α-葡萄糖苷酶抑制劑；通過體外酶活力比較目標化合物的抑制活性，并采用分子動力學模擬結合獨立梯度模型（independent gradient model，IGM）分析，探究導致其活性差異的分子機制，以期為全谷物食物中天然、高效、無毒副作用人源α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選和發(fā)現提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡荊素和異牡荊素（純度＞95%）上海源葉生物科技有限公司；酵母菌（S. cerevisiae）來源的α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）（活力≥100 U/mg）美國Sigma公司；對硝基苯基-α-D-葡萄糖吡喃苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）（純度98%）、芹菜素（純度≥98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-25 pH計上海精密科學儀器有限公司；SpectraMax M2e多功能酶標儀美國Molecular Devices公司；SHA-C水浴振蕩器常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 谷物植物化學物數據庫的建立

通過檢索PubMed和Web of Science中的相關文獻以及Phenol-Explorer數據庫（http://phenol-explorer.eu/），最終確定265 種主要來源于谷物的植物化學物。從PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載或利用Chemdraw軟件繪制植物化學物的2D結構，保存為.sdf格式。

1.3.2 受體和配體的準備

將所有的小分子化合物導入MOE軟件轉換為3D結構，利用軟件的Energy minimize模塊進行能量最小化（能量收斂標準為0.004 kJ/mol），導入到.mdb數據庫中，構建用于篩選的配體數據庫。

從蛋白質數據庫（RCSB protein data bank，RCSB PDB）（https://www.rcsb.org/）下載目的蛋白人源α-葡萄糖苷酶-阿卡波糖復合物的3D晶體結構（PDB ID：5NN8，2.45 ?）。在MOE分子對接軟件中對α-葡萄糖苷酶依次進行刪除水分子、質子化、加氫及能量最小化等處理。

1.3.3 基于ADME和Lipinski性質的篩選

將小分子化合物化學結構轉換為SMILES格式，通過SwissADME（http://www.swissadme.ch/）在線預測平臺獲得化合物的ADME和Lipinski性質。將P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）底物均設置為No，Lipinski性質為Yes（0和1），以此為標準進行第一輪篩選。

1.3.4 基于分子對接的篩選

MOE軟件用于分子對接篩選。為檢驗分子對接方法的可靠性和準確性，首先將蛋白配體復合物（PDB ID：5NN8）中原有的配體分子阿卡波糖從晶體結構中提取出來，然后重新對接到α-葡萄糖苷酶受體中，對比重新對接前后配體構象的差異，以均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）小于2 ?為標準。對接參數設置：Placement method：triangle matcher；Scoring function：London dG；Refinement：induced fit；Refinement score：GBVI/WSA dG。

1.3.5α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

采用pNPG法測定酵母源α-葡萄糖苷酶抑制活性[10]，略有改動。牡荊素、異牡荊素和芹菜素3 種黃酮類化合物母液（溶于二甲亞砜）用0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至不同濃度，96 孔板上測定抑制活性。設置樣品組（25 μL樣品溶液+25 μL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶）、對照組（25 μL PBS+25 μL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶）、背景組（25 μL樣品溶液+25 μL PBS）、空白組（50 μL PBS）。37 ℃下孵育15 min后，每孔加入50 μL pNPG底物（0.5 mmol/L），繼續(xù)孵育。15 min后每孔加入100 μL 0.5 mol/L的Na2CO3終止反應，使用多功能酶標儀在405 nm波長處測定吸光度。按照下式計算抑制率，并計算半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）。

1.3.6 同源模建和分子對接

同源模建獲得酵母源α-葡萄糖苷酶的3D結構。從UniprotKB數據庫（https://www.uniprot.org/uniprot/P 5 3 3 4 1）下載酵母源α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列（P53341），上傳至Swiss Model（https://swissmodel.expasy.org/）預測平臺，以3AXH為模板同源建模獲得α-葡萄糖苷酶的3D結構。以獲得的α-葡萄糖苷酶3D結構為受體，分子對接過程的具體參數設置同1.3.4節(jié)，分析芹菜素、牡荊素和異牡荊素與酵母源α-葡萄糖苷酶的相互作用模式。

