榆干離褶傘溶栓酶對脂多糖誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用

耿 超，衛 瑩，沈明花

（延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002）

榆干離褶傘屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬，又名大榆蘑。研究報道，榆干離褶傘發酵液具有抗氧化[1]、溶栓、降血脂[2]、保護血管內皮細胞[3]等作用。本實驗室前期研究表明，榆干離褶傘菌絲體中分離純化的溶栓酶[4]（Lyophyllum ulmariumfibrinolytic enzyme，LUFE）具有抑制血小板的活化[5]、保護氧化應激損傷的血管內皮細胞[6-7]等生物活性。但到目前為止，LUFE對炎癥的影響及作用機制的研究報道甚少。

血管內皮細胞作為血管內膜的結構成分，直接與循環血液接觸，是血管壁與血液之間的天然屏障。血管內皮細胞具有多種功能，能夠保持機體局部內環境的穩態，具有抗炎、抗血小板聚集、抗栓、抗凝促纖溶等多種功能[8-9]。血管內皮細胞是一類分泌細胞，通過釋放多種血管生物活性物質，影響血管結構和功能，調節血管的張力[10]。在物理、化學、生物因素等誘因的作用下，當血管內皮細胞的完整性遭到破壞時繼發諸多疾病，如血管內皮細胞的炎性損傷是血栓栓塞性疾病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的病理基礎[11-12]。因此，保護血管內皮細胞免受炎性損傷在預防或治療心血管疾病過程中具有重要的意義。本實驗以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為誘導劑，建立血管內皮細胞炎性損傷模型，旨在探討LUFE對血管內皮細胞炎性損傷的保護作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LUFE由延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室純化獲得[4]；人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）、人急性單核細胞白血病細胞系（human acute monocytic leukemia cell line-1，THP-1）購自上海佛雷堡生物科技發展有限公司。

LPS、噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）、β-actin抗體、羊抗鼠免疫球蛋白（immunoglobulin G，IgG）-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、羊抗兔IgG-HRP美國Sigma公司；髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗體、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65抗體、phospho-NF-κB抗體、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/κ2絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抗體、phospho-ERK1/2 MAPK抗體、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗體、p38 MAPK抗體、p-p38 MAPK抗體美國Cell Signaling公司；JNK抗體美國Abcam公司；核纖層蛋白B抗體 博士德生物生物工程有限公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）多克隆抗體美國Thermo Fisher公司；別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）標記的鼠抗人CD54（細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1）抗體、APC標記的同型對照IgG美國BD公司；Hoechst 33342染料北京索萊寶生物科技有限公司；白介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、E-選擇素、單核細胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）試劑盒上海研謹科技有限公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀、細胞成像微孔板檢測系統美國Bio-Tek公司；凝膠成像分析儀美國UVP公司；流式細胞分析儀美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

HUVEC和THP-1分別培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM和含10%胎牛血清的1640培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3.2 MTT法檢測LPS對HUVEC存活率的影響

將HUVEC接種到96 孔板，分為空白對照組和LPS組。空白對照組加無血清DMEM培養液，LPS組分為7 個組，向DMEM培養液中加入LPS，使其終質量濃度分別為0.01、0.1、1、10、100、200、400 μg/mL，每組設8 個復孔，作用24 h。每孔加入20 μL的MTT，4 h后棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩300 s，靜置30 s，測定492 nm波長處的OD值，按式（1）計算細胞存活率。

1.3.3 細胞上清液LDH活力測定

細胞分組及處理同1.3.2節。LPS作用24 h后，收集各組細胞上清液，按酶聯免疫吸附測試（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書檢測LDH活力。經不同質量濃度LPS作用后，檢測其細胞上清液LDH活力，以確定后續實驗中LPS的作用質量濃度。

1.3.4 MTT法檢測LUFE對HUVEC存活率的影響

將HUVEC接種到96 孔板，分為空白對照組和LUFE組。空白對照組加無血清DMEM培養液，LUFE組分為7 個組，向DMEM培養液中加入LPS，使其終質量濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL，每組設8 個復孔，作用24 h。每孔加入20 μL的MTT，4 h后棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩300 s，靜置30 s，測定492 nm波長處的OD值，按式（2）計算細胞存活率。