1.3.7 分子動力學模擬

選擇1.3.6節(jié)中分子對接的復合物構象，采用Gromacs 2019.5軟件包進行分子動力學模擬。使用PRODRG2 Server（http://prodrg1.dyndns.org/submit.html）構建配體（牡荊素、異牡荊素和芹菜素）的拓撲結構文件，利用pdb2gmx模塊構建α-葡萄糖苷酶-配體復合物的結構文件，采用Gromacs53a6力場，使用SPC水模型。動力學模擬的盒子設置為十二面體，加入鈉離子維持體系的電中性。首先采用最陡梯度法對模擬體系進行能量最小化，其次分別進行100 ps的熱浴和壓浴系綜模擬，使體系達到平衡狀態(tài)（310 K、1 bar）。穩(wěn)定后進行20 ns的位置非限制性分子動力學模擬，時間步長設置為2 fs，分析結果。

1.3.8 獨立梯度模型分析

Multiwfn程序中的IGM分析是研究受體和配體間弱相互作用、使其可視化的一種新的方法[11]。因此，根據1.3.7節(jié)中分子動力學模擬結果，提取配體-受體復合物的穩(wěn)定構象，采用Multiwfn 3.7軟件包分析牡荊素、異牡荊素和芹菜素與α-葡萄糖苷酶之間的弱相互作用，利用VMD 1.9.3軟件進行可視化分析。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS Statistics軟件進行數據統(tǒng)計和單因素方差分析，P＜0.05表示顯著差異，采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 基于ADME和Lipinski性質的篩選結果

膳食植物化學物的吸收、分布、代謝、排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）性質是影響其發(fā)揮生物活性的重要因素。腸道細胞中高表達的CYP450生物轉化作用和P-gp的主動外排作用是決定膳食植物化學物ADME性質的重要因素[12]。因此，首先以SwissADME軟件中CYP450及P-gp作為界定參數提高篩選的可靠性。此外，具有潛力的植物化學物應該具備良好的類藥性[13]。因此，選擇Lipinski 5 項原則作為谷物植物化學物數據庫進一步篩選的標準。據此，從265 種中篩選出了6 類、76 種非CYP450和P-gp底物，具有較好的腸道吸收特性且具有良好Lipinski性質（圖1白色區(qū)域）的植物化學物，包括20 種黃酮類、35 種酚酸類、5 種燕麥蒽酰胺類、8 種苯并噁唑嗪酮類、6 種植物甾醇、2 種其他化合物。

圖 1 基于ADME和Lipinski性質的篩選Fig. 1 Screening of α-glucosidase inhibitors based on ADME and Lipinski properties

2.2 基于分子對接的篩選結果

對接結果顯示對接后的配體分子與原配體分子的RMSD為0.51 ?，小于2 ?，且能夠較好地重現晶體結構中原配體和受體的結合構象（圖2A），表明參數設置合理，可以用于構建數據庫中植物化學物的進一步篩選。

對接結果中的打分值S負值越大，提示配體和受體結合的能力越強，這些化合物可能具有更強的抑制潛力[14]。第一輪篩選出的6 類植物化學物對接打分的平均值見圖2B，打分較好的分別是植物甾醇和黃酮類化合物兩類。由圖2C可知，分析阿卡波糖與人源α-葡萄糖苷酶的相互作用模式可知，氨基酸殘基Asp282、Asp616、Asp518、Asp404、Arg600、His674、Met519、Phe649、Trp613、Leu405、Trp516、Trp376、Leu650、Trp481、IIe441、Trp618在兩者的結合中具有重要作用[15]。因此，根據分子對接打分的S值，并分析相互作用模式，從76 種植物化學物中篩選出了10 種具有潛力的人源α-葡萄糖苷酶抑制劑（谷物植物化學物），它們均能以合理的構象進入到活性口袋中（圖2D），并與關鍵氨基酸殘基相互作用（表1）。史永恒等研究了何首烏中2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-β-D-葡萄糖苷的降血糖的靶點[16]，結果表明其與5NN8表現出良好的結合能力，并具有體外的抑制作用，是潛在的降血糖先導化合物。Jiang Mingzhu等的研究表明，兩種大豆三肽與5NN8具有良好的結合能力，富含這兩種肽的酶解物在小鼠體內表現出顯著的降血糖效果[17]。因此，上述谷物植物化學物在機體中的抑制活性和降血糖效應值得深入研究。

2.3 牡荊素、異牡荊素和芹菜素的酵母源α-葡萄糖苷酶抑制活性和作用機制

分子對接顯示牡荊素和異牡荊素作為兩種碳苷黃酮類的同分異構體，均能與人源α-葡萄糖苷酶中的關鍵氨基酸位點結合，具有較好的結合能力。由于目前體外酶活性抑制主要采用的是酵母源α-葡萄糖苷酶，因此，研究也采用pNPG法考察上述兩種化合物的體外酶抑制活性，結果如圖3A、B所示。牡荊素和異牡荊素均具有一定的體外抑制活性，呈現劑量效應，IC50分別為117 μmol/L和164 μmol/L，與前人的研究結果[18-19]相近，表明抑制能力為牡荊素＞異牡荊素，與分子對接打分一致。作為芹菜素苷元的兩種碳苷類衍生物，Choi等的研究發(fā)現糖基取代增強了對II型糖尿病靶點PTP1B的抑制活性[20]，提示碳苷黃酮類物質更具預防糖尿病的潛力。因此，進一步評價芹菜素的α-葡萄糖苷酶抑制能力，結果見圖3C，IC50為16 μmol/L，與前人的研究結果[21]接近。上述結果表明三者抑制酵母源α-葡萄糖苷酶的能力為芹菜素＞牡荊素＞異牡荊素。然而，2.2節(jié)中芹菜素的分子對接打分為-5.202 7，提示芹菜素的抑制能力可能小于牡荊素和異牡荊素，因此，牡荊素、異牡荊素和芹菜素活性差異的分子機制值得進一步研究。

圖 3 牡荊素、異牡荊素和芹菜素α-葡萄糖苷酶的抑制活性和相互作用分析Fig. 3 Inhibitory activity and interaction mechanism of vitexin,isovitexin and apigenin against α-glucosidase

體外酶活性抑制實驗采用的是酵母源α-葡萄糖苷酶，然而目前其三維結構尚未解析，因此采用同源模建的方法建立了其三維結構。研究表明，Asp214、Asp349、Glu276、Asp408、Arg312和Thr215等是酵母源α-葡萄糖苷酶催化底物pNPG的關鍵氨基酸殘基[22]。圖3D～F顯示3 種黃酮類化合物均能與這些關鍵活性位點結合，然而，其分子對接打分S值反映的抑制潛力從強到弱為芹菜素＞牡荊素＞異牡荊素，不能很好地解釋3 種黃酮物質的活性差異。這也提示在天然膳食活性成分的篩選中，分子對接作為一種輔助手段，其結果仍需要進一步結合驗證[23]。根據糖基連接方式不同，黃酮苷類化合物可以分為碳苷和氧苷兩大類，芹菜素苷元形成的碳苷黃酮是谷物中分布最廣泛的一類[24]。近年來黃酮類化合物的抑制活性及分子機制的研究主要集中于氧苷和苷元，對于碳苷黃酮及其與苷元活性差異的分子機制研究較少。Li Yanqin等的研究表明異槲皮苷（IC50＝185 μmol/L）和蘆丁（IC50＝196 μmol/L）的抑制活性明顯低于其苷元槲皮素（IC50＝17 μmol/L）[25]。Chen Jiguang等的研究也發(fā)現飛燕草素抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為5.291 μmol/L，而氧苷飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素-3-蕓香糖苷在2 mmol/L時仍未顯示抑制活性[26]。這些均提示僅根據分子對接及其結合模式分析不能很好地解釋導致上述3 種黃酮類物質抑制α-葡萄糖苷酶活性差異的分子機制，因此，需要進一步結合其他的理論和方法。

2.4 分子動力學模擬

RMSD指模擬過程中蛋白質構象與原始構象之間的平均偏差，是判斷模擬過程中體系是否穩(wěn)定的重要依據；回旋半徑（radius of gyration，Rg）表示蛋白質在分子動力學過程中的體積和構象變化，其越小表示蛋白的致密性越大[27]。α-葡萄糖苷酶及其與牡荊素、異牡荊素和芹菜素復合物20 ns模擬的RMSD結果如圖4A所示，可以看出在9 ns后4 種體系RMSD的變化趨于穩(wěn)定（0.28 nm左右），說明模擬體系達到平衡狀態(tài)。由圖4B可以看出在模擬9 ns后4 種體系的Rg達到平衡狀態(tài)，3 種復合物體系的Rg大于α-葡萄糖苷酶Rg，表明3 種黃酮物質與之形成復合物使α-葡萄糖苷酶在模擬過程中體積膨脹。不同模擬階段的復合物構象疊合結果見圖4C，在20 ns模擬過程中牡荊素、異牡荊素和芹菜素均能以合理的構象存在于α-葡萄糖苷酶的活性口袋中。上述結果進一步表明，牡荊素、異牡荊素和芹菜素不僅均能與其活性中心的關鍵氨基酸殘基相互作用，且能以合理構象穩(wěn)定存在于α-葡萄糖苷酶活性口袋中，并形成穩(wěn)定的受體-配體復合物，因此可以表現出體外抑制活性。