1.3.5 MTT法檢測LUFE預處理對LPS作用后HUVEC存活率的影響

取對數生長期的細胞，以1×104個/mL的密度接種于96 孔板中，分為空白對照組、模型組和LUFE低（1 μg/mL）、中（4 μg/mL）、高（16 μg/mL）劑量組。經不同劑量的LUFE干預24 h后，除空白對照組外，其余各組均加入LPS，使其終質量濃度為1 μg/mL，作用24 h。同1.3.2節方法檢測492 nm波長處的OD值，按式（3）計算細胞存活率。

1.3.6 細胞上清液LDH、IL-6、TNF-α、E-選擇素和MCP-1水平測定

細胞分組同1.3.4節。收集各組細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測相應指標水平。

1.3.7 Hoechst染色觀察THP-1與HUVEC的黏附作用

將HUVEC以6×104個/mL的密度接種于6 孔板，細胞分組同1.3.4節。將常規培養的THP-1用Hoechst 33342染料進行活細胞核染色15 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗去多余染料，用無血清培養基重懸。將重懸的THP-1以5×105個/mL密度加入各組HUVEC中，共培養6 h，PBS洗去未黏附的THP-1。用細胞成像微孔板檢測系統觀察與HUVEC發生黏附的THP-1，用ImageJ圖像處理軟件計算各組相對黏附數量。

1.3.8 流式細胞儀檢測HUVEC的ICAM-1表達水平

HUVEC分組同1.3.4節。常規消化、離心，各組用PBS重懸細胞，調整細胞濃度為1×107個/mL。每組各取100 μL細胞懸液放入EP管中，加入APC標記的CD54（ICAM-1）抗體2 μL，同型對照組加入APC標記的IgG抗體2 μL，避光孵育20 min，加入PBS 1 mL，以300×g離心5 min，棄除上清液。每組再加入500 μL PBS，重懸細胞，用流式細胞儀測定ICAM-1的表達水平。

1.3.9 蛋白免疫印跡法檢測HUVEC的TLR4、MyD88、TAK1、MAPK（p38和JNK）及細胞核NF-κB蛋白表達水平

細胞分組同1.3.4節。分別收集各組細胞，加入裂解液，在冰浴上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。取上清液（細胞全蛋白）作為檢測TLR4、MyD88、轉化生長因子β激活激酶1（transforming growth factor β activated kinase 1，TAK1）、MAPK（p38和JNK）的蛋白樣品。用核蛋白抽提試劑提取核蛋白，用于檢測NF-κB表達水平。

將上述兩種蛋白樣品分別進行定量。取30 μg蛋白樣品分別進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至聚偏氟乙烯膜上。將轉膜后的聚偏氟乙烯膜放在質量分數為5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h后分別加入相應的一抗，在4 ℃孵育過夜。經洗滌、二抗室溫孵育2 h，用凝膠成像儀進行分析。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 LPS對HUVEC存活率及LDH活力的影響

如圖1A所示，與空白對照組比較，LPS在0～400 μg/mL質量濃度范圍內對H U V E C 的存活率無顯著影響（P＞0.05）。但其質量濃度在1～400 μg/mL時，極顯著提高細胞上清液LDH水平（P＜0.01）（圖1B），表明當LPS質量濃度大于1 μg/mL時對細胞起損傷作用。因此，在后續實驗中選擇1 μg/mL作為建立HUVEC損傷模型的LPS質量濃度。

圖 1 LPS對HUVEC存活率及細胞上清液LDH活力的影響Fig. 1 Effect of LPS on the survival rate and LDH activity of HUVEC

2.2 LUFE對HUVEC存活率的影響

圖 2 LUFE對HUVEC存活率的影響Fig. 2 Effect of LUFE on survival rate in HUVEC

如圖2所示，與空白對照組比較，LUFE組對HUVEC存活率無顯著變化，說明LUFE在0～32 μg/mL質量濃度范圍內對細胞無毒性作用。

2.3 LUFE對LPS刺激后HUVEC存活率及LDH活力的影響

圖 3 LUFE對LPS刺激后HUVEC存活率及LDH活力的影響Fig. 3 Effect of LUFE on survival rate and LDH levels in HUVEC induced by LPS

如圖3所示，與空白對照組相比，模型組的細胞存活率無顯著變化，但LDH活力明顯升高，表明1 μg/mL LPS雖不影響細胞存活率，但對細胞具有損傷作用。經不同劑量的LUFE預處理后，極顯著降低細胞上清液LDH活力，這就說明LUFE對損傷細胞有保護作用。

2.4 LUFE對炎癥因子質量濃度的影響

表 1 LUFE對LPS刺激后細胞上清液TNF-α和IL-6質量濃度的影響Table 1 Effect of LUFE on the levels of TNF-αand IL-6 in HUVEC induced by LPS

如表1所示，與空白對照組比較，模型組細胞上清液TNF-α、IL-6水平極顯著升高（P＜0.01），說明LPS作用后引起細胞的炎性損傷。與模型組比較，LUFE各劑量組TNF-α、IL-6水平極顯著降低（P＜0.01），提示LUFE具有一定的抗炎作用。

2.5 LUFE對MCP-1和E-選擇素質量濃度的影響

表 2 LUFE對LPS刺激后細胞上清液MCP-1和E-選擇素質量濃度的影響Table 2 Effect of LUFE on the levels of MCP-1 and E-selectin in HUVEC induced by LPS

如表2所示，與空白對照組比較，模型組MCP-1和E-選擇素水平極顯著升高（P＜0.01），而與模型組比較，中、高劑量LUFE組MCP-1和E-選擇素水平極顯著降低（P＜0.01），提示LUFE抑制LPS所致的趨化因子及黏附分子水平的升高。

2.6 LUFE對THP-1與HUVEC黏附作用的影響

圖 4 LUFE對THP-1與HUVEC黏附的影響（200×）Fig. 4 Effect of LUFE on the adhesion of THP-1 to HUVEC (200 ×)

如圖4所示，與空白對照組比較，模型組THP-1與HUVEC的相對黏附數量極顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，經LUFE干預后THP-1與HUVEC的相對黏附數量極顯著降低（P＜0.01），說明LUFE能夠抑制這兩種細胞之間的黏附作用。

2.7 LUFE對細胞ICAM-1表達水平的影響

圖 5 LUFE對HUVEC的ICAM-1表達水平的影響Fig. 5 Effect of LUFE on the expression level of ICAM-1 in HUVEC induced by LPS

如圖5所示，空白對照組ICAM-1表達量平均值為83.6，模型組平均值為137.8，與空白對照組相比，模型組ICAM-1表達水平升高64.8%。LUFE低、中、高劑量組的ICAM-1表達量平均值分別為124.2、110.6和98.4。與模型組比較，LUFE低、中、高劑量組的ICAM-1表達水平分別降低9.9%、19.7%和28.6%，說明LUFE能降低HUVEC的ICAM-1表達水平。

2.8 LUFE對HUVEC的TLR4信號通路相關蛋白表達的影響

圖 6 LUFE對HUVEC的TLR4、MyD88、TAK1蛋白表達水平的影響Fig. 6 Effect of LUFE on the expression of TLR4, MyD88 and TAK1in HUVEC

如圖6A、C所示，與空白對照組比較，模型組TLR4和p-TAK1/TAK1水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，LUFE干預后其水平極顯著降低（P＜0.01）。如圖6B所示，與空白對照組比較，模型組MyD88水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，經LUFE干預后顯著逆轉這些蛋白的表達水平，提示LUFE能夠下調LPS誘導的TLR4信號通路相關蛋白的表達水平。

2.9 LUFE對HUVEC的MAPK通路相關蛋白表達的影響

圖 7 LUFE對HUVEC的JNK和p38蛋白表達的影響Fig. 7 Effect of LUFE on the expression of JNK and p38 in HUVEC

如圖7所示，與空白對照組比較，模型組JNK、p38蛋白的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，LUFE各劑量組JNK、p38蛋白磷酸化水平極顯著降低（P＜0.01）。

2.10 LUFE對HUVEC細胞核NF-кB蛋白表達的影響

圖 8 LUFE對HUVEC細胞核NF-κB蛋白表達的影響Fig. 8 Effect of LUFE on the expression of NF-κB in HUVEC

如圖8所示，與空白對照組比較，模型組細胞核NF-κB（p65）磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，LUFE各劑量組p-p65水平極顯著降低（P＜0.01），說明LUFE可能抑制p65的激活或p-p65的核移位過程。