將分子動力學結果中的運動軌跡文件導入VMD軟件中進一步分析三者在α-葡萄糖苷酶活性口袋中的運動軌跡，結果如圖4D～F所示。運動軌跡顯示與牡荊素和異牡荊素相比，芹菜素能夠在靠近活性中心位置穩(wěn)定運動，且運動范圍明顯不同于牡荊素和異牡荊素。根據在活性口袋中的運動軌跡可以推測，與牡荊素和異牡荊素相比，芹菜素可能由于在α-葡萄糖苷酶活性口袋中心位置的運動更為穩(wěn)定，利于阻止底物pNPG進入口袋中與關鍵氨基酸殘基的結合，從而發(fā)揮更強的抑制活性。MTH1蛋白是癌癥治療的重要靶點，Wang Mian等通過分子動力學證實由于立體位阻效應的存在導致蛋白的3 種抑制劑在結合口袋中的運動軌跡不同，認為這是決定三者活性差異的重要因素[28]。作為芹菜素的衍生物，C6和C8位的糖苷取代使牡荊素和異牡荊素的分子體積增大[19]。因此，可以推斷兩者在與α-葡萄糖苷酶相互作用形成配體-受體復合物的過程中可能存在更大的空間立體位阻效應，導致其在活性口袋中運動軌跡及范圍不同于它們的苷元芹菜素，從而導致抑制活性的差異。

圖 4 分子動力學模擬結果和芹菜素、牡荊素、異牡荊素在活性口袋中的運動軌跡Fig. 4 Results of molecular dynamic simulation and movement trajectory of vitexin, isovitexin and apigenin in the active pocket

2.5 IGM分析弱相互作用

為了進一步分析比較3 種黃酮化合物與α-葡萄糖苷酶相互作用的位阻效應，采用Multiwfn程序包分析了配體和受體分子間的弱相互作用，結果如圖5所示。圖5A～C中紅色點表示分子間相互作用，其中負向區(qū)域（sign（λ2）ρ＝-0.02）存在峰提示氫鍵相互作用，正向區(qū)域（sign（λ2）ρ＝0.02）存在峰提示立體位阻效應。圖5D～F分別為牡荊素、異牡荊素和芹菜素的等值面圖，可以看出牡荊素和異牡荊素中由于糖苷取代增大了二者在相互作用過程中立體位阻效應。楊梅素和二氫楊梅素是兩種結構中僅有C2—C3雙鍵差別的黃酮類物質，He Jianlin等的研究表明兩者與α-葡萄糖苷酶的分子對接打分非常接近，然而抑制活性差異卻很大（IC50分別為2.09 μg/mL和85.95 μg/mL），進一步的IGM分析表明，與位阻效應相比，氫鍵是導致二者活性差異的主要原因[29]。根據IGM分析結果可以推斷，牡荊素、異牡荊素與芹菜素相比由于存在更強的立體位阻效應導致其在相互作用過程中運動軌跡不同，可能是導致兩種碳苷黃酮物質與其苷元芹菜素活性差異的結構基礎。

圖 5 α-葡萄糖苷酶和芹菜素、牡荊素及異牡荊素的弱相互作用和等值面分析Fig. 5 Weak interaction and isosurface analysis between α-glucosidase and apigenin, vitexin or isovitexin

3 結 論

本實驗結合植物化學物的ADME和Lipinski性質，基于分子對接的篩選方法，從常見的谷物植物化學物中篩選了一些具有潛力的人源性α-葡萄糖苷酶抑制劑。酵母來源的體外酶活性抑制結果表明，3 種黃酮類化合物——牡荊素、異牡荊素和芹菜素具有一定的抑制能力，然而其抑制能力排序與其分子對接打分結果不完全一致。分子動力學模擬和IGM分析表明，由于糖苷取代導致的立體位阻效應可能是導致兩種碳苷黃酮與其苷元芹菜素活性差異的分子結構基礎。研究表明分子對接輔助有助于從膳食植物化學物中高通量快速篩選天然、無毒副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑。然而，研究中的酶活抑制活性評價仍然采用的是酵母源α-葡萄糖苷酶。因此，這些具有潛力的谷物植物化學物在機體中抑制人源α-葡萄糖苷酶的能力及降血糖效應仍有待進一步研究。