3 討 論

LPS作為革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分，常被應用于細胞炎癥模型的研究[13-15]。LPS通過細胞相關的信號傳導通路，表達并產生大量促炎因子[16-18]、黏附分子[19-20]及趨化因子[21]，引起細胞的炎性損傷。本實驗以LPS作為誘導劑，建立HUVEC炎性損傷模型，觀察了LUFE對血管內皮細胞炎癥反應的影響。

內皮細胞作為脈管系統的重要組成部分，在炎癥及單核細胞的黏附和滾動過程中起重要的調節作用[22]。炎癥部位的血管內皮細胞不僅是炎癥反應的參與者，也是炎癥反應的調節者。本實驗結果表明，經LPS刺激后，血管內皮細胞受損，導致模型組TNF-α和IL-6等促炎因子水平升高，同時E-選擇素和MCP-1等細胞黏附分子及趨化因子水平也升高，提示LPS在本實驗劑量范圍內雖不影響細胞存活率，但引起細胞的炎性損傷，產生大量黏附分子及趨化因子，而這些因子又進一步激活血管內皮細胞，促進炎癥反應。流式檢測結果表明，模型組的ICAM-1表達水平高于空白對照組，這與LPS和LPS所致高水平的TNF-α等炎癥因子作用下發生的內皮細胞的激活有關。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族中的成員，介導白細胞與血管內皮細胞的黏附，并在多種心血管疾病過程中起重要作用[23]。血管內皮細胞中高表達的ICAM-1促進白細胞激活，引起血管內皮細胞和單核細胞的黏附。熒光微孔板檢測結果表明，模型組中HUVEC和THP-1的黏附數量明顯高于空白對照組（P＜0.01），這與血管內皮細胞高表達的ICAM-1和E-選擇素以及MCP-1水平有關。LUFE預處理能夠顯著抑制由LPS誘發的TNF-α、IL-6、E-選擇素、MCP-1和ICAM-1水平的升高，并降低THP-1和HUVEC的黏附作用，提示LUFE具有一定的抗炎作用。前期研究結果表明，LUFE在LPS誘導的大鼠炎性肝損傷模型中通過降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，減輕肝臟的炎性損傷[24]，從而保護肝組織，進一步證實了LUFE的抗炎作用。

TLR4是識別LPS的關鍵受體，參與LPS介導的炎癥信號轉導，調節炎癥因子的表達[25-26]。LPS在CD14的協助下激活并結合細胞表面的TLR4，啟動TLR4信號傳導通路[27]，影響其下游的MyD88、TAK1等信號分子[28]，激活MAPK、NF-κB等信號通路促進炎癥因子的表達[29-30]。為了闡明LUFE的抗炎機制，觀察LUFE對TLR4/MyD88/TAK1/MAPK信號通路相關蛋白和NF-κB的表達和活化水平。結果表明，模型組的TLR4、其下游分子MyD88和TAK1的磷酸化水平明顯高于空白對照組。TAK1的磷酸化進一步激活MAPK家族（ERK、p38和JNK）和NF-κB信號通路，通過其下游的激活蛋白-1家族轉錄因子和核轉錄因子（p-NF-κB），促進炎癥相關基因的表達[31-32]。因此，在本實驗中經LPS刺激后p-p38、p-JNK和細胞核p-NF-κB（p65）水平顯著升高，促進炎癥相關因子的表達，導致血管內皮細胞TNF-α、IL-6、E-選擇素、MCP-1和ICAM-1水平的升高。與模型組相比，經LUFE干預后TLR4和MyD88表達量減少，其下游分子TAK1、p38、JNK蛋白的磷酸化水平下降，細胞核p-NF-κB（p65）水平降低，提示LUFF可能通過TLR4分子，抑制其下游信號分子（MyD88、TAK1、p38、JNK和NF-κB）的激活，減少炎癥相關因子的表達，即通過抗炎作用保護血管內皮細胞。

綜上所述，LUFE可能通過下調TLR4/MyD88/TAK1/NF-κB信號通路及MAPK通路，減輕LPS誘導的血管內皮細胞的炎性損傷，從而保護血管內皮細胞。